CN111593002B - 一种生防制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生防制剂的制备方法，包括以下步骤：发酵保藏编号为CGMCC No.16746的雷格链霉菌(Streptomyces regensis)，得到发酵液。该方法制备的生防制剂可以用于生物防治领域，对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、亚洲玉米螟、二斑叶螨、菜青虫、甘蓝夜蛾、马铃薯瓢虫、桃蚜进行防治。具有杀虫活性高、杀虫谱广、遗传稳定性好等特点，对温度的耐受性强、杀虫活性稳定、光稳定性好、耐贮存等，具有很好的开发应用价值。

Description

一种生防制剂的制备方法

本发明是分案申请，原中国发明专利申请号为：201811583132.6，申请日为：2018年12月24日，申请时专利名称为：一株链霉菌及其应用。

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，涉及一种生防制剂的制备方法。

背景技术

放线菌是最早发现有生防作用的一类微生物，国内外相继报道放线菌中的多种链霉菌能够产生新抗虫抗生素，阿维菌素的发现和成功开发被认为是抗生素在农业生产中应用的第三个里程碑，是农业生产中最具潜力的抗生素。近几年报道的3000多种新抗生素中，杀虫抗生素约占5％。发现了一些具有发展潜力的抗生素品种。但现有的抗生素普遍存在杀虫效率低、稳定性差等问题。因此，研制开发一种高效、稳定的新型链霉菌或其生防制品对农林业可持续发展至关重要。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种新型的生防制剂的制备方法，通过该方法制备的生防制剂具有杀虫活性高、杀虫谱广、遗传稳定性好等特点；具有对温度耐受性强、杀虫活性稳定、光稳定性好、易贮存等优点，具有很好开发应用价值。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一株链霉菌，该菌株为雷格链霉菌(Streptomyces regensis)，其保藏编号为CGMCC No.16746。

在本申请中，发明人将其命名为LKY208。于2018年11月15日将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),该保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该菌株在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，28℃培养1～2d时，菌落光滑、无孢子生成，第3d开始可见气丝黄绿色、淡黄绿色、淡黄色，4d后基质颜色逐渐变为黄色。在显微镜下观察，基内菌丝无横膜，不断裂；电镜观察结果表明孢子丝短，时常不规则，偶见短而松散螺旋状，孢子椭圆形、柱形，表面光滑或不规则褶皱。

发明人在探索链霉菌在生物防治领域(例如花布灯蛾的生物防治)的突破时，从采自吉林省不同地区的土壤中分离得到217株放线菌进行筛选及防治效果测定，最终获得了1株能够有效防治花布灯蛾幼虫的拮抗菌株，将其命名为LKY208，并对其发酵液稳定性及菌株分类地位进行了系统研究，为生物防治提供新的生防因子。发明人在研究中发现，该链霉菌具有杀虫活性高、杀虫谱广、遗传稳定性好等特点；菌株发酵液具有对温度耐受性强、杀虫活性稳定、光稳定性好、耐贮存等优点，具有很好开发应用价值。

本发明还提供上述链霉菌在农林害虫防治中的应用。所述害虫可以选自花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、亚洲玉米螟、二斑叶螨、菜青虫、甘蓝夜蛾、马铃薯瓢虫和桃蚜、斑须蝽中的一种或几种的组合。

本发明提供的链霉菌具有杀虫活性高、杀虫谱广和遗传稳定性好等优点。经过实验验证，对于上述花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、亚洲玉米螟、二斑叶螨、菜青虫、甘蓝夜蛾、马铃薯瓢虫、桃蚜均具有杀虫作用。其中对鳞翅目的害虫杀虫效果很明显。对美国白蛾幼虫的有较高的杀虫活性，48h校正死亡率为72.1％，对菜青虫和甘蓝夜蛾48h的校正死亡率分别为43.9％和36.5％，对二斑叶螨亦具有较好的杀虫活性，48h的校正死亡率达56％；对小菜蛾幼虫的杀虫活性仅次于花布灯蛾幼虫和美国白蛾幼虫，校正死亡率为69.5％；尤其，对鳞翅目花布灯蛾幼虫的杀虫活性最高，48h的校正死亡率可达74.1％。

本发明还提供一种生防制剂，包括上述的链霉菌和/或上述的链霉菌的发酵液,所述链霉菌为雷格链霉菌(Streptomyces regensis)，其保藏编号为CGMCC No.16746。

该生防制剂具有杀虫活性高、杀虫谱广、遗传稳定性好等特点,且具有对温度耐受性强、杀虫活性稳定、光稳定性好、耐贮存等优点，具有很好开发应用价值。

进一步，上述链霉菌的发酵液的通过以下方法制备：发酵保藏编号为CGMCCNo.16746的雷格链霉菌(Streptomyces regensis)，得到发酵液。

本发明还提供一种上述生防制剂在害虫防治中的应用。所述害虫选自花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、亚洲玉米螟、二斑叶螨、菜青虫、甘蓝夜蛾、马铃薯瓢虫和桃蚜中的一种或几种的组合。

本发明提供一种生防制剂的制备方法，包括以下步骤：发酵保藏编号为CGMCCNo.16746的雷格链霉菌(Streptomyces regensis)，得到发酵液。

进一步，发酵过程中的温度为25～28℃。采用该温度有利于上述链霉菌的生长，从而保证生物防治的效果。

进一步，还包括离心发酵液的步骤。

在实际应用时，为方便存储，也可以采用干燥的方式(例如冻干)将发酵液制备成粉末，待使用之前，将粉末用溶剂溶解后再施用在待防治的对象上。

进一步，发酵保藏编号为CGMCC No.16746的雷格链霉菌的方法可以包括以下步骤：将保藏编号为CGMCC No.16746的雷格链霉菌接种至高氏一号斜面培养基上培养，再将培养得到的菌饼接种至发酵培养基进行培养，之后收集发酵液。

进一步，所述高氏一号斜面培养基的配方包括：每1000mL蒸馏水包括可溶性淀粉20g，K₂HPO₄ 0.5g，KNO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂20g，pH7.0～7.2。

进一步，所述发酵培养基的配方包括：溶剂为水，以质量百分数计，花生饼粉2.5％、可溶性淀粉5.0％、酵母粉0.08％、葡萄糖0.02％、(NH₄)₂SO₄ 0.08％、NaCl 0.2％、CaCO₃ 0.32％，pH 7.0～7.2。

进一步，将保藏编号为CGMCC No.16746的雷格链霉菌接种至高氏一号斜面培养基上，28℃条件培养7d后，取菌饼接种至发酵培养基中，温度为28℃，振荡培养5d。

本发明的有益效果：采用上述方法制备的生防制剂可以用于生物防治领域，对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、亚洲玉米螟、二斑叶螨、菜青虫、甘蓝夜蛾、马铃薯瓢虫、桃蚜进行防治。具有杀虫活性高、杀虫谱广、遗传稳定性好等特点，对温度的耐受性强、杀虫活性稳定、光稳定性好、耐贮存等，具有很好的开发应用价值。

本发明可以提供上述生防制剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：将上述生防制剂施用在需要防治的植物上。

进一步，所述植物包括被以下害虫危害的植物；所述害虫选自花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、亚洲玉米螟、二斑叶螨、菜青虫、甘蓝夜蛾、马铃薯瓢虫和桃蚜中的一种或几种的组合。

本发明提供的生防制剂具有杀虫活性高、杀虫谱广和遗传稳定性好等优点。经过实验验证，对于上述花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、亚洲玉米螟、二斑叶螨、菜青虫、甘蓝夜蛾、马铃薯瓢虫、桃蚜均具有杀虫作用，因此，对于由上述害虫导致的植物的病虫害具有很好的防治效果。

附图说明

图1为温度对菌株发酵液杀虫活性的影响的结果。

图2为pH对菌株发酵液杀虫活性的影响的结果。

图3为光照对菌株发酵液杀虫活性的影响的结果。

图4为贮藏时间和温度对菌株发酵液杀虫活性的影响的结果。

图5继代培养对菌株发酵液杀虫活性的影响的结果。

图6菌株LKY208的电镜照片。

图7菌株LKY208及相关菌株的系统发育树。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明通过卤虫初筛和花布灯蛾幼虫复筛，从土壤中得到1株具有较高杀虫活性的放线菌菌株，将其命名LKY208，为明确该菌株的生防效果及分类地位，采用叶片浸渍法、饲料染毒法、玻片浸渍法及常规浸虫法分别测定了其对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、亚洲玉米螟、二斑叶螨、菜青虫、甘蓝夜蛾、马铃薯瓢虫、桃蚜、斑须蝽10种农林害虫的杀虫活性；同时对发酵液的稳定性进行了初步研究，并通过16SrRNA研究了其分类地位。结果表明：该菌株对除斑须蝽外，花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾等9种供试虫源均有致死作用，杀虫谱广，其中对花布灯蛾的致死作用最强，48h的校正死亡率达70％以上，菌株发酵液对温度耐受性强，在28～50℃杀虫活性稳定；酸碱耐受性测定表明pH4～7范围内菌株杀虫活性较好，发酵液的光稳定性、贮存性和菌株遗传稳定性均表现稳定，具有较好开发应用价值；经16SrRNA序列比对分析，鉴定菌株LKY208为雷格链霉菌Streptomyces regensis，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.16746，此乃国内外首次报道将链霉菌应用于花布灯蛾等害虫的防治。

下面通过具体的实施例来进行介绍。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试土壤

自2016年6月开始，在吉林省的不同地区采集土样30份。详见表1

表1

1.1.2供试菌株

链霉菌菌株LKY-208，分离自编号15的土壤，由本实验室筛选、分离并保存，具体过程见下面实施例。

1.1.3供试虫源

花布灯蛾(Camptoloma interiorata，Walker)，鳞翅目，灯蛾科；

美国白蛾(Hyphantria cunea，Drury)，鳞翅目，灯蛾科；

小菜蛾(Plutella xylostella L.)，鳞翅目，菜蛾科；

亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guenee)，鳞翅目，螟蛾科；

二斑叶螨(Tetranych usurticae Koch)，蜱螨目，叶螨科；

菜青虫(Pieris rapae L.)，鳞翅目，粉蝶科；

甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae L.)，鳞翅目，夜蛾科；

马铃薯瓢虫(Epilachna vigintioctomaculata Motschulsky)，鞘翅目，瓢甲科；

桃蚜(Myzus persicae Sulzer)，同翅目，蚜科；

斑须蝽(Dolycoris baccarum L.)，同翅目，蝽科；

以上供试虫源为发生期在林间及温室内采集及养虫室内饲养。

1.1.4供试卤虫(BrineShrimp)

卤虫(Brine Shrimp)，又称盐水丰年虫，购自山东省滨州港友发水产有限公司。

1.1.5供试培养基

高氏一号合成培养基，配方：可溶性淀粉20g，K₂HPO₄ 0.5g，KNO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。

液体发酵培养基，配方：花生饼粉2.5％、可溶性淀粉5.0％、酵母粉0.08％、葡萄糖0.02％、(NH₄)₂SO₄ 0.08％、NaCl 0.2％、CaCO₃ 0.32％，pH 7.0～7.2。

人工海水，参考文献(熊丽霞.海洋微生物杀虫活性物质的分离筛选与海洋杀虫链霉菌L173的研究.中国环境生态研究所博士论文,2004.)配制，配方为：NaCl 24.4770g，MgCl₂·6H₂O 4.9810g，Na₂SO₄ 3.9170g，CaCl₂·H₂O2.230g，NaHCO₃ 0.1920g，KCl 0.6640g，NaBO₃ 0.0260g，SrCl₂ 0.0240g，NaF0.0039g，1000mL。

实施例1

1.2.1土壤样品采集

选择好适当地点后，用小铲除掉表土，取5～10cm深处的土壤约30～50g，装入灭菌的纸袋中，编号，并注明采集地点和采集日期，用于链霉菌的分离。

1.2.2链霉菌的分离与纯化

采用平板稀释分离法(参考文献：方中达.植病研究方法[M]北京:中国农业出版社,2007,243-250)进行链霉菌的分离和纯化。为减少杂菌、尤其是细菌的污染，先将称好的10g土壤在120℃下烘烤1h，然后加入100mL无菌水中，震荡30min后，吸取1mL混悬液，用无菌水梯度稀释，从10^-3、10^-4和10^-5稀释管内分别吸取0.1mL加到高氏一号平板上，均匀涂布，然后将培养皿倒置于28℃恒温箱内培养3～10d，每天观察并挑选菌落形态各不相同的菌株及时转接到高氏一号斜面上培养，采用稀释分离法重新纯化3～5次后，编号并保存至4℃冰箱中备用。

1.2.3摇瓶发酵初筛杀虫活性菌株

发酵液的制备：将1.2.2中分离纯化的链霉菌转接至高氏一号斜面培养基上，28℃下培养7d后，使用7mm打孔器打菌饼接种至装有40mL摇瓶发酵培养基的250mL三角瓶内，28℃，150r/min，振荡培养5d，4000r/min，离心20min，取上清液过细菌过滤器去除菌体备用。

杀虫活性的测定：采用卤虫液体测定法。测定时，将卤虫卵置于人工海水中(pH8～9)，28℃活化24h。在96孔细胞培养板中分别加入0.1mL卤虫液(约20～30头卤虫)和0.1mL待测菌株的发酵液，28℃培养24h后，用双目解剖镜观察并统计卤虫死亡率，另设高氏一号液体培养基为对照。

1.2.4摇瓶发酵复筛杀虫活性菌株

供试虫源：花布灯蛾，采自大连市金狐山，本实验室继代饲养。

杀虫活性测定：采用叶片浸渍法(参考文献：左一鸣,王开运,姜兴印.4种抗生素类杀虫剂对小菜蛾不同龄期幼虫的毒力和杀卵作用[J].农药,2004,43(1):26-27)。取新鲜蒙古栎叶片用菌株发酵液浸湿，置于灭菌的培养皿中，晾干后接入2龄花布灯蛾幼虫，每皿20头，3次重复，另设浸渍未接菌发酵液培养基为空白对照(CK)。放置在人工气候培养箱(25±1℃，RH70％～80％，光周期14h/d)中饲养，48h后记录死虫数量，分别计算死亡率和校正死亡率。

实施例2

1.2.5链霉菌LKY208发酵液广谱杀虫活性的测定

对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫和甘蓝夜蛾的杀虫活性测定：采用叶片浸渍法(方法同1.2.4)。

对玉米螟的杀虫活性测定：采用饲料染毒法(参考文献：徐树兰,李辉,陈其津.甜菜夜蛾核型多角体病毒的致病力测定与群养对病毒产量的影响[J].长江蔬菜,2010(18):10-12.)。均匀切取一定大小的饲料(约为幼虫的一日食量)，将菌株发酵液拌入高压灭菌后的人工饲料中(100μL/g)，饲喂2龄玉米螟幼虫，每处理20头幼虫，重复3次。饲养条件同上，48h后在双目解剖镜下检查试虫生存或死亡情况，计算死亡率和校正死亡率，人工饲料拌清水为对照。

对二斑叶螨的杀虫活性测定：采用玻片浸渍法(参考文献：FAO.Revised Methodfor Spider Mites and Their Egg(e.g.Tetranychus spp.and Panonychus ulmi Koch)[J].FAO Plant Production and Protection,1980(21):49-54.)。将双面胶带纸剪成2～3cm的长度，贴在洁净的显微镜载玻片的一端，用镊子揭去粘胶上的纸片。用毛笔轻轻挑取大小一致、体色新鲜、行动活泼的雌成螨，将其背部粘附在双面胶带上。粘帖时注意不要粘住螨的足和口器，以使其肢体可以活动。每玻片粘二斑叶螨25头，重复4次。将粘有二斑叶螨的载玻片放置在25±1℃、RH为70～80％的人工气候培养箱中放置4h后，用双目镜观察并剔除死亡或不活泼个体。然后把粘有二斑叶螨的载玻片一端浸入发酵液中，轻轻摇动5s后取出，用滤纸吸干螨体及周围多余的液体，再置于上述的人工气候培养箱中饲养。48h后，在双目解剖镜下检查试虫生存或死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。另以粘螨玻片浸渍清水为对照。

对桃蚜的杀虫活性测定：采用叶片浸渍法。从田间采集带有试虫的甘蓝叶片，用零号毛笔清除杂物。将蚜虫和寄主叶片一同放入菌株发酵液中浸泡5s，并轻轻摇动。叶片取出后，用滤纸吸去多余液体，室温下晾干后，放入直径为9cm的培养皿内，置于人工气候培养箱中饲养。每处理30头蚜虫，重复3次，以清水浸渍为对照。48h后在双目解剖镜下检查试虫生存或死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

马铃薯瓢虫和斑须蝽的杀虫活性测定：采用常规浸虫法(参考文献：刘济宁.海洋微生物050101菌株的杀虫活性筛选及其基因重组研究.华南热带农业大学硕士学位论文,2004.)。将供试昆虫放入浸虫器中，在菌株发酵液中浸30s，取出后放入养虫瓶中，培养方法同上。每处理成虫20头，重复3次，以试虫清水浸渍为对照，饲养条件同上，48h后在双目解剖镜下检查试虫生存或死亡情况，，计算死亡率和校正死亡率，。

实施例3

1.2.6热稳定性测定

取等量菌株发酵液分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃下处理1h后取出，自然冷却后，利用浸叶法对2-3龄花布灯蛾幼虫进行杀虫活性检测，以未处理的发酵液(25℃)为对照。

实施例4

1.2.7pH稳定性测定

取等量菌株发酵液用1mol/LHCL和1mol/LNaOH分别调整pH为1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13和14，静置24h后调回原始pH7，利用浸叶法对2-3龄花布灯蛾幼虫进行杀虫活性检测。以未处理的发酵液为对照。

实施例5

1.2.8光照稳定性测定

取等量菌株发酵液分别置于日光下照射1h、2h、3h、4h、5h后，利用浸叶法对2-3龄花布灯蛾幼虫进行杀虫活性检测，以未处理的发酵液为对照。

实施例6

1.2.9耐贮性测定

取等量菌株发酵液分别在4℃、40℃、-20℃的恒温条件下贮存15d后，将发酵液恢复至原体积，利用浸叶法对2-3龄花布灯蛾幼虫进行杀虫活性检测，以未处理的发酵液(25℃)为对照。

实施例7

1.2.10菌株遗传稳定性测定

将链霉菌LKY208转接至高氏一号斜面培养基上，记为F₁代，28℃条件下培养5～6d后，再转接斜面，记为F₂代，依次继代转接直至F₆代。取上述分别培养7d的F₁、F₂、F₃、F₄、F₅、F₆代斜面培养体，按上述的发酵方法进行发酵。利用浸叶法检测各代菌株发酵液对2-3龄花布灯蛾幼虫的杀虫活性。

实施例8

1.2.11菌株鉴定

将菌种接种至高氏1号琼脂平板上，将灭菌盖玻片以45o斜插在培养基中，28℃培养5～7d后，取出盖玻片，在光学显微镜下直接观察；同时，选择菌丝生长疏密适中，但气生菌丝和孢子丝发育良好的部分，真空喷镀制片后，用扫描电镜观察孢子链和孢子形态及表面结构，处理方法参考文献中的方法。(参考文献为：杨瑞,王岐,张露,等.放线菌扫描电镜样品制备方法比较研究[J].电子显微学报,2014.33(1):84-89.)

参照树脂型^TM基因组DNA提取试剂盒(购置于天根生化科技有限公司)说明书提取DNA，以提取DNA为模板，设计引物扩增16S rDNA，上游引物序列为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.1)，下游引物序列为：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO.2)，由宝生物(大连)工程有限公司合成。50μL PCR反应体系：PCR Mixture 25μL、Template 2μL、上下引物各1μL、ddH₂O 21μL。PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸2min，35次循环；72℃延伸5min，4℃保存，以无菌水的PCR产物为阴性对照，以已知16S rDNA的菌株PCR产物为阳性对照，上样量2μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。回收产物送至宝生物(大连)工程有限公司进行双向测序，序列经BioEdit 7.0.1等软件分析和手工校正后，用NCBI的BLAST程序将测出的序列与在GenBank中下载的已知相似模式菌种的序列进行同源性比较分析，并用MEGA 6.0软件的邻接法(neighbor-joining，NJ)进行序列比对并绘制系统发育树图。

上述实施例采用SPSS 17.0进行数据统计，Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2上述各实施例的结果与分析

2.1链霉菌的分离与纯化

链霉菌在土壤中的分布十分广泛，在常规分离过程中，菌株的数量很大，无法全部保留。因此，在挑选菌落时，主要选取菌落形态及色素颜色不同的菌株转管保存，从采集的30份土壤样品中共分离得到217株链霉菌菌株。经过2～3次平板纯化后，获得了形态颜色一致的纯化菌株。将这些菌株在高氏一号斜面培养基中培养，4℃保存，作为原始菌株备用。

2.2摇瓶发酵初筛结果

将分离得到的217株链霉菌菌株进行摇瓶发酵。通过卤虫活性测定，得到11株对卤虫致死率达50％以上的菌株，其中编号LKY208号菌株，效果最好，达94.7％(表2)，将初筛获得的活性菌株转管，另行保存备用。

表2杀虫活性链霉菌菌株的初筛结果

表2中数据为平均数±标准差。

2.3摇瓶发酵复筛结果

将初筛获得的对卤虫具有较高活性的链霉菌菌株进行摇瓶发酵培养，制备其发酵液，以花布灯蛾幼虫为靶标进行杀虫活性测定，48h后的观察结果显示，菌株LKY208具有较高的杀虫活性，显著高于其他供试菌株。上述菌株发酵液对花布灯蛾幼虫的校正死亡率都在70％以上(表3)。

表3杀虫活性链霉菌菌株的复筛结果

表3中数据为平均数±标准差。同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差方法检验在P<0.01水平差异显著，下同。

2.4链霉菌LKY208发酵液杀虫活性的测定

分别测定了菌株LKY208发酵液对不同农林害虫的杀虫活性。研究结果表明，菌株LKY208发酵液对鳞翅目花布灯蛾幼虫的杀虫活性最高，48h的校正死亡率可达74.1％，对美国白蛾的校正死亡率达72.1％，对小菜蛾幼虫的杀虫活性仅次于花布灯蛾幼虫和美国白蛾幼虫，校正死亡率为69.5％，与其他试虫相比，差异显著，对二斑叶螨亦具有较好的杀虫活性，48h的校正死亡率达56％；对鳞翅目菜青虫和甘蓝夜蛾48h的校正死亡率分别为43.9％和36.5％；但对同翅目害虫桃蚜、半翅目害虫斑须蝽以及鞘翅目害虫马铃薯瓢虫等杀虫作用不如对其他害虫的杀虫作用明显(如表4所示)。

表4菌株LKY208发酵液杀虫活性的测定结果

2.5链霉菌LKY208发酵液及菌株稳定性测定

2.5.1热稳定性测定

经不同温度处理后，菌株LKY208发酵液的杀虫活性略有变化。温度低于50℃时，发酵液对花布灯蛾的杀虫活性较好，保持了很好的稳定性，但当温度高于50℃时，杀虫效果有所下降(图1)，但即使温度达到100℃，LKY208发酵液仍然具有杀虫活性。

2.5.2pH稳定性测定

在pH 1～14范围内，菌株LKY208的发酵液随着pH的改变对花布灯蛾幼虫的杀虫活性稍有变化。当pH为7时发酵液的杀虫活性最高，在pH小于7时，发酵液杀虫活性略有降低，但当pH超过9时，菌株发酵液的杀虫活性显著降低(如图2所示)，因此菌株发酵液在偏酸和中性条件下活性稳定，且明显高于发酵液在碱性条件下。

2.5.3光照稳定性测定

菌株LKY208的发酵液经不同光照时间处理后，其对花布灯蛾的杀虫活性差异变化比较小(如图3所示)，说明菌株LKY208发酵液中的杀虫活性物质在光照条件较稳定，不易分解。

2.5.4耐贮性测定

菌株LKY208的发酵液在50℃、4℃、-20℃、25保存15d后，对花布灯蛾的杀虫活性与对照相比，活性几乎没有降低。因此菌株发酵液具有可贮藏性，可以长期保存，以4℃低温贮藏效果最好(如图4所示)。

2.5.5遗传稳定性测定

试验结果表明，链霉菌LKY208继代培养的发酵液对花布灯蛾的杀虫活性与原始菌株相比，表现了极强的遗传稳定性(如图5所示)。

2.6菌株鉴定

2.6.1菌株LKY208形态学鉴定

菌株LKY208在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，28℃培养1～2d时，菌落光滑、无孢子生成，第3d开始可见气丝黄绿色、淡黄绿色、淡黄色，4d后基质颜色逐渐变为黄色。在显微镜下观察，基内菌丝无横膜，不断裂；电镜观察结果表明孢子丝短，时常不规则，偶见短而松散螺旋状，孢子椭圆形、柱形，表面光滑或不规则褶皱(如图6所示)，根据形态特征初步分析菌株LKY208为链霉菌属。

2.6菌株LKY208的16S rRNA鉴定

对菌株LKY208的16S rDNA基因序列进行PCR扩增、纯化、测序后，测得其序列长度为1388bp。与GenBank数据库的16S rDNA序列相比，与雷格链霉菌Streptomyces regensis的同源性最高，相似值均在99％以上。选择与菌株LKY208同源性较高的10个菌株，建立系统发育树，结果表明，菌株LKY208与Streptomyces regensis strain NBRC(GenBank：NR112402.1)等4个菌株，聚在一个分支，亲缘关系最近，因此初步鉴定菌株LKY208为雷格链霉菌(MH473142)(如图7所示)。

3.结论与讨论

随着害虫生物防治研究的不断发展，从微生物的代谢产物中寻找杀虫活性物质已成为国内外研究的热点之一。放线菌在自然界中分布广泛，代谢产物种类丰富，是产生抗生素类活性物质最多的一类微生物，而链霉菌又是放线菌中产生抗生素最多的一个属。因此，从链霉菌中筛选高效杀虫活性物质产生菌株具有非常好的开发应用前景。

土壤是链霉菌栖居的重要场所，从土壤中筛选获得产生活性物质的链霉菌是新型杀虫抗生素研究与开发中必不可少的前期基础工作。而自然界的链霉菌资源十分庞大，要想从中筛选到理想的生防菌株，工作量也是十分巨大的，且结果不可预期。传统的杀虫抗生素的筛选都是以目标昆虫作为筛选测定的试验昆虫，由于目标昆虫的作用靶点广泛，因此有利于各种杀虫活性成分的检出，但是相对比较耗费人力及物力。利用小型活体动物进行早期初筛，继而用与结构或机理有关的模型进行复筛是目前被广泛认可的筛选策略。

本申请利用稀释分离法从采集到的各类土壤样品中共分离到217株链霉菌，以卤虫为初筛指示生物，通过摇瓶发酵初筛，获得11株对卤虫致死率达50％以上的链霉菌菌株，以花布灯蛾为复筛指示昆虫，筛选到了具有较高杀虫活性的菌株LKY208，链霉菌LKY208对花布灯蛾的杀虫效果明显，48h的校正死亡率可达70％以上，具有很好的研究和开发前景。

同时利用各种室内生物测定方法，测定了链霉菌LKY208菌株发酵液对多种昆虫的了杀虫效果。结果表明，菌株LKY208发酵液对花布灯蛾的杀虫活性最高，48h的校正死亡率可达74.1％，对美国白蛾具有较好的杀虫活性，48h的校正死亡率为72.1％；对菜青虫和甘蓝夜蛾也有一定的生物活性；但对桃蚜、斑须蝽以及马铃薯瓢虫等杀虫作用不如对其他害虫的杀虫作用明显。这可能是因为本试验所研究的杀虫物质是由微生物代谢产生的，而微生物的次生代谢产物对昆虫的毒杀作用具有较高的选择性，一般一类次生代谢产物可能只对某些种类的昆虫有作用。

对菌株LKY208发酵液进行的稳定性试验结果表明，菌株LKY208发酵液在50℃以下、pH为偏酸性和中性条件下杀虫活性比较稳定；具有良好的光照稳定性、耐贮藏性和遗传性能稳定。因此，菌株LKY208具有很好的潜在研究开发价值，其发酵产生的杀虫物质在开发生物杀虫剂方面有着良好的前景。

随着分子遗传学和分子生物技术的迅速发展，放线菌的分类学已经从经典的形态分类进入了分子分类时代。目前16SrDNA已经成为一个分子指标，广泛地被用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究，可以通过对未知微生物的DNA序列的测定和比较分析，快速而有效地达到分类鉴定的目的。其中16SrDNA是生物细胞所共有的，功能同源且最古老、遗传较为稳定、代表信息量适中、分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应，是研究系统进化的好材料，在放线菌分类鉴定工作中越来越重要。

本试验利用16SrDNA在不同链霉菌中的拷贝数、片段长度和碱基序列的同源性对菌株LKY208进行了分类鉴定，将菌株LKY208定名为链霉菌属雷格链霉菌(Streptomycesregensis)，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.16746。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林省林业科学研究院

<120> 一种生防制剂的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (8)

1.一种生防制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：发酵保藏编号为CGMCCNo.16746的雷格链霉菌(Streptomyces regensis)，得到发酵液。

2.根据权利要求1所述生防制剂的制备方法，其特征在于，发酵过程中的温度为25～28℃。

3.根据权利要求1所述生防制剂的制备方法，其特征在于，还包括离心发酵液的步骤。

4.根据权利要求1所述生防制剂的制备方法，其特征在于，还包括将发酵液冻干的步骤。

5.根据权利要求1-4任一项所述生防制剂的制备方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.16746的雷格链霉菌接种至高氏一号斜面培养基上培养，再将培养得到的菌饼接种至发酵培养基进行培养，之后收集发酵液。

6.根据权利要求5所述生防制剂的制备方法，其特征在于，所述高氏一号斜面培养基的配方包括：每1000mL蒸馏水包括可溶性淀粉20g，K₂HPO₄0.5g，KNO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂20g，pH7.0～7.2。

7.根据权利要求5所述生防制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方包括：花生饼粉2.5％、可溶性淀粉5.0％、酵母粉0.08％、葡萄糖0.02％、(NH₄)₂SO₄ 0.08％、NaCl 0.2％、CaCO₃ 0.32％，pH 7.0～7.2，溶剂为水。

8.根据权利要求5所述生防制剂的制备方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCCNo.16746的雷格链霉菌接种至高氏一号斜面培养基上，28℃条件培养7d后，取菌饼接种至发酵培养基中，温度为28℃，振荡培养5d。

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