CN113151065B - 一种用于防治线虫病害的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株新的枯草芽孢杆菌ZB1（Bacillus subtilis ZB1），保藏编号CCCTCC NO：M2020741，并提供了其在农业生产中的应用。所述枯草芽孢杆菌能有效防治根结线虫病害，对黄瓜白粉病等真菌性病害也有较好的防治效果，应用前景广泛。

Description

一种用于防治线虫病害的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种用于防治线虫病害的枯草芽孢杆菌及其在农业生产中的应用。

背景技术

农作物在生长过程中会发生病害，给现代农业生产造成较大影响。防止农作物病害就变得迫在眉睫，防控病害的主要途径有化学防治、物理防治、生物防治等。20世纪80年代开始，人们已经将生物防治用于农作物病除害处理和应用，生物防治是指用一种生物与另一种生物进行对抗，从而达到防治农作物病害的目的。它具有高效、安全、环境友好等特点，已被国内外研究者关注。关于生防菌防治农作物病害的报道非常多，已在农作物病害防治中取显著效果。

目前应用较多生防菌种主要包括细菌、真菌及放线菌3大类。关于芽孢杆菌和假单胞杆菌的报道较多，芽孢杆菌中用于植物病虫害防治的主要有枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等，其中苏云金芽孢杆菌是开发最成功的细菌杀虫剂，可用于防治园林植物上的多种昆虫，特别是鳞翅目害虫；假单胞杆菌能在植物根系周围的土壤中大量增殖，保护植物免遭受病原的侵害，其中荧光假单胞菌是近几十年来研究报道最多一类生防菌，但较少能制作成为生防制剂广泛应用和批量生产。例如，王勤英等公开了一株对鳞翅目害虫广谱高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其可湿性粉剂的制备和应用，该菌株含有等多个杀虫基因，对梨小食心虫、棉铃虫、美国白蛾、苹小卷叶蛾、舟型毛虫、苹果蠹蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾、小菜蛾、甜菜夜蛾等多种鳞翅目害虫具有高效的致死作用。侯园园利用绿针假单胞菌G5菌株对苦瓜枯萎病SG－15菌株和黄瓜枯萎病菌FOC菌株试验，具有明显拮抗作用，抑制率分别达到60％以上和78.39％。

木霉菌是一种重要的植物病害生防因子，自被发现能抑制植物病原菌增殖以来，各国科研人员对其进行了大量的试验，目前在农业生产中应用较普遍，随着对木霉菌在农业上的不断研究和对其作用机制的日臻完善，木霉菌和它的代谢产物在园林植物上的应用也将会有良好的发展前景。有研究报道，其对杨树叶枯病、烂皮病、泡溃疡等多种病菌有较好的抑制作用。毛壳菌在防治植物病害方面表现也比较突出，对多种农作物的种子腐烂和种苗猝倒都有明显的抑制作用，对番苹果黑星菌、百合灰霉病等也能表现出较好的抑制效果。

放线菌是细菌的特殊分支，应用最多的是链霉菌和它的变种，已有许多的生防制剂广泛地应用在工农业和医药等领域，如井冈霉菌素、阿维菌素等。阿维菌素是目前应用最普遍的生物农药，能防治鞘翅目、鳞翅目、蜱螨目的百余种害虫，园林上可用来防治各类植物叶螨、蚜虫、木虱、蓟马等病虫害。

未来利用微生物防治植物病虫害会有广阔的前景，尤其是在增强植物对病虫害的防御、促进植物生长、改善土壤以及增加营养物质的吸收利用率等方面。通过对生防微生物全面系统的研究，并借助于生物技术等多门学科的研究方法和手段，进一步完善其基础理论，筛选出优良的生物防治菌株，可以进一步促进生防微生物的研究工作不断深入。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其在农业生产中的应用。所述枯草芽孢杆菌能有效防治根结线虫病害，对黄瓜白粉病等真菌性病害也有较好的防治效果，应用前景广泛。

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌ZB1(Bacillussubtilis ZB1)，已于2020年11月16日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2020741。

本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。

所述植物病害为线虫病、白粉病或根腐病。

本发明一方面提供了一种微生物制剂，包含上述枯草芽孢杆菌ZB1。

所述微生物制剂还包含芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或两种或多种的组合。

所述的芽孢杆菌优选地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌或暹罗芽孢杆菌。

所述微生物制剂中枯草芽孢杆菌ZB1的活菌量至少为10⁹CFU/g。

本发明还提供了上述微生物制剂在植物病害防治中的应用。

本发明还提供了一种肥料，包含上述微生物制剂。

本发明所述枯草芽孢杆菌ZB1可有效提高作物的长势及产量，同时对黄瓜、甜瓜、丝瓜等葫芦科作物易发的根结线虫病害的防治效果显著。其中，枯草芽孢杆菌ZB1发酵液在24h时对线虫的触杀死亡率达100％；枯草芽孢杆菌ZB1可有效抑制线虫虫卵孵化和线虫幼虫生长，并且具有很好的杀线虫效果，在接种后第7天时对线虫虫卵的孵化抑制率高达91.67％，第12天时线虫的死亡率高达91.11％；枯草芽孢杆菌ZB1对黄瓜根结线虫病的防治效率高达86.5％，且枯草芽孢杆菌ZB1处理组黄瓜苗期长势明显优于对照组，根系也比对照组发达，根结数显著减少，取得了意料不到的技术效果。

枯草芽孢杆菌ZB1对立枯丝核菌、白粉病菌、锈病菌和草藤仓赤霉菌具有较强的抑菌效果，抑菌带宽度超过31mm。该菌株可显著降低黄瓜白粉病的发生，防治效率最高可达84.5％，效果显著。

此外，所述枯草芽孢杆菌ZB1具有较高的产酶水平，发酵3d时产几丁质酶活性最高达3.34U/mL，产蛋白质酶活性最高达12.4U/mL。

本发明提供的枯草芽孢杆菌ZB1可单独，或与其他芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或多种进行组合，作为生防菌剂，或添加到有机肥、化肥等肥料中使用，广泛应用于农业种植生产中，有效防治根结线虫病、白粉病、根霉病等作物常发的真菌性病害，应用前景广阔。

附图说明

图1为ZB1菌株菌落图；

图2为ZB1菌株蛋白质谱峰图；

图3为ZB1菌株基因指纹图谱；

图4为黄瓜盆栽苗期长势及根结情况对比。

具体实施方式

对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。

实施例1菌株的分离与筛选

1、样品来源：山东省青岛市即墨区蔬菜种植大棚黄瓜根际土壤。

2、菌株分离：采用梯度稀释涂布法

称取10g土壤样品装入有无菌玻璃珠和90m L无菌水的250mL锥形瓶中，充分摇匀。静置后于超净工作台上进行梯度稀释，得到10^-4、10^-5、10^-6三个梯度的稀释液，各取100μL涂布于营养琼脂平板上，重复3次。后置于37℃培养箱中培养，24h后观察生长情况，根据菌落大小、形状和颜色等特征进行分类，挑取单菌落进行纯化培养。最终挑选其中的4株菌，将其编号为A1-A4，并进行液体甘油保种。

3、菌株筛选：采用菌株发酵液对线虫的触杀实验

取分离纯化到的4株菌接种于装有营养肉汤培养基的试管中，37℃、200r/min摇床中培养48h后，用移液枪取上清液于培养皿中备用。挑取15条实验室保存的线虫于培养皿的发酵液中，置于16℃恒温培养箱内，分别在12h、24h观察线虫并计数，计算线虫死亡率，结果见表1。

线虫死亡率(％)＝死亡线虫数/供试线虫数×100％。

表1不同菌株对线虫的触杀效果

由表1的结果可知，本发明筛选到的4株菌中A2菌株发酵液对线虫触杀效果最好，在24h时对线虫的触杀死亡率达100％，申请人将该菌株命名为ZB1，并对其作进一步评价。

实施例2菌株ZB1的鉴定

2.1菌落形态鉴定

如图1所示，ZB1菌株在营养琼脂培养基上菌落呈圆形，隆起且黏稠，边缘整齐，表面光滑，不透明，菌落颜色为乳白色；可产生芽孢；芽孢呈椭圆形，局部呈圆形或近似圆形，革兰氏染色镜检观察为阳性。

2.2 16S rRNA分子鉴定

采用试剂盒提取菌株ZB1的基因组。然后以该基因组为模板，利用特异性引物对其16S rRNA进行扩增。将扩增得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示PCR产物大小为1500bp左右，符合要求。将该PCR扩增产物送测序公司进行测序。

测序结果显示，PCR扩增产物的序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，其与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似性最高。因此，初步确定ZB1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

2.3MALDI-TOF-MS蛋白质谱鉴定

取少量ZB1单菌落以薄膜的形式涂布于靶板上；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的裂解液，室温下自然晾干；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干；将样品靶放入质谱仪进行鉴定。鉴定结果显示，ZB1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其蛋白质谱峰图如图2所示。

2.4RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定

根据全自动微生物基因指纹鉴定系统操作说明对菌株ZB1进行了上机鉴定，得到其rRNA基因指纹图，如图3所示。通过与已知标准菌株库指纹图进行比对发现，菌株ZB1与枯草芽孢杆菌的相似度高达96％以上，因此，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

综上，申请人利用16S rRNA鉴定、MALDI-TOF-MS蛋白质谱鉴定、RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定三种分子生物学方法对菌株ZB1进行鉴定，鉴定结果一致。再结合菌株ZB1的菌落形态特征，申请人确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌ZB1(Bacillus subtilis ZB1)。

申请人已于2020年11月16日将上述枯草芽孢杆菌ZB1(Bacillus subtilis ZB1)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020741。

实施例3枯草芽孢杆菌ZB1产酶能力评价

1.菌液的制备

将枯草芽孢杆菌ZB1进行活化，挑取活化后的枯草芽孢杆菌ZB1接种于营养肉汤培养基中，37℃，220r/min培养18h，获得活菌量为10⁸-10⁹CFU/ml的菌液。

2.粗酶液制备：

将ZB1菌株接种到营养肉汤培养基中，200r/min，37℃培养3d，发酵液12000r/min条件下离心，上清液即为粗酶液。

3.几丁质酶活测定方法

胶体几丁质的制备：称取10g几丁质粉慢慢加入浓盐酸500mL，不断搅拌使其完全溶解，然后过滤，取滤液加4L预冷去离子水，4℃下过夜，次日离心取沉淀，用去离子水反复洗涤离心至pH值为7.0，并采用干重法测量胶体几丁质含量，调整终浓度为1％，4℃冰箱储存备用。

发酵液经离心后取0.5mL上清液与0.5mL 1％胶体几丁质、1mL pH7.0缓冲液混合，50℃恒温水浴30min，放入沸水浴10min，立即冷却，灭活菌液作为空白对照，DNS法测定还原糖OD值，并根据N-乙酰氨基-D-葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。

几丁质酶活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟释放相当于1μmol NAG还原糖所需酶量为1个酶活力单位(U)。

结果显示，枯草芽孢杆菌ZB1发酵培养3d后产几丁质酶活性最高达3.34U/mL。

4.蛋白酶活测定方法

蛋白酶活力的测定：将1mL粗酶液与1mL酪蛋白溶液底物混合均匀，于40℃反应10min，加入2mL三氯乙酸终止反应，12 000r/min条件下离心3min。在1mL上清液中加入5mLNa₂CO₃以及1mL Folin-酚试剂，混合均匀后于40℃保温20min，采用紫外可见分光光度计于波长660nm处测定吸光度值。以先加入三氯乙酸终止反应的一组为对照组。

蛋白酶活力单位定义：1个酶活力单位定义为每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量(U)。

结果显示，枯草芽孢杆菌ZB1发酵培养3d后产蛋白质酶活性最高达12.4U/mL。实施例4枯草芽孢杆菌ZB1抑菌能力评价

1.枯草芽孢杆菌ZB1菌液制备

按前述液体发酵培养方法制备枯草芽孢杆菌ZB1发酵液备用。

2.病原菌的制备

将稻瘟病菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌、白粉病菌、灰霉病菌、纹枯病菌等多种真菌性病原菌(山东省农科院植保所提供)分别接种于PDA培养基上纯化培养，25℃培养5天后备用。

3.平板抑菌试验

采用滤纸片法，在培养基中央接种直径为8mm的病原菌菌饼，将已经灭菌的滤纸片放于菌饼两侧距离培养皿中心30mm处，吸取10ul枯草芽孢杆菌ZB1菌液点到滤纸片上；然后将培养皿放于26℃培养箱中培养，每天观察记录抑菌带的宽度，每种病原菌做三个重复，取平均值。抑菌效果详见表2。

表2枯草芽孢杆菌ZB1对不同病原菌的抑菌效果

从表2的实验结果可知，本发明提供的枯草芽孢杆菌ZB1对上述10种病原菌均具有明显的抑制作用，其中对立枯丝核菌、白粉病菌、锈病菌和草藤仓赤霉菌的抑菌效果较好，抑菌带宽度超过31mm，取得了意料不到的技术效果。

实施例5枯草芽孢杆菌ZB1对线虫卵孵化抑制及幼虫致死的效果评价

1.枯草芽孢杆菌ZB1菌液制备

按前述液体发酵培养方法制备枯草芽孢杆菌ZB1发酵液备用。

2.秀丽隐杆线虫培育

线虫传代培养：将秀丽隐杆线虫接种于涂有E.coli50的NGM培养基平皿上，16℃培养，每7天传代培养一次。

线虫同期化培养：将成虫期线虫3-5条用微量移液器接种于涂有E.coli50的NGM培养基，待产卵6-8h后，将成虫取出，得到同期虫卵进行虫卵孵化抑制实验，部分虫卵继续培养48h后，成长到L4期，完成同期化培养进行线虫致死实验。

3.线虫卵孵化抑制及幼虫致死实验

培养基制备：将枯草芽孢杆菌ZB1、E.coli OP50菌株接种LB培养基，37℃摇菌12h；将菌液均匀涂布在5-氟尿嘧啶NGM培养基，37℃过夜培养。

虫卵孵化抑制实验：将同期虫卵接种到涂有枯草芽孢杆菌ZB1菌液的培养基上，每个平板接种20个左右，重复3次(编号为T-ZB1)，E.coli OP50为空白对照(编号为T-E.coliOP50)，将所有平板置于16℃培养，每天同一时间观察，统计虫卵孵化后线虫数量，直到第12天为止。计算虫卵孵化抑制率。具体结果见表3。

幼虫致死实验：将L4期线虫幼虫接种到涂有枯草芽孢杆菌ZB1菌液的培养基上，每个平板接种15条左右的线虫，重复3次(编号为C-ZB1)，E.coli OP50为空白对照(编号为C-E.coli OP50)，将所有平板置于16℃培养，每天同一时间观察，统计线虫死亡数目，直到第12天为止。调查统计线虫存活数并以此计算线虫死亡率，具体结果见表3。

虫卵孵化抑制率(％)＝未孵化虫卵数/虫卵总数×100％。

线虫死亡率(％)＝线虫死亡数/线虫总数×100％。

4.试验结果

表3不同时间线虫存活数

从表3中虫卵孵化抑制实验数据可以看出，在接种后第7天线虫虫卵基本孵化完成，7天后无增长，计算第7天时的虫卵孵化抑制率高达91.67％，而对照组仅为5％。从接种后第12天的数据可知，本实验中孵出的线虫幼虫在第10-12天期间有60％死亡。

从表3中线虫致死实验数据可以看出，随着处理时间延长，线虫死亡数量逐渐增多，计算第12天时线虫的死亡率高达91.11％，而对照组仅为4.44％％。

上述实验结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌ZB1菌株可有效抑制线虫虫卵孵化和线虫幼虫生长，同时具有很好的杀线虫效果，取得了意料不到的技术效果。

实施例6枯草芽孢杆菌ZB1在黄瓜盆栽上的防线虫效果评价

1.无病土采集与处理：采集田间自然种植用且无根结线虫的土，过筛保证细度均一；再将土样灭菌处理，避免病原菌或已有线虫的影响。同时将灭菌土混入一定沙，沙与灭菌土的体积用量比为1：2制成备用土。

2.虫卵悬浮液制备：取根结线虫发病的植物根，用破壁机加水破碎得到粗悬浮液，在显微镜下统计1ml粗悬浮液卵块的数量，重复5次以上，计算粗悬液的卵含量，用于后续接种，接种量为每盆2000-4000个卵块。

3.育苗：实验用作物为黄瓜的根结线虫易感品种，用育苗基质装入50孔育苗盆中，把根结线虫感病寄主的种子播入育苗基质中，每育苗孔1粒种子，待苗长到3-5真叶时可移栽。

4.接种：在接种花盆底部先加1/2到2/3的无菌备用土，再加定量的虫卵悬浮液，保证接种量在2000以上，后再加铺一层备用土，再加枯草芽孢杆菌ZB1菌粉(活菌量为10亿/g)，菌粉拌土撒施一层，后再加铺一层备用土，最后移栽备用苗。接种移栽完成的盆栽浇适量定植水。

5.培养：将枯草芽孢杆菌ZB1菌粉处理好的盆栽于20-25℃温室中培养，3d左右浇一次水，根据土壤干湿程度可适当调整，土壤湿度不超过50％。培养35-45d后，扣盆取根调查统计效果。对照组不加任何菌粉。

6.根结指数及防效调查计算

表4根结分级标准

根结指数和相对防效计算如下：

根结指数＝[∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)]×100。

相对防效＝(对照组根结指数-处理组根结指数)/对照组根结指数×100％。

统计结果显示，枯草芽孢杆菌ZB1处理组盆栽中黄瓜的根结指数明显降低，枯草芽孢杆菌ZB1对黄瓜根结线虫病的防治效率高达86.5％。同时从图4可明显看出，枯草芽孢杆菌ZB1处理后的黄瓜苗期长势明显优于对照组，根系也比对照组发达，根结数显著减少。从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌ZB1能有效防治线虫病害，促进植物生长，效果显著。

实施例7枯草芽孢杆菌ZB1在黄瓜大田种植中的防线虫效果评价

1.实验地点：

青岛市即墨区农业高新技术产业区大棚。

2.黄瓜种植实验：

实验小区面积为10m×10m，每个实验区内有10垄黄瓜，约500±10株，共15个实验小区，通过随机区组每个处理组进行3次重复。

(1)空白对照组：正常田间管理，不使用菌剂，清水浇施；

(2)ZB1菌粉处理组：将ZB1菌粉(活菌量为10亿/g)按1-8kg/亩的用量在黄瓜苗移栽后随水冲施，7天后再用一次。其中：

处理组1：ZB1菌粉用量为1kg/亩；

处理组2：ZB1菌粉用量为3kg/亩；

处理组3：ZB1菌粉用量为5kg/亩；

处理组4：ZB1菌粉用量为8kg/亩。

黄瓜移栽种植后每隔1个月进行调查，共调查三次。每次调查时，各小区挖取10株黄瓜，测量其株高、称量其株重，统计根结级数并记录，计算单株平均株重、平均株高及根结防效；采摘期分不同批次进行取样统计单果重，并计算小区产量，结果见表5。

表5枯草芽孢杆菌ZB1在黄瓜上的应用效果

实验分组	株高(cm)	株重(kg)	产量(kg)	增产率	根结指数	相对防效
							对照组	146.20	0.12	90.9	-	66.5	-
处理组1	192.00	0.20	92.6	2.3％	40.2	39.5％
							处理组2	203.45	0.22	101.2	11.3％	38.3	42.4％
处理组3	233.30	0.31	101.8	11.9％	29.8	55.2％
							处理组4	248.30	0.34	107.5	18.3％	21.1	68.3％

从表5的实验结果可知，通过在黄瓜苗期施用枯草芽孢杆菌ZB1菌粉，可以显著提高黄瓜植株长势，增加株高和株重。其中，处理组4黄瓜的产量最高，比对照组提高了18.3％，增产效果明显；同时枯草芽孢杆菌ZB1可有效降低根结线虫病害的发生，减轻病情指数，对黄瓜根结线虫的防治效率最高达68.3％，防治效果较好。

此外，申请人在甜瓜、丝瓜等其他葫芦科作物上进行了线虫防治实验，结果表明枯草芽孢杆菌ZB1对甜瓜根结线虫的防治效率可达65.5％，对丝瓜根结线虫的防治效率可达62.6％，效果均非常显著。

综合在田间的使用效果可知，本发明提供的枯草芽孢杆菌ZB1可有效提高作物的长势及产量，同时对黄瓜、甜瓜、丝瓜等葫芦科作物易发的根结线虫病害的防治效果显著，取得了意料不到的技术效果。

实施例8枯草芽孢杆菌ZB1对黄瓜白粉病的防治效果评价

1、实验地点：

青岛莱西市院上镇黄瓜种植大棚。

2、黄瓜白粉病防治实验：

实验小区面积为8m×6m，每个实验小区内有6垄黄瓜，约300±10株，每个处理组重复3次，共15个实验小区，具体分组如下：

(1)空白对照组：不使用菌剂，清水浇施；

(2)ZB1菌粉处理组：将ZB1菌粉(活菌量为10亿/g)按1-8kg/亩的用量在黄瓜苗移栽后随水冲施，7天后再用一次。其中：

处理组1：ZB1菌粉用量为1kg/亩；

处理组2：ZB1菌粉用量为3kg/亩；

处理组3：ZB1菌粉用量为5kg/亩；

处理组4：ZB1菌粉用量为8kg/亩。

病害分级标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占叶面积的5％以下；3级：病斑面积占叶面积的6％-10％；5级：病斑面积占叶面积的11％-20％；7级：病斑面积占叶面积的21％-40％；9级：病斑面积占叶面积的41％以上。

病情指数＝[∑(病级值×该级发病叶数)/(调查总叶数×最高病级值)]×100。

相对防效＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。

在黄瓜生长期内定期统计白粉病的发病情况，调查病情指数，计算相对防治效果，具体结果见表6。

表6枯草芽孢杆菌ZB1对黄瓜白粉病的防治效果

实验分组	病情指数	相对防效(％)
			对照组	80.0	-
处理组1	28.6	64.25％
			处理组2	28.0	65.00％
处理组3	20.6	74.25％
			处理组4	12.4	84.50％

从表6的实验结果可知，使用枯草芽孢杆菌ZB1菌粉可显著降低黄瓜白粉病的发生，处理组相对防治效果在64.25％以上，最高可达84.5％，防治效果较好，取得了意料不到的技术效果。

综上所述，本发明提供的枯草芽孢杆菌ZB1可作为生防菌剂广泛应用于农业种植生产中，对黄瓜、甜瓜、丝瓜等葫芦科作物易发的根结线虫病害有显著防效，对白粉病、根腐病等作物常发的真菌性病害有很好的生防效果，同时具有较好的促生增产作用。所述枯草芽孢杆菌ZB1还可单独使用，或与其他芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或多种进行组合，添加到有机肥、化肥等肥料中使用，应用前景广阔。

序列表

<110> 山东蔚蓝生物科技有限公司

山东康地恩生物科技有限公司

<120> 一种用于防治线虫病害的枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

gttcgacttc ccccaatcat ctgtcccacc ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc 60

accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga 120

acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga 180

gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt 240

cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat 300

gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca 360

actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct 420

cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc 480

ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa 540

ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt 600

gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa 660

ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt 720

cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc cttcgccact 780

ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc 840

tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc 900

agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac 960

ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc 1020

aaggtaccgc cctattcgaa cggtacttgt tcttccctaa caacagagct ttacgatccg 1080

aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc 1140

cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc 1200

ctctcaggtc ggctacgcat cgttgccttg gtgagccatt acctcaccaa ctagctaatg 1260

cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg aagccacctt ttatgtttga accatgcggt 1320

tcaaacaacc atccggtatt agccccggtt tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg 1380

ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc 1440

gctcgacttg ca 1452

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2020741。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在植物病害防治中的应用，其特征在于，所述的植物病害为黄瓜根结线虫病、甜瓜根结线虫病、丝瓜根结线虫病或黄瓜白粉病。

3.一种微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

4.如权利要求3的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂还包含地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、假单胞菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或多种的组合。

5.如权利要求3或4所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂中枯草芽孢杆菌的活菌量至少为10⁹CFU/g。

6.权利要求3或4所述的微生物制剂在植物病害防治中的应用，其特征在于，所述的植物病害为黄瓜根结线虫病、甜瓜根结线虫病、丝瓜根结线虫病或黄瓜白粉病。

7.一种肥料，其特征在于，所述的肥料包含权利要求3或4所述的微生物制剂。

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