CN110964675B - 一株Sphingobacterium hotanense在防治寄生线虫病上的应用 - Google Patents

一株Sphingobacterium hotanense在防治寄生线虫病上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株Sphingobacterium hotanense在防治寄生线虫病上的应用。本发明提供的Sphingobacterium hotanense AMCC 101218，保藏编号为CGMCC No.19217；该菌可有效地防治黄瓜根结线虫病，其卵囊数、根结数、虫口密度相比于空白对照分别下降了71.28％、75.86％和63.80％；AMCC101218基因组大小为4490254bp，GC含量为41.21％。

Description

一株Sphingobacterium hotanense在防治寄生线虫病上的 应用
技术领域
本发明涉及一株Sphingobacterium hotanense及其在防治植物寄生线虫病上的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
随着设施栽培的推广，作物种类单一，种植地域化，农业复种指数较高等问题，造成了农业可持续发展一大难题----连作障碍。连作障碍是指在正常栽培管理措施下，同一地块连续种植相同作物，造成产量降低、品质变劣、病虫害发生频繁等现象。连作障碍通常会引起土壤理化性状变差、酚类化合物大量积累、土壤养分分布不均、土壤次生盐渍化、土壤酶活性改变等问题，除此之外，连作障碍还会引起土壤微生物种群发生改变，病原物大量积累，加重作物的病虫害，植物寄生线虫病是其中危害较大的病害。
应用化学农药是防治根结线虫病的主要手段，但是目前所用的有机硫类、卤代烃类、硫代异硫氰酸甲酯类和有机磷类杀线剂，毒性较高且对线虫的毒杀作用非特异，会对其他非靶标生物造成危害，这些高毒化学农药在使用过程中也极易威胁人畜的安全。随着人们环保意识的增强，部分高毒农药已被明令禁止使用。
近年来，利用生防细菌及其代谢产物来防治植物病害成为国内外在生物防治研究中的一个热点。但是相比于生防真菌，生防细菌的菌种选育、生产工艺和工业化生产研究则相对滞后，导致以生防细菌为代表的生防制剂应用十分有限。
鞘氨醇杆菌是一类广泛存在于自然界中的不产生芽孢的革兰氏阴性细菌，其中多种鞘氨醇杆菌被发现具有降解特性，包括石油、五氯酚等，然而，关于鞘氨醇杆菌防治植物寄生线虫病却鲜有报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株Sphingobacterium hotanense可应用于黄瓜根结线虫病的生物防治。
一株Sphingobacterium hotanense AMCC 101218，简称AMCC 101218菌株，从根际土壤中分离得到，已于2019年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19217。
AMCC101218菌株的主要生物学特性为：菌落形状呈圆形，边缘不整齐，不透明，菌落颜色为黄色，革兰氏染色为阴性。
所述菌株Sphingobacterium hotanense AMCC 101218，从根际土壤中分离得到，简称AMCC 101218。
一种AMCC 101218微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将超低温冻存的Sphingobacterium hotanense划线接种于LB固体培养基平板上，于34-37℃培养21-26h。
(2)种子液制备：将活化好的AMCC101218接种于装有LB液体培养基中，于34-37℃，170-220rpm培养16-22h。
(3)种子液扩大培养：将步骤(2)中的种子液以5-8％的接种量接种到种子液扩大培养基中，所述的扩大培养基为LB液体培养基，于34-37℃，170-220rpm培养8-12h。
(4)发酵培养：将步骤(3)中扩大培养的种子液以5-8％的接种量接种到BPY发酵培养基，34-37℃培养40-48h，得到AMCC101218液体菌剂；
所述BPY发酵培养基，每升包括如下组分：牛肉膏4.5-5.5g，蛋白胨9.0-11.0g，酵母膏 4.5-5.5g，葡萄糖4-6g，NaCl 4.5-5.5g，余量水，pH6.5-7.3。
根据本发明优选的，所述步骤(1)接种后LB固体培养基平板，于37℃培养24h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)接种后的LB液体培养基于37℃，180rpm培养18h。
根据本发明优选的，所述步骤(3)接种后的种子液扩大培养基，于37℃，200rpm，培养8h。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中发酵培养于37℃，200rpm培养48h。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中的BPY发酵培养基，每升包括如下组分：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl 5.0g，余量水，pH 7.0。
一种液体微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有AMCC101218菌株，菌体浓度为 1.0×107～2.5×108CFU/mL。
上述Sphingobacterium hotanense AMCC101218菌株在防治由一种或多种线虫引起的病害中的应用。
根据本发明优选的，所述线虫为：南方根结线虫、象耳豆根结线虫、松材线虫之一或两种以上的组合。
上述Sphingobacterium hotanense AMCC101218菌剂在防治由一种或多种线虫引起的病害中的应用。
根据本发明优选的，所述线虫为：南方根结线虫、象耳豆根结线虫、松材线虫之一或两种以上的组合。
所述AMCC101218菌株对多种植物寄生线虫具有明显的杀伤效果，其发酵上清液12h对南方根结线虫二龄幼虫致死率为84.43％，对南方根结线虫卵孵化抑制率可达89.15％；对象耳豆根结线虫二龄幼虫致死率为85.21％，对象耳豆根结线虫卵孵化抑制率可达80.28％；对松材线虫幼虫致死率为86.17％。
本发明的有益效果
1、本发明涉及的AMCC101218菌株对多种植物寄生线虫具有明显的杀伤效果，其发酵上清液12h对南方根结线虫二龄幼虫致死率为84.43％，对南方根结线虫卵孵化抑制率可达 89.15％；对象耳豆根结线虫二龄幼虫致死率为85.21％，对南方根结线虫卵孵化抑制率可达 80.28％；对松材线虫幼虫致死率为86.17％。
2、本发明涉及的AMCC101218菌株盆栽实验中，该菌能够显著抑制根结线虫，其卵囊数、根结数、虫口密度相比于空白对照分别下降了71.28％、75.86％和63.80％。
附图说明
图1AMCC101218系统发育树
图2AMCC101218的全基因组图谱
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述，但保护范围不限于此。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
食树脂新鞘氨醇菌Novosphingobium subarcticum AMCC 100102购自山东农业微生物菌种资源保藏与利用中心。
实施例1
AMCC101218菌株的分离、鉴定及保藏
(1)AMCC101218菌株的分离筛选过程
从植物根际土壤中筛选出一株杀虫菌株，编号为AMCC101218。
(2)AMCC101218菌株的鉴定
①AMCC101218菌株的主要生物学特性：菌落形状呈圆形，边缘不整齐，不透明，菌落颜色为黄色，革兰氏染色为阴性。
②AMCC101218菌株主要的生理生化特性采用BIOLOG 96微孔板测定，AMCC101218生理生化特性结果见表1：
表1
Figure BDA0002353820200000041
③AMCC101218菌株分子生物学特性
AMCC101218菌株分子生物学鉴定试验方法参照NY/T 1736-2009中“6.5”执行；采用 MEGA6.0建树，结果见图1，结合上述BIOLOG生理生化实验见表1，以及AMCC101218菌株主要生物学特性，确定AMCC101218菌株为Sphingobacterium hotanense，已于2019年12月 17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19217。
④AMCC101218全基因组测序
将斜面保存的AMCC101218转接活化后接种于BPY液体培养基中，200rpm，37℃摇床培养16h后取10mL菌液12000rpm，4℃离心5min，弃去上清后得到大量的AMCC101218菌体，将菌体置于液氮冻存10min后，提取细菌基因组，利用PacBio RS II方法测定全基因组序列，所述序列在NCBI的登录号为CP030848；结果表明，AMCC101218基因组大小为4490254bp， GC含量为41.21％。
实施例2
AMCC101218菌株杀线虫能力测定
用接种环挑取斜面保存的AMCC101218菌株划线于LB(酵母膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，琼脂1.6％，pH7.0，121℃，20min高压灭菌)平板上活化；将活化好的菌种接种于BPY培养液中，37℃，200rpm摇床培养48h后，12000rpm离心10min，收集上清液。
所述BPY发酵培养基，每升包括如下组分：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl 5.0g，余量水，pH 7.0。
杀南方根结线虫/象耳豆根结线虫实验：
将挑取的南方根结线虫/象耳豆根结线虫卵囊洗净，放在0.5％的次氯酸钠溶液中消毒 3min、用无菌水反复冲洗3次，挑取卵囊置于贝曼漏斗孵化，每隔2d收集二龄幼虫。采用 24孔板液体浸渍法进行抗线虫活性的测定。在24孔板中分别加入100μL南方根结线虫/象耳豆根结线虫二龄幼虫悬液(约200条)、100μL发酵上清液和300μL无菌水，用移液器轻轻吹打混匀，每个样品重复3次，以空白培养基代替发酵液作为阴性对照，28℃放置12h统计线虫死亡率。
卵孵化抑制实验：将挑取的南方根结线虫/象耳豆根结线虫卵囊洗净，放在0.5％的次氯酸钠溶液中消毒3min、用无菌水反复冲洗3次后用镊子碾开收集虫卵。采用24孔板液体浸渍法进行卵孵化抑制性测定；在24孔板中分别加入100μL卵悬液(约200粒)、100μL发酵上清液和300μL无菌水，用移液器轻轻吹打混匀，每个样品重复3次，以空白培养基代替发酵液作为阴性对照，28℃放置12h统计孵化率。
杀松材线虫实验：将表面消毒的松材线虫接种于长满灰葡萄孢的PDA平板上，28℃培养10d后用无菌水将松材线虫冲洗下来，调节浓度至2000条/mL。采用24孔板液体浸渍法进行抗线虫活性的测定；在24孔板中分别加入100μL松材线虫二龄幼虫悬液(约200条)、100μL 发酵上清液和300μL无菌水，用移液器轻轻吹打混匀，每个样品重复3次，以空白培养基代替发酵液作为阴性对照，28℃放置12h统计线虫死亡率。
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100
卵孵化抑制率(％)＝(对照孵化率-处理孵化率)/(1-处理孵化率)×100
结果表明：该菌对多种植物寄生线虫具有明显的杀伤效果，其发酵上清液12h对南方根结线虫二龄幼虫致死率为84.43％，对南方根结线虫卵孵化抑制率可达89.15％；对象耳豆根结线虫二龄幼虫致死率为85.21％，对南方根结线虫卵孵化抑制率可达80.28％；对松材线虫幼虫致死率为86.17％。
实施例3
AMCC101218菌剂的制备
(1)菌种活化：将AMCC101218菌株划线接种于LB固体培养基平板上，于37℃培养24h。
(2)种子液制备：将活化好的AMCC101218接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡器中37℃，180rpm振荡培养18h。
(3)种子液扩大培养：将步骤(2)中的种子液以8％的接种量接种到种子罐液体培养基中，扩大培养基为LB液体培养基，于37℃，200rpm培养8h。
(4)发酵培养：将步骤(3)中扩大培养的种子液以8％的接种量接种到BPY发酵培养基，于37℃，200rpm培养48h，得到AMCC101218液体菌剂，活菌数1.7×108CFU/mL，灌装至1L带盖塑料瓶。
所述BPY发酵培养基，每升包括如下组分：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖5.0g，NaCl 5.0g，余量水，pH 7.0。
对比例
与实施例2的不同之处在于，将实施例中AMCC101218菌种更换为食树脂新鞘氨醇菌 Novosphingobium subarcticum AMCC 100102。
结果表明，食树脂新鞘氨醇菌Novosphingobium subarcticum AMCC 100102对三种线虫均无杀伤效果，对虫卵孵化也无抑制效果。
效果例
AMCC101218菌剂盆栽实验
实验共3个处理，包括如下：
(1)CK：80mLBPY培养基；
(2)T1：80mL市售阿维菌素2000倍稀释液；
(3)T2：80mL AMCC101218(实施例3制备的)液体菌剂。
盆栽所用土壤含有根结线虫，其虫口密度为15条/g，采集自患病黄瓜温室大棚中，所用黄瓜品种为线虫易感品种津春四号，所用花盆大小为10cm×10cm，加入上述土壤量为800g/ 盆；上述菌剂、阿维菌素及BPY培养基均采用提前灌根施入的方式使用，每个处理6个平行，处理3天后，移栽健壮的长有四片真叶的黄瓜苗，并于光照培养箱内培养，培养条件为光照，光照强度66％，12h，26℃，黑暗12h，20℃。期间正常浇水，不再施入其他药剂，30天后，将植株根部土壤清理干净，并将分离土壤留样检测，统计根结数、卵囊数、虫口密度等指标。
应用Excel软件进行数据的整理，采用SPSS 17.0进行数据分析，样品与对照组之间用单因素方差分析中的邓肯氏新复极差(Duncan’s)检验对试验数据进行统计分析。
盆栽实验结果如表2所示：AMCC101218菌剂可有效地防治黄瓜根结线虫病，其卵囊数、根结数、虫口密度相比于空白对照分别下降了71.28％、75.86％和63.80％。
表2
Figure BDA0002353820200000071
注：NG，根结数；NEM，卵囊数；JD，虫口密度。

Claims (12)

1.一株Sphingobacterium hotanense AMCC 101218，于2019年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 19217。
2.权利要求1所述Sphingobacterium hotanense AMCC 101218微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化：将超低温冻存的Sphingobacterium hotanense划线接种于LB固体培养基平板上，于34-37℃培养21-26h；
（2）种子液制备：将活化好的AMCC 101218接种于装有LB液体培养基中，于34-37℃，170-220rpm培养16-22h；
（3）种子液扩大培养：将步骤（2）中的种子液以5-8％的接种量接种到种子液扩大培养基中，所述的扩大培养基为LB液体培养基，于34-37℃，170-220rpm培养8-12h；
（4）发酵培养：将步骤（3）中扩大培养的种子液以5-8％的接种量接种到BPY发酵培养基，34-37℃培养40-48h，得到AMCC101218液体菌剂；
所述BPY发酵培养基，每升包括如下组分：牛肉膏 4.5-5.5g，蛋白胨 9.0-11.0g，酵母膏4.5-5.5g，葡萄糖 4-6g，NaCl 4.5-5.5 g，余量水， pH6.5- 7.3。
3.如权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）接种后LB固体培养基平板，于37℃培养24h。
4.如权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）接种后的LB液体培养基于37℃，180rpm培养18h。
5.如权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）接种后的种子液扩大培养基，于37℃，200rpm，培养8h。
6.如权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中发酵培养于37℃，200rpm培养48h。
7.如权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中的BPY发酵培养基，每升包括如下组分：牛肉膏 5.0g，蛋白胨 10.0g，酵母膏 5.0g，葡萄糖 5.0g，NaCl5.0 g，余量水， pH 7.0。
8.一种液体微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的Sphingobacterium hotanense AMCC 101218菌株，菌体浓度为1.0×107-2.5×108CFU/mL。
9.权利要求1所述Sphingobacterium hotanenseAMCC101218菌株在防治由一种或多种线虫引起的植物病害中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述线虫为：南方根结线虫、象耳豆根结线虫、松材线虫之一或两种以上的组合。
11.权利要求8所述Sphingobacterium hotanense AMCC101218菌剂在防治由一种或多种线虫引起的植物病害中的应用。
12.如权利要求11所述应用，其特征在于，所述线虫为：南方根结线虫、象耳豆根结线虫、松材线虫之一或两种以上的组合。
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