CN110004098B - 一株苏云金芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株苏云金芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株苏云金芽孢杆菌JW‑1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.17571。所述苏云金芽孢杆菌JW‑1的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述苏云金芽孢杆菌JW‑1对食用菌眼蕈蚊具有很好的杀虫活性，本发明利用其杀虫效果好、对菌丝生长安全的优点，生产出在食用菌上使用的安全、高效杀虫剂，可用于特异性杀灭食用菌眼蕈蚊，替代了部分化学农药的使用，减少了环境污染，具有良好的经济和生态效益，具有很好的应用推广前景。

Description

一株苏云金芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株苏云金芽孢杆菌JW-1及其在食用菌虫害防治中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
眼蕈蚊(Sciaridae)隶属节肢动物门(Arthropoda)、昆虫纲(Isecta)、双翅目(Diptera)，主要危害双孢蘑菇、平菇、秀珍菇、茶树菇、毛木耳、羊肚菌、黑皮鸡枞、草菇、灵芝等多种食药用菌品种，且在全国各产区均有发生，是食用菌栽培中危害最为严重的一类虫害，有6属27种，其中危害较重的有异迟眼蕈蚊(Bradysia difformis)、平菇厉眼蕈蚊(Lycoriella ingenua)等。眼蕈蚊幼虫孵化后直接取食菌丝和子实体，且排出粪便滋生病菌。成虫是病原菌、线虫、螨虫等传播的重要媒介。目前在食用菌栽培中针对眼蕈蚊的防治方法主要有防虫网、黄色黏虫板、诱虫灯等物理防治措施和4.3％氯氟·甲维盐乳油复配剂化学防治药剂，但由于物理防治多针对成虫，对幼虫无效，化学防治目前国内登记在食用菌上的杀虫剂仅有一个，根本无法满足生产需求，长期使用易产生抗药性，因此直接用于杀死幼虫的生物防治方法成为研究食用菌虫害防控的热点。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)属好氧型革兰氏阳性细菌，能产生一种或多种对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、直翅目、等翅目等多种昆虫的伴孢晶体蛋白(insecticidal crystal protein,ICPs)，是在植物和卫生上广泛应用的一种微生物农药。Bt菌株的来源广泛，主要有土壤、昆虫、粪便、储藏品及尘埃、污水和植被等。苏云金芽孢杆菌具有专一性强、对人畜无害、环境友好等优点，尤其是对于食用菌这种从子实体形成到采收时间较短的大型真菌来说，对安全的要求更加严格，很多化学农药在食用菌上使用都容易产生药害和残留，安全性无法保障，但并非所有的Bt菌株可用于防治食用菌栽培中的眼蕈蚊。
目前利用苏云金芽孢杆菌防治双翅目类害虫的研究已有较多报道，如Bt对韭菜眼蕈蚊、库蚊、伊蚊、瓜实蝇等的防治效果达70％以上，但有关Bt防治食用菌眼蕈蚊的研究报道较少。因此筛选出对食用菌眼蕈蚊有高杀虫活性的Bt菌株，用于食用菌栽培具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一株用于防治食用菌眼蕈蚊的苏云金芽孢杆菌JW-1，该菌株对食用菌眼蕈蚊幼虫具有较高的杀虫活性，且对食用菌菌丝生长无影响，利用该菌株能开发一种专门用于食用菌栽培的高效Bt杀虫剂。
技术方案
一株苏云金芽孢杆菌JW-1，属于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年04月16日，保藏号为CGMCC NO.17571。
进一步，所述苏云金芽孢杆菌JW-1的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的苏云金芽孢杆菌JW-1菌株是从江苏省南京市紫金山土壤中分离得到的，JW-1是一株革兰氏阳性菌，营养体为杆状，芽孢圆形，伴孢晶体为不规则形。可利用甘露醇、D-核糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺、ARBULIN、七叶灵-柠檬酸、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、淀粉、糖原13种物质。通过16S rDNA序列基因比对与苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)同源性达99％以上。
上述苏云金芽孢杆菌JW-1在制备防治食用菌眼蕈蚊的杀虫剂中的应用。
一种用于防治食用菌眼蕈蚊的杀虫剂，包含上述苏云金芽孢杆菌JW-1。
所述杀虫剂的制备方法：取苏云金芽孢杆菌JW-1菌株在LB液体培养基中30℃、190r/min振荡培养过夜，然后按10％的菌液量转接至液体发酵培养基中30℃、190r/min振荡培养72h，即得。该方法简单易行、周期短、产物杀虫活性高。
所述液体发酵培养基配方：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，pH7.0～7.2。
本发明的杀虫剂不仅可以高效防治食用菌眼蕈蚊，保证食用菌安全生长，且对环境友好，因此具有重要的现实意义和紧迫性。
JW-1菌株中包含有cry4a、cry4b、cry10、cry11、cyt1和cyt2等6种基因型。以异迟眼蕈蚊幼虫为供试昆虫，本发明的杀虫剂对异迟眼蕈蚊幼虫的室内杀虫活性明显，校正死亡率为84.48％，且该杀虫剂对平菇、茶树菇、双孢菇菌丝生长均无影响。
上述杀虫剂用于防治食用菌眼蕈蚊的应用。应用方法：将杀虫剂直接喷洒于食用菌眼蕈蚊幼虫取食为害的食用菌培养料表面。
本发明的有益效果：本发明提供了一株苏云金芽孢杆菌JW-1，其对食用菌眼蕈蚊具有很好的杀虫活性，本发明利用其杀虫效果好、对菌丝生长安全的优点，生产在食用菌上使用的安全、高效杀虫剂，可用于特异性杀灭食用菌眼蕈蚊，替代了部分化学农药的使用，减少了环境污染，具有良好的经济和生态效益，具有很好的应用推广前景。
附图说明
图1为JW-1菌株的光学显微镜图；
图2为JW-1菌株的冷冻电镜图；
图3为JW-1菌株的16S rDNA系统发育树；
图4为本发明的杀虫剂对平菇、茶树菇和双孢菇三种食用菌菌丝生长的影响的测试结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：菌株分离与纯化
从江苏省南京市紫金山表层土下2cm处取土样10g，采用醋酸钠-抗生素法分离苏云金芽孢杆菌(Bt)。具体分离方法为：称取1g土样，倒入装有玻璃珠和50mL分离培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，醋酸钠34g/L，pH 7.0)的三角瓶中，在培养基中分别加入0.1mL浓度为0.2g/mL的青霉素钠盐和硫酸庆大霉素，摇床培养(190r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10mL于80℃静置水浴20min，将土壤悬液分别稀释10倍和100倍，各取0.1mL均匀涂于产孢晶培养基平板(产孢晶培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，将平板置30℃培养3d后挑取表面粗糙略带金属光泽、边缘不整齐的菌落涂片，用复红染色后于显微镜(油镜)下观察有无伴孢晶体产生(如图1所示)，将产生芽孢和伴孢晶体的菌株选出纯化。
实施例2：菌株鉴定
取JW-1菌株在固体培养基上划线培养24h后，观察到菌落呈乳白色，扁平，表面干燥无光泽；能在LB、PDA等多种培养基上生长，为好氧菌；通过冷冻电镜观察(图2)JW-1菌株营养体为杆状，芽孢圆形，伴孢晶体为不规则形。经革兰氏染色和API 50CH标准化系统试验结果如表1所示，JW-1菌株可利用甘露醇、D-核糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺、七叶灵-柠檬酸、ARBULIN、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、淀粉、糖原等13种物质，其余不能利用。这一结果与对比库中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)一致。
表1 JW-1菌株生理生化特征
Figure BDA0002068668890000041
注：“+”表示反应呈阳性；“-”表示反应呈阴性。
JW-1菌株16S rDNA片段大小为1397bp，通过序列同源性比对，与苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)同源性最高，达99％以上，JW-1菌株的16S rDNA系统发育树如图3所示。
实施例3：菌株杀虫蛋白基因型鉴定
以JW-1菌株的基因组DNA为模板，采用多种杀虫蛋白通用引物进行PCR扩增，确定JW-1菌株包含有cry4a、cry4b、cry/10、cry11、cyt1和cyt2等6种杀虫蛋白基因型。
实施例4：菌株室内毒力测定
取JW-1菌株在LB液体培养基中30℃、190r/min振荡培养过夜，按10％的菌液量转接至液体发酵培养基(牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，pH7.0～7.2)中30℃、190r/min振荡培养72h，至晶体产生，得到用于防治食用菌眼蕈蚊的杀虫剂。取新鲜的平菇子实体在该杀虫剂中浸泡10min，用滤纸吸干表面多余菌液后，将菇片放置于铺有湿滤纸片的培养皿中。每皿挑30头幼虫，未接种的液体培养基处理的菇片作为空白对照，每处理3次重复。培养72h后观察并记录死亡率。
实验结果：幼虫取食JW-1菌株后虫体变暗或降解，部分虫体用毛笔触碰易破，矫正死亡率达到84.48％。
实施例5：菌株安全性测定
用对峙培养法测定本发明的用于防治食用菌眼蕈蚊的杀虫剂对平菇、茶树菇和双孢菇三种食用菌菌丝生长的影响。将10μL的杀虫剂、10μL的未接种液体培养基和三种食用菌菌块(直径6mm)分别接种在PDA固体培养基平板上，25℃静置培养至食用菌菌丝长满，观察JW-1菌株发酵液对食用菌菌丝生长的影响。
图4为本发明的杀虫剂对平菇、茶树菇和双孢菇三种食用菌菌丝生长的影响的测试结果，其中，A为平菇，B为茶树菇，C为双孢菇，可以看出，平菇、茶树菇、双孢菇三种食用菌菌丝均可盖过杀虫剂正常生长，且生长速率与CK无明显差异，菌丝未出现抑制或致畸的现象，这说明JW-1菌株对食用菌菌丝生长安全无影响。
以上5个实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一株苏云金芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1397
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 1
taccccaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc 60
ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcatgt 120
aggcgagttg cagcctacaa tccgaactga gaacggtttt atgagattag ctccacctcg 180
cggtcttgca gctctttgta ccgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg 240
catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caccttagag 300
tgcccaactt aatgatggca actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca 360
acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcactctgc tcccgaagga 420
gaagccctat ctctagggtt ttcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc 480
ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc 540
agccttgcgg ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg ttaacttcag cactaaaggg 600
cggaaaccct ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat 660
cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gtgtcagtta cagaccagaa agtcgccttc 720
gccactggtg ttcctccata tctctacgca tttcaccgct acacatggaa ttccactttc 780
ctcttctgca ctcaagtctc ccagtttcca atgaccctcc acggttgagc cgtgggcttt 840
cacatcagac ttaagaaacc acctgcgcgc gctttacgcc caataattcc ggataacgct 900
tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt 960
accgtcaagg tgccagctta ttcaactagc acttgttctt ccctaacaac agagttttac 1020
gacccgaaag ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga 1080
agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg 1140
atcaccctct caggtcggct acgcatcgtt gccttggtga gccgttacct caccaactag 1200
ctaatgcgac gcgggtccat ccataagtga cagccgaagc cgcctttcaa tttcgaacca 1260
tgcagttcaa aatgttatcc ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc cagtcttatg 1320
ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac ttcttgagag caagctctca 1380
atccattcgc tcgactg 1397

Claims (2)

1.苏云金芽孢杆菌JW-1在制备防治食用菌眼蕈蚊的杀虫剂中的应用，所述食用菌眼蕈蚊为异迟眼蕈蚊，所述苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）JW-1的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年04月16日，保藏号为CGMCCNO. 17571。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治食用菌眼蕈蚊的杀虫剂的制备方法为：取苏云金芽孢杆菌JW-1菌株在LB液体培养基中30 ℃、190 r/min振荡培养过夜，然后按10%的菌液量转接至液体发酵培养基中30 ℃、190 r/min振荡培养72 h，即得， 所述液体发酵培养基配方：牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH7.0~7.2。
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