CN112695001B - 一株对夜蛾科害虫具有高毒杀活性的苏云金芽胞杆菌及应用 - Google Patents
一株对夜蛾科害虫具有高毒杀活性的苏云金芽胞杆菌及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物农药领域，涉及一株对夜蛾科害虫具有高毒杀活性的苏云金芽胞杆菌及应用，本发明所涉及的对多种夜蛾科害虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌NBI‑616菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2020771。生物测定表明，苏云金芽胞杆菌NBI‑616对草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫及小菜蛾的幼虫具有高毒杀活性。采用常规的发酵‑离心浓缩‑喷雾干燥工艺，制备了苏云金芽胞杆菌NBI‑616高含量原粉。本发明所涉及的菌株可用于开发防治夜蛾科害虫的微生物农药。
Description
技术领域
本发明属于生物农药领域，具有涉及一株对夜蛾科害虫具有高毒杀活性的苏云金芽胞杆菌及应用。
背景技术
夜蛾科(Noctuidae)是鳞翅目(Lepidoptera)中最大的科，世界约有3.5万种左右，其中中国夜蛾已知约3751种(冯博涛et al.,2019)。草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(Spodoptera lituraFabricius)和棉铃虫(Hel icoverpaarmigera)等同属鳞翅目夜蛾科，是我国重要农林业害虫(陈秀红et al.,2020)。
近年来，又以草地贪夜蛾危害最为严重。草地贪夜蛾是玉米和其他主要经济作物上重要的迁飞性害虫之一(Cruz et al.,2012,Nagoshi et al.,2015,Young andMcMillian,1979)。具有寄主广泛、适生范围广泛、迁飞速度快、繁殖能力强、防控难度大等特点，在国际上有“无敌破坏王”之称，是联合国粮农组织全球预警的迁飞性农业重大害虫(Jacobs et a l.,2018)。主要为害水稻、玉米、甘蔗高粱、大豆等186种重要农作物(Montezano et al.,2018,姜玉英et al.,2019)。2016年起，草地贪夜蛾散播至非洲、亚洲各国，已在多国造成巨大的农业损失。并于2019年1月起出现在中国大陆，截至7月11日，目前已在21个省的1177个县发现，发生面积超过500万亩(张磊et al.,2019)。其危害的潜在风险较大，今后在我国有可能常态化发生(姜玉英et al.,2019)，将对华南、黄淮海及北方玉米主产区的玉米生产和我国粮食生产安全构成严重威胁(杨普云et al.,2019)。而甜菜夜蛾、斜纹夜蛾是重要的蔬菜害虫，严重威胁叶菜的生产。由于转基因棉花的种植，棉铃虫转而为害玉米、花生及茄科蔬菜，如蕃茄、辣椒等。
为防止害虫抗药性、农残超标和环境污染问题的发生，减少化学农药使用，减缓抗药性产生，寻找安全、高效的可持续控制微生物农药成为夜蛾防治的重要发展方向。目前，应用较广的微生物源杀虫剂主要包括多杀霉素、阿维菌素和苏云金芽胞杆菌制剂(Bt制剂)等。二十世纪七十至八十年代起，Bt制剂已经广泛应用于鳞翅目害虫的防治。国际上常用的Bt制剂大多源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种菌株(Bacillus thuringiensissubsp.kurst aki，Btk)，如DiPel、Thuricide、Monterey Bt等，目前多用来防治舞毒蛾、粉纹夜蛾、番茄天蛾、葡萄叶斑蛾等，但对玉米穗虫或南瓜螟蛾效果不佳(https://www.arbico-organi cs.com/category/bacillus-thuringiensis-kurstaki-products)。国内用于防治夜蛾使用最多的Bt制剂同样是Btk类产品，主要包括HD-1、7216、8010等。然而草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等对这些Bt制剂却较为不敏感，田间防治效果并不理想。因此筛选对草地贪夜蛾等夜蛾科害虫具有高毒活性的苏云金芽胞杆菌菌株，开发绿色高效防治夜蛾科害虫新产品对保障粮食生产及农产品质量安全具有重要意义。目前美国国家环境保护局(EPA)中注册防治草地贪夜蛾的Bt杀虫蛋白成分为营养期杀虫蛋白Vip3Aa20(Vip)和杀虫晶体蛋白Cry1 F，主要用于转基因作物的害虫防控(https://19january2017snapshot.epa.gov/ingredients-used-pesticide-products/biopesticide-active-ingredients_.html)。目前我们国内暂无针对此类害虫的正式登记的Bt杀虫剂，但有专利显示可使用表达Vip蛋白的Bt工程菌株(专利申请号202011206877)，或使用大肠杆菌表达的Vip纯蛋白进行草地贪夜蛾的防控(专利授权号CN110622998B)。与上述经遗传改良后表达Vip杀虫蛋白的Bt工程菌不同，本发明提供菌株为野生型菌株，具有产品创制和登记的天然优势；同样生测方法条件下，该野生菌效价最高是Bt生产标准菌株的6倍；该菌株主效杀虫成分为多种杀虫晶体蛋白复合物，杀虫谱较单一Vip蛋白广。
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，本发明提供一株对夜蛾科害虫具有高毒杀活性的苏云金芽胞杆菌，所述的苏云金芽胞杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2020771。
本发明的另一个目的是上述苏云金芽胞杆菌在制备防治夜蛾科害虫的杀虫剂中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人从湖北省应城采取土壤样品，采用醋酸钠-抗生素分离法进行菌株的分离，最终分离出一株菌，该菌株可产生菱形伴胞晶体，为苏云金芽胞杆菌的典型特征，但将该菌株测序获得的16S rRNA基因序列在细菌鉴定EzBioCloud Database(https://www.ezbiocloud.net/)中进行比对分析，利用Marinococcushalophilus DSM 20408(X90835.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树，显示NBI-616与蜡样芽胞杆菌群(Bacillus cereus group)的白色杆菌Bacillus albus strain N35-10-2亲缘关系较近，序列同源性为99.5％，形成一个簇群。该菌株与苏云金芽胞杆菌的type strain Bacillusthuringiensis serovar berliner strain ATCC 10792(T)的ANI相似性超过95％，与16SrRNA基因序列相似性最高的Bacillus albusstrain N35-10-2的ANI相似性低于92％。
考虑到NBI-616菌株具有典型的双锥形杀虫晶体蛋白和杀鳞翅目害虫的杀虫晶体蛋白基因，申请人将本发明的筛选出的菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌，该菌株已于2020年11月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Bacillus sp.NBI-616，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2020771。
NBI-616菌株在Lauria-Bertani平板上生长的单菌落为乳白色近似圆形，表面似磨砂玻璃，无粘液且厚实；外沿稍有扩散而不整齐，有时有褶皱(图1)；将从Luria-Bertani固体培养基平皿上分离纯化到的单菌落转接到Luria-Bertani液体培养液中，28℃，200rpm培养，生长24h菌体为杆状；生长48h后为不能染上色的芽胞和染上色的菱形晶体(图2)，在扫描电镜下进行形态观察，可观察到典型的双锥体晶体(图3)。
苏云金芽胞杆菌NBI-616在制备防治害虫的杀虫剂中的应用，所述的害虫包括：草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫或小菜蛾。
以上所述的应用中，还包括利用本发明提供的苏云金芽胞杆菌NBI-616中的毒素蛋白基因制成杀虫蛋白用于杀灭害虫，或是利用苏云金芽胞杆菌NBI-616制备的杀虫晶体晶胞混合物，该混合物直接用于制备成杀虫剂；特别是草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫或小菜蛾的杀灭。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
目前在美国EPA暂无注册的防治草地贪夜蛾的Bt制剂，仅注册有营养期杀虫蛋白Vip3Aa20(Vip)和杀虫晶体蛋白Cry1F两种成分，可用于转基因作物防治草地贪夜蛾(https://19january2017snapshot.epa.gov/ingredients-used-pesticide-products/biopesticide-active-ingredients_.html)。国内亦暂无针对此类害虫的正式登记的Bt杀虫剂，但有专利申请显示可使用表达Vip蛋白的Bt工程菌株(专利申请号202011206877)，或使用大肠杆菌表达的Vip纯蛋白进行草地贪夜蛾的防控(专利授权号CN110622998B)。与上述经遗传改良后表达Vip杀虫蛋白的Bt工程菌不同，本发明提供菌株为野生型菌株，具有产品创制和登记的天然优势；同样生测方法条件下，该野生菌效价最高是Bt生产标准菌株的6倍；该菌株主效杀虫成分为多种杀虫晶体蛋白复合物，杀虫谱较单一Vip蛋白广。
对苏云金芽胞杆菌NBI-616(Bacillus thuringiensis NBI-616)菌株发酵液的毒力测定表明，NBI-616菌株对草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫及小菜蛾的幼虫具有高毒杀活性。进一步制备了NBI-616高含量原药，测定了对草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾及棉铃虫幼虫的LC50值，分别为：0.0188mg/ml、0.0102mg/ml、0.0848mg/ml和0.0454mg/ml，其毒力较苏云金芽胞杆菌HD-1标样高2.8-6.0倍。因此，可利用NBI-616菌株开发用于防治鳞翅目夜蛾科害虫的生物杀虫剂。另外，还可利用NBI-616菌株中毒素蛋白基因，开发转基因作物。基于NBI-616菌株的生物杀虫剂的开发，可减少化学农药的使用，为草地贪夜蛾等夜蛾科害虫的防治提供新的防治手段，特别适用于绿色及有机农产品的生产，具有重要的经济价值和应用前景。
附图说明
图1为NBI-616菌株在Luria-Bertani固体培养基平皿上的菌落形态示意图。
图2为NBI-616菌株在液体LB培养基生长48h后的胞晶显微形态示意图。
图3为NBI-616菌株在液体LB培养基里生长48h后胞晶的扫描电镜观察示意图。
图4为NBI-616菌株伴胞晶体蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析；
其中左侧为蛋白质Marker。
图5为NBI-616菌株基于16S rRNA基因的进化树。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
苏云金芽胞杆菌NBI-616菌株的获得
申请人从湖北省应城采取土壤样品，采用醋酸钠-抗生素分离法进行苏云金芽胞杆菌的分离。具体过程为：称取土壤样品1g，放入装有10ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素(终浓度为400ug/mL)。将摇瓶放置于摇床，于30℃、200rpm/min振荡培养4h。振荡培养结束后，取土壤悬液，加入无菌离心管，3000r/min离心15min，再取离心管中的上层混浊液1mL于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1mL涂布Luria-Bertani琼脂平板(胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化纳10g、琼脂粉20g，溶于1L蒸馏水中，121℃，30min，湿热灭菌)，28℃恒温培养箱中倒置培养48h。从平板上挑取类拟苏云金芽胞杆菌的菌落涂片，从中发现一株可产生菱形伴胞晶体的菌株，将其命名为NBI-616。
1)NBI-616菌株的菌落形态
将NBI-616在Lauria-Bertani平板上划线，于30d的菌落形态：平皿上生长的单菌落为乳白色近似圆形，表面似磨砂玻璃，无粘液且厚实；外沿稍有扩散而不整齐，有时有褶皱(图1)。
2)NBI-616菌株的菌体及胞晶形态
将从Luria-Bertani固体培养基平皿上分离纯化到的单菌落转接到Luria-Bertani液体培养液中，28℃，200rpm，生长24h普通显微镜下观察为杆状；培养48h，取培养物用灭菌去离子水洗涤后，进行涂片、固定、复红染色后，在光学显微镜油镜镜头下进行形态观察，为不能染上色的芽胞和染上色的菱形晶体，显微镜检测图片如图2所示；取培养物用灭菌去离子水洗涤后，逐步脱水固定，在扫描电镜下进行形态观察，如图3所示，可观察到典型的双锥体晶体，产生伴胞晶体蛋白是苏云金芽胞杆菌的典型特征。
3)NBI-616菌株产生的晶体蛋白电泳检测
从Luria-Bertani固体培养基平皿上分离纯化到的苏云金芽胞杆菌NBI-616菌株单菌落转接到Luria-Bertani液体培养液中，28℃，200rpm，培养48h，取培养物1mL，用灭菌去离子水洗涤3～5遍后，弃上清，沉淀用80uL灭菌去离子水打散，加20uL 5倍蛋白上样缓冲液混匀，100℃处理10min，12000rpm离心10min，取上清10uL上样，用8％SDS-PAGE凝胶检测晶体蛋白条带，结果如图4所示，NBI-616菌株主要产生130KDa、81KDa、71KDa及42KDa左右的蛋白。晶胞混合物中杀虫晶体由7种杀虫晶体蛋白组成，分别是Cry78Aa-like蛋白(～42kDa)、Cry9Ea-like蛋白(～130kDa)、Cry2Ab-like蛋白(～71kDa)、Cry1 Ia-like蛋白(～81kDa)、Cry1Da-like蛋白(～132kDa)、Cry1Ca-like蛋白(～135kDa)、Cry1Ab-like蛋白(～131kDa)；同时，基因组中还包含一个营养期杀虫蛋白Vip3Aa12-like(～90kDa)。
4)NBI-616菌株的生理生化特性
利用梅里埃API20E和API 50CH生化鉴定试剂盒，参照相应的试剂盒标准操作流程，检测NBI-616菌株对氨基酸和蛋白质的代谢能力、碳源氧化能力及利用碳源产酸的能力，结果如表1、2所示。
表1 NBI-616菌株生理生化特性–酶活、碳源氧化+：阳性反应；-：阴性反应
表2 NBI-616菌株生理生化特性–利用碳源产酸+：阳性反应；-：阴性反应
5)NBI-616菌株16S rRNA基因序列的系统发育
利用PCR技术扩增获得NBI-616菌株的16S rRNA编码基因序列，序列为SEQ IDNO.1所示。将测序获得的16S rRNA基因序列在细菌鉴定EzBioCloud Database(https://www.ezbiocloud.net/)中进行比对分析，同源性相近的芽胞杆菌16S rRNA基因序列如表3所示，利用Marinococcushalophilus DSM 20408(X90835.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树如图5所示。系统进化树显示NBI-616与蜡样芽胞杆菌群(Bacilluscereus group)的白色杆菌Bacillus albus strain N35-10-2亲缘关系较近，序列同源性为99.5％，形成一个簇群。
表3 NBI-616菌株16S rRNA基因序列同源性比对分析结果
6)NBI-616菌株的全基因组测序及分析
采用Qiagen基因组提取试剂盒提取高质量的细菌基因组DNA，构建1D文库，利用Oxford Nanopore Technology测序仪PromethION对DNA进行单分子测序，再结合第二代高通量测序技术，获得苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis NBI-616菌株的全基因组序列，由1个完整的环装染色体和11个环装质粒组成，基因组基本特征如表4所示。
表4 NBI-616菌株基因组基本特征
选取表3中排名前20的菌株以及蜡样芽胞杆菌群(Bacillus cereus group)中的type strains分别与NBI-616菌株在EzBioCloud Database的ANI Calculator(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)中进行苏云金芽胞杆菌NBI-616菌株的全基因组的平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity，ANI)分析，结果如表5中所示：
表5 NBI-616与16S rRNA基因序列相似菌株及蜡样芽胞杆菌群type strains的平均核苷酸一致性(ANI)分析结果
NBI-616与苏云金芽胞杆菌的type strain Bacillus thuringiensis serovarberliner strain ATCC 10792(T)的ANI相似性超过95％，与16S rRNA基因序列相似性最高的Bacillus albusstrain N35-10-2的ANI相似性低于92％。
考虑到NBI-616菌株具有典型的双锥形杀虫晶体蛋白和杀鳞翅目害虫的杀虫晶体蛋白基因，申请人将本发明的NBI-616菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌。
上述菌株已于2020年11月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Bacillus sp.NBI-616，保藏编号为：CCTCC NO:M2020771，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
苏云金芽胞杆菌NBI-616菌株杀虫活性的测定
用接种环挑取Luria-Bertani固体培养基平皿上分离纯化到的单菌落至液体培养基中，培养基配方：淀粉2.0％，花生粕3.0％，工业蛋白胨0.5％，玉米浆2.0％，灭菌前pH7.5，500mL三角瓶装液量50mL。
温度30-32℃，转速220rpm，摇床振荡培养34小时，至芽胞和晶体40％分离时下摇床，发酵液参照中华人民共和国国家标准GB/T 19567.2-2004，以草地贪夜蛾幼虫、斜纹夜蛾幼虫、甜菜夜蛾幼虫、棉铃虫幼虫、小菜蛾幼虫、家蝇幼虫、家蝇成虫和德国小蠊成虫为试虫，测定了苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液的毒力，结果如表6-表13所示，Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液对草地贪夜蛾的LC50值为0.28μL/mL，对斜纹夜蛾的LC50值为0.15μL/mL，对甜菜夜蛾的LC50值为1.26μL/mL，对棉铃虫的LC50值为0.71μL/mL，对小菜蛾的LC50值为0.03μL/mL，对家蝇成虫有微弱毒杀活性，对家蝇幼虫和德国小蠊成虫无毒杀活性。
表6 Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液对草地贪夜蛾幼虫的毒杀活性
表7 Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液对斜纹夜蛾幼虫的毒杀活性
表8 Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液对甜菜夜蛾幼虫的毒杀活性
表9 Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液对棉铃虫幼虫的毒杀活性
表10 Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液对小菜蛾幼虫的毒杀活性
表11 Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液对家蝇幼虫的毒杀活性
表12 Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液对家蝇成虫的毒杀活性
表13 Bacillus thuringiensis NBI-616发酵液对德国小蠊成虫的毒杀活性
实施例3：
苏云金芽胞杆菌NBI-616菌株的发酵与高含量原药的制备
种子培养液的制备：种子培养基的摇瓶装量为50mL/500mL摇瓶，转速220rpm，培养温度30-32℃，发酵周期为31-35h，镜检至芽胞和晶体40％分离时得到晶胞悬浮液。
本实施例的种子培养基和发酵培养基的配方均为：玉米粉3.0％，豆粕粉4.0％，蛋白胨1.0％，玉米浆粉2.5％，pH8.0。
采用一级发酵：5000L发酵罐的发酵培养基的灌装体积为3500L，消前pH 8.0。灭菌条件121℃，1kg/cm2，30min。待罐温降至35℃时接种，采用苏云金芽胞杆菌NBI-616芽胞悬浮液接种。接种量200mL晶胞悬浮液，通气量1：0.8-1.0，搅拌转速200rpm，罐压控制在0.3-0.5kg/cm2。定时取样观察菌体、晶体及芽胞形成情况。发酵至24小时取样镜检，菌体90％以上形成胞子囊，32小时取样镜检，晶体脱落率15-20％，放罐。
放罐后，发酵液用盐酸调pH至4.0-5.0，80目振动筛过滤，滤液经DBY211型碟式分离机离心，浓缩液加2％轻钙，充分混合，后经离心式喷雾干燥塔喷雾干燥，进风温度200-230℃，出风温度85-90℃，制备得到高含量Bt原粉。参照中华人民共和国国家标准GB/T19567.1-2004，测定样品晶体含量为8％。
实施例4：
苏云金芽胞杆菌NBI-616菌株高含量原药对多种夜蛾科害虫的杀虫活性
参照中华人民共和国国家标准GB/T 19567.1-2004，以草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾及棉铃虫等害虫的幼虫为试虫，测定了苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensisNBI-616高含量原药的毒力。
1、对草地贪夜蛾幼虫进行生物测定，结果显示Bacillus thuringiensis NBI-616菌株高含量原药对草地贪夜蛾幼虫具有高毒杀活性，Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药处理48h后，草地贪夜蛾死亡率达到了100％。Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药对草地贪夜蛾的LC50值为0.0181mg/ml，达到80513IU/mg，表14所示，是中华人民共和国国家标准GB/T 19567.1-2004中标准品CS-1995(HD-1菌株，H3ab)的6.2倍。
表14 Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药对草地贪夜蛾幼虫的毒杀活性
2、对斜纹夜蛾幼虫进行生物测定，结果显示Bacillus thuringiensis NBI-616菌株高含量原药对草斜纹夜蛾幼虫具有高毒杀活性，Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药处理48h后，斜纹夜蛾死亡率达到了100％。Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药对斜纹夜蛾的LC50值为0.0102mg/ml，达到61941IU/mg，表15所示，是中华人民共和国国家标准GB/T 19567.1-2004中标准品CS-1995(HD-1菌株，H3ab)的4.8倍。
表15 Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药对斜纹夜蛾幼虫的毒杀活性
3、对甜菜夜蛾幼虫进行生物测定，结果显示Bacillus thuringiensis NBI-616菌株高含量原药对甜菜夜蛾幼虫具有高毒杀活性，Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药处理48h后，甜菜夜蛾死亡率达到了100％。Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药对甜菜夜蛾的LC50值为0.0848mg/ml，达到59012IU/mg，表16所示，是中华人民共和国国家标准GB/T 19567.1-2004中标准品CS-1995(HD-1菌株，H3ab)的4.5倍。
表16 Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药对甜菜夜蛾幼虫的毒杀活性
4、对棉铃虫幼虫进行生物测定，结果显示Bacillus thuringiensis NBI-616菌株高含量原药对棉铃虫幼虫具有高毒杀活性，Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药处理48h后，棉铃虫幼虫死亡率达到了93.3％。Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药对棉铃虫的LC50值为0.0454mg/ml，达到36366IU/mg，表17所示，是中华人民共和国国家标准GB/T 19567.1-2004中标准品CS-1995(HD-1菌株，H3ab)的2.8倍。
表17 Bacillus thuringiensis NBI-616高含量原药对棉铃虫幼虫的毒杀活性
序列表
<110> 湖北省生物农药工程研究中心
<120> 一株对夜蛾科害虫具有高毒杀活性的苏云金芽胞杆菌及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcagtcgag cgaatggatt aagagcttgc tcttatgaag ttagcggcgg acgggtgagt 60
aacacgtggg taacctgccc ataagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg 120
gataacattt tgaactgcat ggttcgaaat tgaaaggcgg cttcggctgt cacttatgga 180
tggacccgcg tcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca acgatgcgta 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagtg ctagttgaat 420
aagctggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480
cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggtg 540
gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg gagggtcatt ggaaactggg 600
agacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagagat 660
atggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt aactgacact gaggcgcgaa 720
agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 780
aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgaagttaac gcattaagca ctccgcctgg 840
ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaaa 960
accctagaga tagggcttct ccttcgggag cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt 1080
gccatcatta agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacggt 1200
acaaagagct gcaagaccgc gaggtggagc taatctcata aaaccgttct cagttcggat 1260
tgtaggctgc aactcgccta catgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac 1380
acccgaagtc ggtggggtaa cctttttgga gccagccgcc taaggtgaca gagt 1434
Claims (6)
1.一株分离的芽胞杆菌（Bacillus sp.）NBI-616 ，所述芽胞杆菌的保藏编号为CCTCCNO：M2020771。
2.权利要求1所述的芽胞杆菌在制备害虫生防菌剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的害虫为：草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫或小菜蛾。
4.权利要求1所述的芽胞杆菌制备的晶胞混合物。
5.权利要求4所述的晶胞混合物制备害虫杀虫剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述的害虫为：草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫或小菜蛾。
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| CN202110163838.2A CN112695001B (zh) | 2021-02-05 | 2021-02-05 | 一株对夜蛾科害虫具有高毒杀活性的苏云金芽胞杆菌及应用 |
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