CN108179123A - 一株白眉野草螟罹病虫体来源的粘质沙雷氏菌及其应用 - Google Patents

一株白眉野草螟罹病虫体来源的粘质沙雷氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株白眉野草螟罹病虫体来源的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9，该菌株已于2017年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为：CGMCC NO.15020。本发明提供的粘质沙雷氏菌JY9菌株，其发酵培养获得的发酵液及菌悬液、上清液均可应用于白眉野草螟、麦长管蚜的防治，其LB培养基中培养16h的发酵液在菌浓度为6×108cfu/ml时，对白眉野草螟老熟幼虫致死率可达55％以上，且用其发酵上清液直接喷施麦苗处理4d，对麦长管蚜的防效可达50％以上。

Description

一株白眉野草螟罹病虫体来源的粘质沙雷氏菌及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株白眉野草螟罹病虫体来源的粘质沙雷氏菌及其应用。
背景技术
鳞翅目是昆虫纲的第二大目，螟蛾科是鳞翅目中的一个大科，隶属该科的白眉野草螟[Agriphila aeneociliella(Eversmann,1844)]，是近年新发小麦害虫。自该虫2009年发生以来，该虫在莱州市呈蔓延暴发之势，到2012年莱州发生6000多亩，对苗期小麦造成较大危害，可致受害麦苗茎秆断开，麦苗萎蔫枯死，形成缺苗断垄，严重地块50％以上的麦苗死亡，甚至绝产。2013年3月在山西晋城又发现该种害虫为害小麦，发生面积近万亩，300余亩麦田严重缺苗断垄。2014年在山东高密小麦田发生为害，2015年蔓延至青岛即墨，发生面积近千亩，部分麦田严重缺苗断垄，2016年，2017年发生面积同期逐年扩大。每年造成巨大经济损失，对小麦安全生产造成了严重威胁。目前主要依靠辛硫磷、毒死蜱等化学防治方法对白眉野草螟进行防控，防治时通常采用灌根或撒施毒土的形式。防治方法不仅缺乏针对性，而且污染土壤及水资源。
麦长管蚜Sitobion avenae(Fabricius)，属同翅目，蚜科。分布在中国各产麦区。寄主于小麦、大麦、燕麦，南方偶害水稻、玉米、甘蔗、获草等。前期集中在叶正面或背面，后期集中在穗上刺吸汁液，致受害株生长缓慢，分蘖减少，千粒重下降，是麦类作物重要害虫，也是麦蚜中的优势种。
通过化学杀虫剂控制小麦害虫，不仅生产成本高，而且对生态平衡也会造成破坏，对人、畜健康危害严重，农药残留还会对人类生存环境造成长期影响，害虫也产生了抗药性。因此，寻找有效的生物防治措施具有十分重要的意义。昆虫病原细菌种类有100种左右。细菌杀虫剂是应用最早的微生物农药，且与真菌相比，细菌易培养，繁殖力强，毒素见效快，与化学农药相比毒性较低，对环境安全，在植物病虫害防治中发挥着重要作用。
粘质沙雷氏菌是一种广泛存在于自然界中的细菌，目前，因其对昆虫的高致病性和对害虫生物防治的巨大潜力而受到国内外学者的广泛关注，已有研究表明，粘质沙雷氏菌可感染棉铃虫、烟青虫、白蚁、蝗虫、天牛、红棕象甲、黄曲条跳甲等多种害虫，是一类重要的昆虫病原细菌。其同属细菌嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)现已开发为微生物杀虫剂产品，广泛用于金龟甲的生物防治，但目前尚未有从小麦害虫中分离出粘质沙雷氏菌以及对小麦害虫白眉野草螟和麦长管蚜具有致病作用的病原性细菌资源的分离和致病机制的研究报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，从白眉野草螟罹病幼虫虫体体液中分离筛选出一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9，该菌株对白眉野草螟和麦长管蚜均具有较好的防治效果，为细菌杀虫剂的研究开发提供了新的菌株来源。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9，该菌株已于2017年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.15020。
所述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9分离自白眉野草螟罹病幼虫虫体体液，具有如下特征：
在LB培养基上28℃生长16-48h，菌落凸起，中心不透明，为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不产生红色色素，在血平板上培养时不溶血；菌体革兰氏染色阴性，短杆状，周生鞭毛，无荚膜，无芽孢，细胞长0.9-1.8μm，宽0.5-1.0μm。
本发明的第二方面，提供上述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9的培养方法，所述培养方法包括：固体培养法和液体培养法；
其中，所述固体培养法为：将无菌水稀释后的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)JY9凃板于LB固体培养基，置于28-37℃，黑暗培养12-48h；
所述液体培养法为：粘质沙雷氏菌JY9接种到LB液体培养基中，置于摇床28-37℃，120-200rpm转速，培养10-72h。
本发明的第三方面，提供粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9的发酵液、菌悬液和/或上清液。
所述发酵液具体可为如下方法制备的发酵液：将粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)JY9接种到LB液体培养基中，发酵培养10-72h。
所述菌悬液具体可为如下方法制备的菌悬液：将发酵液离心后，菌体沉淀用无菌水重悬，获得菌悬液。
所述上清液具体可为如下方法制备的上清液：将发酵液离心后，取上清，过滤，获得上清液。
本发明的第四方面，提供上述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9在防治小麦害虫中的应用。
优选的，所述小麦害虫为白眉野草螟和/或麦长管蚜。
本发明的第五方面，提供上述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9的发酵液、菌悬液和/或上清液在制备防治白眉野草螟和/或麦长管蚜的制剂中的应用。
本发明的第六方面，提供一种生防制剂，其活性成分为上述的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)JY9、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9的发酵液、菌悬液和/或上清液。
作为优选，生防制剂的剂型为可湿性粉剂、水分散剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
作为优选，生防制剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂中的一种或多种。本发明对于所述农药学上可接受的辅料的来源没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
上述生防制剂在防治白眉野草螟和/或麦长管蚜中的应用也是本发明的保护范围。
本发明的有益效果：
本发明首次从白眉野草螟罹病幼虫虫体中分离得到了一株对白眉野草螟具有较高防控效果的粘质沙雷氏菌菌株JY9。通过对分离得到的粘质沙雷氏菌JY9菌株对白眉野草螟幼虫及麦蚜的毒力进行测定，研究发现，粘质沙雷氏菌JY9菌株对白眉野草螟及麦长管蚜的防控效果均可达50％以上。该菌株的使用有望对有效减少化学农药的使用量，对麦田病虫害的绿色防控起到积极作用。
附图说明
图1：实施例1中通过MEG 5.0软件构建获得的系统发育树。
图2：粘质沙雷氏菌菌株JY9发酵液OD600值随培养时间变化的生长曲线。
图3：粘质沙雷氏菌菌株JY9对白眉野草螟的防治能力测定结果。
图4：粘质沙雷氏菌菌株JY9对麦长管蚜的防治能力测定结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，由于白眉野草螟是我国一种新发生的小麦害虫，现有的防治方法缺乏针对性，且通过化学杀虫剂控制小麦害虫，不仅会对生态环境造成破坏，还会对人畜健康产生危害。因此，寻找有效的生物防治措施具有十分重要的意义。虽然目前有报道粘质沙雷氏菌可以感染多种害虫，但由于不同分离来源的粘质沙雷氏菌的性能差异显著，其功能具有不可预期性，再加之目前尚未有从小麦害虫中分离出粘质沙雷氏菌的报道，因此，开发能够防治白眉野草螟、麦长管蚜及小麦其他害虫的生防制剂的难度较大。
本申请是发明人在对白眉野草螟进行相关研究饲养时，偶然发现当饲养容器中某一白眉野草螟幼虫感染病菌死亡后，饲养于同一容器中的其他幼虫会相继死亡，死亡症状相同。于是发明人从白眉野草螟罹病幼虫虫体体液中进行分离筛选，最终分离得到一株能有效使白眉野草螟幼虫及麦长管蚜的活力下降或患病死亡，对白眉野草螟、麦长管蚜具有较好的防治效果的粘质沙雷氏菌JY9。
本发明的粘质沙雷氏菌JY9以其细胞及其分泌物作为有效成分，从而起到对白眉野草螟和麦长管蚜的防治效果。经试验验证，粘质沙雷氏菌JY9在LB培养基中培养16h的发酵液(菌浓度为6×108cfu/ml)时，对白眉野草螟老熟幼虫致死率可达55％以上；且用其发酵上清液直接喷施麦苗处理4d，对麦长管蚜的防效可达50％以上。
本发明的粘质沙雷氏菌JY9可采用固体培养和液体培养两种方法进行培养。在本发明的一种实施方案中，所采用的固体培养方法为：将无菌水稀释后的粘质沙雷氏菌JY9，凃板或划线于LB固体培养基，置于28-37℃条件下，遮光培养12-48h。作为优选，置于28℃条件下，遮光培养16h。
在本发明的另一种实施方案中，所采用的液体培养方法为：a.挑取LB固体培养基培养的粘质沙雷氏菌JY9单菌落，接种于LB液体培养基中，置于摇床28-37℃，120-200rpm条件下培养10-72h；优选置于28℃，180rpm，培养16h。b.用移液枪吸取a方法培养的粘质沙雷氏菌JY9菌液，按1％的接种量接种于灭菌LB液体培养基中，置于摇床28-37℃，120-200rpm条件下培养10-72h；优选置于28℃，180rpm，培养16h。
本发明的粘质沙雷氏菌JY9其发酵培养获得的发酵液及菌悬液、上清液均可应用于白眉野草螟、麦长管蚜的防治。其中：
粘质沙雷氏菌JY9的发酵液可以采用如下方法制备：
a.挑取LB固体培养基培养的粘质沙雷氏菌JY9单菌落，接种于LB液体培养基中，置于摇床28-37℃，120-200rpm条件下培养10-72h；优选置于28℃，180rpm，培养48h；
b.用移液枪吸取a方法培养的粘质沙雷氏菌JY9菌液，按1％的接种量接种于灭菌LB液体培养基中，置于摇床28-37℃，120-200rpm条件下培养10-72h；优选置于28℃，180rpm，培养48h。
粘质沙雷氏菌JY9的菌悬液可采用如下方法制备：
取粘质沙雷氏菌JY9发酵液于离心管中，置于离心机中，8000-12000rpm，离心4-10min，弃上清，用无菌水重悬即得重悬液；优选8000rpm，离心4min。
粘质沙雷氏菌JY9的上清液可采用如下方法制备：
取粘质沙雷氏菌JY9发酵液于离心管中，置于离心机中，8000-12000rpm，离心4-10min，取上清，经0.22μm孔径滤膜过滤后，即为粘质沙雷氏菌JY9发酵上清液；优选12000rpm，离心10min。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
其中，小麦品种为“鲁麦21”，由山东农业大学植物保护学院昆虫行为与化学生态学研究室提供；麦长管蚜，由山东农业大学植物保护学院昆虫行为与化学生态学研究室实验室提供；DNA分子标记(DNAMarker)、PCR扩增试剂以及细菌基因组DNA提取试剂盒，由北京全式金生物技术有限公司提供；细菌通用引物，由铂尚生物技术(上海)有限公司提供；细菌微量生化反应管，由杭州滨和微生物试剂有限公司提供；PCR仪，由美国Bio-Rad公司提供，型号T100TM Thermal Cycler；电泳仪，由北京六一生物科技有限公司提供，型号DYY-6C型；全自动凝胶成像系统，由北京赛智创业科技有限公司提供，型号Champ Gel 6000；生物分光光度计，由德国eppendorf公司提供，型号Bio Photometer；DHZ-C恒温振荡器，由江苏太仓市实验设备厂提供；离心机，由德国eppendorf公司提供，型号Centrifuge 5810R；透射式电子显微镜(透射电镜-1400Plus)，由日本电子株式会社(JEOL)提供。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，去离子水1L，调节pH值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌15-20min。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，去离子水1L，调节pH值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌15-20min。
实施例1：菌株的分离和鉴定
1.菌株的分离：
(1)将罹病的白眉野草螟幼虫用75％酒精浸泡10s，进行体表消毒，后用无菌水冲洗3次，将其放入无菌培养皿中，用灭菌后的手术剪剪掉其中一只足端部，用移液器吸取溢出的体液5μl，加入495μl无菌水中稀释，之后继续加无菌水稀释，分别形成无菌水稀释度为1:102、1:103、1:104、1:105的稀释液，最后进行充分振荡；
(2)吸取步骤(1)中稀释度为1:102、1:103、1:104、1:105的稀释液各50μl，涂布于无抗的LB固体培养基中，置于28℃条件下培养24h；
(3)挑取经24h培养后长出的单菌落，然后在LB固体培养基上纯培养，获得菌株JY9。
2.菌株的鉴定：
(1)形态学鉴定：
对上述处于对数生长期的菌株JY9采用革兰氏染色法进行染色，通过光学显微镜观察其形态学特征，同时取处于对数生长其的菌株JY9采用磷钨酸负染法对其进行负染，后用透射电镜进行观察。
通过观察，菌株JY9菌体革兰氏染色阴性，短杆状，周生鞭毛，无荚膜，无芽孢，细胞长0.9-1.8μm，宽0.5-1.0μm。在LB培养基上28℃生长16-48h，菌株JY9的单菌落菌落凸起，中心不透明，乳白色，表面光滑，边缘整齐，不产生红色色素。
(2)溶血特性检测：
用于菌株JY9溶血性测定的血平板由北京陆桥技术股份有限公司提供；取菌株JY9新鲜菌液，在血平板上对其进行划线培养，重复3次，并设LB空白对照3组，将其置于28-37℃条件下黑暗培养12-24h，观察菌落周围有无溶血环。
通过观察，菌株JY9不产生溶血素，在血琼脂平皿上的菌落周围无溶血环，为γ溶血，即对红细胞无溶解能力。
(3)生理生化特性分析：
采用杭州滨和微生物试剂有限公司提供的细菌微量生化反应管，参照其细菌微量生化反应管使用说明书，对菌株JY9对阿拉伯糖、棉子糖、木糖的生理生化反应特性进行测定，结果显示菌株JY9对阿拉伯糖、棉子糖、木糖的反应均为阴性。
(4)分子鉴定：
菌株JY9的PCR扩增：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取步骤1中分离得到的菌株JY9的16S rDNA作为PCR扩增模版，利用PCR仪并以细菌通用引物，27F
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’进行16SrDNA的扩增。
在上述扩增过程中，扩增体系为50μl：10×Buffer 5μl，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)2μl，细菌通用引物(primer)27F 1μl，细菌通用引物(primer)1492R 1μl，Easy TaqDNA聚合酶0.5μl，扩增模版DNA2μl，加双蒸水38.5μl补至50μl；PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性40s，52℃复性40s，72℃延伸1min 40s循环32次，最后72℃后延伸10min，4℃保存。
PCR扩增产物的凝胶成像检测：取5μl PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳测试。
目的片段测序：经琼脂糖凝胶电泳测试有目的条带后，将扩增产物交由铂尚生物技术(上海)有限公司进行16S rDNA测序，通过NCBI网站BLAST进行序列同源性检索分析。将测序结果与GenBank数据库中相关菌株的16S rDNA进行比较后，用MEGA5.0软件构建系统发育树，从而确定菌株JY9的分类学地位。
根据图1所示的结果，发现菌株JY9与GenBank登录号为KT741017.1的粘质沙雷氏菌株(Serratia marcescens)同源性高达100％。
注：GenBank是美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnologyInformation，NCBI)建立的DNA序列数据库，从公共资源中获取序列数据，MEGA5.0是专用于构建系统发育树的软件，BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具，一般以同源性≥99％作为种水平的鉴定标准。
基于上述对菌株JY9的形态学鉴定和16S rDNA序列同源性分析结果，结合其对木糖、棉子糖、阿拉伯糖均显示阴性反应的生理生化特性(粘质沙雷氏菌与同属中其他种的主要区别是阿拉伯糖、棉子糖、木糖均为阴性)，将分离得到的细菌JY9鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：
菌种名称：粘质沙雷氏菌
拉丁名：Serratia marcescens
菌株编号：JY9
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2017.12.05
保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.15020。
实施例2：菌株JY9发酵液OD600值随培养时间变化的生长曲线测定
取实施例1获得的JY9菌株平板上的单菌落接种到装有100ml LB培养基的三角瓶中，培养温度为28℃、摇床转速180rpm、培养时间12h，得到粘质沙雷氏菌JY9发酵液，加入LB稀释，将该发酵液液调节其OD600值为1.0(此时菌浓度约为6×108cfu/ml)，将其按1％的接种量接种于装有2ml LB的150个5ml离心管中，均置于28℃、转速180rpm的摇床中，振荡培养48h，同时，前4h每0.5h取3支离心管，之后每隔2h取3支离心管，分别测定其OD600值。绘制粘质沙雷氏菌菌株JY9发酵液OD600值随培养时间变化的生长曲线(图2)。
由图2可以看出，随着培养时间的延长，粘质沙雷氏菌JY9在培养3h后即进入对数生长期，并在进入对数生长期后的7小时内达到稳定期，说明其在LB中生长状态良好。
实施例3：粘质沙雷氏菌菌株JY9对白眉野草螟的防治能力测定
1.试验方法：
(1)制备菌株JY9发酵液：
将在28℃的条件下LB固体培养基划线培养16h的菌株JY9单菌落接种至6ml LB液体培养基中，置于摇床28℃，180rpm条件下培养16h，作为种子液，然后，用移液枪吸取100μl粘质沙雷氏菌JY9种子液，按1％(体积比)的接种量接种于100ml灭菌LB液体培养基中，置于摇床28℃，180rpm条件下培养16h，获得菌株JY9的发酵液。
(2)制备处理液：
1)取上述(1)中制备的菌株JY9发酵液10ml，调节其OD600值为1.0(其菌浓度约为6×108cfu/ml)，作为处理液一；
2)取上述(1)中制备的菌株JY9发酵液30ml于离心管中，置于离心机中，8000rpm离心4min，菌体沉淀用3ml无菌水重悬，得菌株JY9菌悬液。
将菌株JY9菌悬液稀释成OD值分别为0.2、0.6、1.0的重悬液各10ml，分别作为处理液二、三、四；
3)菌株JY9发酵上清液制备：取上述(1)中制备的菌株JY9发酵液10ml于离心管中，置于离心机中，12000rpm，离心10min，取上清，经0.22μm孔径滤膜过滤后，获得菌株JY9发酵上清液，作为处理液五；
4)另取无菌水及灭菌LB液体培养基各10ml，分别作为对照液一及对照液二。
(3)小麦幼苗的培养：
将小麦种子置于55℃温水中，浸泡1d后，将萌芽的种子种植于育苗盘中，将其在室温下水培10-13d，即可作为饲虫食物。
(4)试验处理：
将白眉野草螟5-6龄幼虫分成五个处理组和两个对照组，每个处理30头。各处理组和对照组分别用处理液一至五、对照液一及对照液二用喷瓶距离虫体15cm处喷施。
处理后将试虫单头饲养，放在光照培养箱中，饲养条件为温度23-25℃、光周期L:D＝14h:10h，每天每头幼虫喂食量为1-2株10-13d的小麦幼苗，更换新食物时将前一天未食尽的食物及所产虫粪清除。10d后，统计各组白眉野草螟幼虫存活情况，同时按照下述公式据算白眉野草螟幼虫校正死亡率：
其中，采用处理液一及处理液五进行处理的处理组，以灭菌LB液体培养基(即对照液二)作为对照组；采用处理液二、三、四进行处理的处理组，以无菌水(即对照液一)作为对照组。
2.试验结果：
菌株JY9对白眉野草螟的防治能力测定结果见图3，由图3可以看出，处理液一、二、三、四、五对白眉野草螟的校正死亡率分别为：58.9％、6.9％、55.2％、44.8％、10.7％。说明对于培养16h的粘质沙雷氏菌菌株JY9，其发酵液对白眉野草螟幼虫的毒力最强，在其菌浓度为6×108cfu/ml时，对白眉野草螟老熟幼虫致死率可达55％以上。其上清液及菌体均对白眉野草螟具有一定杀虫能力。
实施例4：粘质沙雷氏菌菌株JY9对麦长管蚜的防治能力测定
1.试验方法：
(1)制备菌株JY9发酵液：
将在28℃的条件下LB固体培养基划线培养16h的菌株JY9单菌落接种至6ml LB液体培养基中，置于摇床28℃，180rpm条件下培养16h，作为种子液，然后，用移液枪吸取100μl粘质沙雷氏菌JY9种子液，按1％的接种量接种于100ml灭菌LB液体培养基中，置于摇床28℃，180rpm条件下培养16h，获得菌株JY9的发酵液。
(2)制备处理液：
1)取上述(1)中制备的菌株JY9发酵液10ml，调节其OD600值为1.0(其菌浓度约为6×108cfu/ml)，作为处理液一；
2)取上述(1)中制备的菌株JY9发酵液20ml于离心管中，置于离心机中，8000rpm离心4min，菌体沉淀用2ml无菌水重悬，随后稀释成OD值为1.0的重悬液10ml，获得菌株JY9菌悬液，作为处理液二；
3)取上述(1)中制备的菌株JY9发酵液10ml于离心管中，置于离心机中，12000rpm，离心10min，取上清，经0.22μm孔径滤膜过滤后，获菌株菌JY9发酵上清液，作为处理液三；
4)另取无菌水及灭菌LB液体培养基各10ml，分别作为对照液一及对照液二。
(3)小麦幼苗及麦长管蚜的培养：
将小麦种子置于55℃温水中，浸泡1d后，将萌芽的种子每6-8粒均匀分布种植于一个90mm×55mm×80mm花盆中，重复15盆，将其在室温下培养10d后，接种麦长管蚜，每盆接种麦长管蚜不少于30头。
(4)试验处理：
将上述(2)中得到的各处理液及对照液直接用喷瓶在距离麦苗15cm处喷施于接种麦长管蚜的麦苗上，每盆为一个处理，每处理不少于20头麦长管蚜，重复三次。4d后，统计各组麦长管蚜存活情况及数量，同时按照下述公式据算麦长管蚜校正死亡率：
其中，采用处理液一及处理液三进行处理的处理组，以灭菌LB液体培养基(即对照液二)作为对照组；采用处理液二进行处理的处理组，以无菌水(即对照液一)作为对照组。
2.试验结果：
菌株JY9对麦长管蚜的防治能力测定结果见图4，由图4可以看出，处理液一、二、三对麦长管蚜的校正死亡率分别为：43.8％、11.6％、54.9％。说明粘质沙雷氏菌菌株JY9对麦长管蚜起杀虫作用的活性成分主要可能存在于粘质沙雷氏菌JY9的发酵上清液(JY9分泌物)中，且其菌浓度为6×108cfu/ml时，对麦长管蚜的防效可达50％以上。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JY9，其生物保藏号为：CGMCC NO.15020。
2.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：固体培养法和液体培养法；
所述固体培养法为：将无菌水稀释后的粘质沙雷氏菌JY9凃板于LB固体培养基，置于28-37℃，黑暗培养12-48h；
所述液体培养法为：粘质沙雷氏菌JY9接种到LB液体培养基中，置于摇床28-37℃，120-200rpm转速，培养10-72h。
3.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的发酵液、菌悬液和/或上清液。
4.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌在防治小麦害虫中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述小麦害虫为白眉野草螟和/或麦长管蚜。
6.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌和/或权利要求3所述的发酵液、菌悬液和/或上清液在制备防治白眉野草螟和/或麦长管蚜的制剂中的应用。
7.一种生防制剂，其活性成分为权利要求1所述的粘质沙雷氏菌或权利要求3所述的粘质沙雷氏菌的发酵液、菌悬液和/或上清液。
8.根据权利要求7所述的生防制剂，其特征在于，所述生防制剂的剂型为可湿性粉剂、水分散剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
9.根据权利要求7或8所述的生防制剂，其特征在于，生防制剂中还包括农药学上可接受的辅料。
10.权利要求7-9任一项所述的生防制剂在防治白眉野草螟和/或麦长管蚜中的应用。
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