CN118652803A - 一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118652803A
CN118652803A CN202410787137.XA CN202410787137A CN118652803A CN 118652803 A CN118652803 A CN 118652803A CN 202410787137 A CN202410787137 A CN 202410787137A CN 118652803 A CN118652803 A CN 118652803A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pseudomonas
biocontrol agent
biocontrol
mcnb22471
sclerotinia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410787137.XA
Other languages
English (en)
Inventor
梁月
杨柳柳
王彩懿
洪瑛喆
孙宇
杨琳
范宝强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenyang Agricultural University
Original Assignee
Shenyang Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenyang Agricultural University filed Critical Shenyang Agricultural University
Priority to CN202410787137.XA priority Critical patent/CN118652803A/zh
Publication of CN118652803A publication Critical patent/CN118652803A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P3/00—Fungicides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及植物病害生物防治领域，具体公开了一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及制备方法和在植物病害防治中应用。所述帕勒隆尼氏假单胞菌为MCNB22471，于2024年04月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.30232。本发明制备的帕勒隆尼氏假单胞菌生防菌剂对菌核病的防治效果达到61.1％‑87.3％，对根肿病的防治效果达到27.5％；同时，该细菌具有较强的耐盐碱性，表明该菌株或生防菌剂在菌核病和根肿病的防治领域及在盐碱性环境中具有良好的应用前景。

Description

一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治领域，具体涉及一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
植物病害发生限制农业产业发展，影响作物产量与品质。其中，菌核病是一种破坏性很强的世界性植物病害，在作物整个生长发育期间均可发生。菌核病在全球各地都有发生，菌核病影响农业生产问题突出，每年造成巨大的经济损失，严重时导致减产80％以上。菌核病是由真菌界子囊菌门核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一类真菌性病害，其寄主范围广泛，可以侵染多种植物，包括多种双子叶作物，如油菜、向日葵、大豆、豌豆、花生、扁豆、莴苣等，以及单子叶植物，如郁金香和洋葱等。核盘菌不仅在作物的生育期造成严重危害，而且在储藏和运输过程中也能引起侵染，造成作物的产量损失和品质下降。核盘菌主要以菌核的形式在土壤、秸秆残体以及混杂在种子中越夏和越冬。主要侵染叶片、茎基部及果实，被侵染的植物组织出现水渍状斑点，由绿色变为浅褐色病斑至深褐色病斑。随着病情的发展，罹病组织会出现白色菌丝并形成菌核，进而造成倒伏或植株死亡，因其在病残体上形成的菌核具有较强的抗逆性和耐低温性，导致菌核病的防治难度加剧。
根肿病是一种制约十字花科作物生产的世界性病害，主要危害油菜、甘蓝、萝卜、芥菜、白菜等多种十字花科植物。根肿病的发生与流行造成众多经济作物、蔬菜作物等严重的经济损失。近年来，在世界范围内的根肿病发生日趋严重。根肿病是由原生动物界芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起的一类毁灭性植物病害，根肿病主要危害十字花科植物的根部，病原菌侵入根部皮层细胞，剌激细胞大量的分裂、繁殖，最终导致根部肿大形成大小不一、形态各异的肿瘤，一般呈纺锤形、圆筒形、手指形等形状。通常主根肿瘤大而少，侧根肿瘤小而多，须根肿瘤成串。罹病植株根组织腐烂后，释放大量根肿菌休眠孢子在病田土壤中，将作为次年侵染及病害流行的主要来源。根肿菌孢子在土壤中能够长期存活，并随农事工具等传播流行，导致根肿病发生逐年加重，严重制约十字花科种植产业健康发展。
防治菌核病和根肿病的防治方法有限，由于高抗品种缺乏，目前化学防治仍然是最为普遍的措施之一。常用的菌核病杀菌剂有多菌灵、异菌脲和菌核净等，根肿病杀菌剂包括氟啶胺和氰霜唑等，这些化学药剂是通过对病原菌菌丝进行抑制，而使菌体生长代谢缓慢，以达到防治效果。随着化学药剂的频繁使用，病原菌将产生抗药性导致防效降低，而且化学药剂的常年施用对环境影响也日益严重。为了生态环境，人们开展对菌核病和根肿病的绿色防控。生物防治主要利用有益微生物，目前对菌核病的防治主要包括盾壳霉(Coniothyriumminitans)、芽孢杆菌(Bacillus)和假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)等；防治根肿病的生防资源主要包括球状茎点霉(Phoma glomerata)、绿色木霉(T.viride)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)等。但是，缺乏对菌核病和根肿病同时防治的生防菌。
发明内容
为获得一株能够防治菌核病和根肿病的菌株，本发明提供了一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用，本发明提供的帕勒隆尼氏假单胞菌可以防治菌核病和根肿病，其防治效果达到61.1-87.3％和27.5％，同时该菌具有较强的耐盐耐酸碱性，表明该菌株或生防菌剂在菌核病和根肿病的防治领域及在盐碱性环境中具有良好的应用前景。
本发明提供了一株帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)，所述帕勒隆尼氏假单胞菌为MCNB22471，于2024年04月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.30232。
本发明还提供了一种生防菌剂，所述生防菌剂是将所述的帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471在培养基中培养制得；
所述培养基中包括碳源、氮源、水和无机盐。
进一步地，所述培养基为LB液体培养基。
进一步地，所述生防菌剂为液体生防菌剂或生防菌粉。
进一步地，所述生防菌粉包括所述帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471和辅料；
所述辅料为黄原胶、羧甲基纤维素钠、碳酸钙、抗坏血酸和硅藻土中的任意一种或几种的组合。
本发明还提供了一种所述的生防菌剂的制备方法，所述液体生防菌剂制备过程为：将所述帕勒隆尼氏假单胞菌活化、培养后，用PBS缓冲液制成OD600nm＝0.75±0.5菌液，即为生防菌剂。
本发明还提供了一种所述的帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)或所述的生防菌剂在抑菌中的应用，所述抑菌是指抑制以下的病原菌：
所述病原菌包括核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，小长喙霉(Ophiostoma minus)，茄链格孢(Alternaria solani)，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，核果链核盘菌(Monilinia laxa)和芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)。
本发明还提供了一种所述的帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)或所述的生防菌剂在植物病害防治中的应用。
进一步地，所述植物病害包括作物菌核病和根肿病。
进一步地，所述菌核病的病原菌为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，所述根肿病的病原菌为芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)。
本发明还提供了一种所述的帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)或所述的生防菌剂在盐环境或碱环境防治中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明分离得到一株帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)，检测该生防菌具有卵磷脂酶、纤维素酶活性，证明其具备生防菌剂的利用潜力；
本发明将帕勒隆尼氏假单胞菌制备的生防菌剂与核盘菌对峙培养，试验结果表明该生防菌剂对核盘菌生长具有显著抑制作用，抑制率达到72.8％，该菌剂对菌核病的防治效果为61.1％-87.3％。
本发明制备的生防菌剂与芸薹根肿菌共培养，试验结果表明该生防菌剂对芸薹根肿菌休眠孢子萌发具有显著抑制作用，抑制率达到33.5％，其对根肿病的防治效果为27.5％。
本发明公开的生防菌MCNB22471制备的生防菌剂对菌核病和根肿病具有良好的防治效果，为防治菌核病和根肿病提供了新的解决方案，具有良好的市场应用前景。
2、本发明提供的帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)耐盐碱环境，能够作为盐碱地环境植物病害防治的潜在菌株。用于盐碱地及次生盐渍化土壤的种植中。
生物材料保藏信息说明
MCNB22471，在本申请中称作帕勒隆尼氏假单胞菌，已于2024年04月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.30232，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为帕勒隆尼氏假单胞菌Pseudomonas palleroniana。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中的帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471菌落形态和电镜图；
图中，a为帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471菌落形态图；
b为帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471的电镜图。
图2为本发明中的帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471的系统发育树。
图3为本发明中的帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471对不同真菌生长的抑制作用；
图中a-i表示不同真菌，分别为a：核盘菌，b：灰葡萄孢菌，c：禾谷镰刀菌，d：小长喙霉，e：茄链格孢，f：禾谷丝核菌，g：串珠镰刀菌，h：核果链核盘菌，i：尖孢镰刀菌。
图4为本发明中的帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471耐盐耐酸碱性检测；
图中，a为帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471耐盐性检测；
b为帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471耐酸碱性检测。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用。
一、菌株的分离鉴定
该菌从蝉棒束孢侵染的柞蚕虫体中分离获得，具体方法如下：将1g虫体在无菌条件下加入9mL无菌蒸馏水，震荡后离心并梯度稀释，吸取100μL的100倍稀释液和1000倍稀释液分别均匀地涂布在LB固体培养基上，在超净工作台内吹干，倒置于25℃恒温培养箱中培养，用无菌牙签挑取单菌落至新的LB固体培养基中，以核盘菌作为靶标菌采用平板对峙法进行初步筛选。
LB固体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂16g，蒸馏水1L。
分离并筛选获得一株对核盘菌具有拮抗作用的细菌，命名为MCNB22471。
二、菌株MCNB22471的鉴定
对以上获得的菌株MCNB22471进行形态学特征观察、生理生化特征鉴定以及16srRNA分子鉴定。具体过程如下：
1、菌体的形态特征
菌株MCNB22471在LB固体培养基上呈现圆形、黄白色菌落。在LB培养基上28℃孵育48小时后，该菌形成直径为2ⅹ3mm的半透明黄白色圆形凸起菌落，菌表面光滑，边缘整齐(见图1的a)。菌体使用电子显微镜观察，菌体呈线状(见图1的b)。
2、生理生化特性
根据《一般细菌常用鉴定方法》、《常见细菌系统鉴定手册》对菌株MCNB22471的生理生化反应进行鉴定。结果(表1)表明，菌株MCNB22471明胶液化、卵磷脂酶、蛋白酶、果胶、纤维素水解、无机磷的利用和固氮共六个指标为阳性，革兰氏反应、有机磷的利用、淀粉水解和固氮能力共四个指标为阴性。
菌株MCNB22471生理生化特征如表1所示。
表1菌株MCNB22471的生理生化特性
特性 鉴定结果 特性 鉴定结果
明胶液化 + 革兰氏反应 _
淀粉水解 _ 卵磷脂酶 +
蛋白酶 + 果胶 +
纤维素水解 + 无机磷 _
有机磷 _ 固氮 _
注：+，阳性反应；-，阴性反应。
3、16s rRNA序列分析
方法：提取菌株MCNB22471的DNA，利用通用引物27F和1492R进行PCR扩增获得16sRNA片段。PCR体系(50μL)如下：引物(27F SEQ ID NO.1和1492R SEQ ID NO.2)各1μL，DNAtemplate 2μL，10×buffer 6μL，dNTP(2.5mM)5μL，Taq(2.5U/μL)0.25μL，用ddH2O补充至50μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后72℃充分延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离并纯化后，将PCR扩增得到的序列送至上海生工生物公司进行测序，将测序结果(如SEQ ID NO.3所示)与NCBINucleotide Sequence数据库中进行比对，选择相似度大于96％的菌株，并选择一个已知的外群。使用MEGA-X软件进行序列对比及剪裁，将重复次数设定为1000次，用NJ(neighbor-joining)法构建系统发育树。测序结果比对后鉴定菌株MCNB22471为帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)。
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.1)；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.2)。
SEQ ID NO.3：
AGGTGGGCCTACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTGCCTAATACGTAACTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAAGCCTTGAGCTTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCCATCGAT
三、帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471的抑菌广谱性分析
1、供试植物病原菌
以核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，小长喙霉(Ophiostoma minus)，茄链格孢(Alternariasolani)，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)，核果链核盘菌(Monilinia laxa)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)作为供试病原菌。
上述病原菌具体公开信息如下：(1)An et al.Journal of Agricultural andFood Chemistry,2019,67,13001-13009.(2)Xing et al.Plant Disease,2021,105,3636-3642.(3)梁月等，国家发明专利，ZL 2022 1 0132030.2。(4)核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)菌株编号为ACCC 35470，灰葡萄孢(Botrytis cinera)菌株编号为ACCC35467，均保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
2、抑菌实验
帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471使用LB液体培养基28℃振荡培养48h，获得菌液。将供试病原菌活化后，取直径为5mm的菌饼放在PDA培养基中心点，距中心点30mm处使用划线接种菌液，同时在平板中心点接种病原菌菌饼(处理组)，以只在平板中心接种病原菌菌饼的培养皿作为对照组，封口膜密封，每株供试病原菌重复3次，25℃倒置培养直至对照皿中真菌菌丝刚好长满。对照组和处理组菌落平均直径和抑菌率见表1。按照如下公式计算对病原菌的抑制率：
抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径ⅹ100％；
LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1L。
结果如图3所示，帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471能够抑制供试不同植物病原真菌生长，抑制率分别为核盘菌72.8％、灰葡萄孢62.8％、禾谷镰刀菌66.7％、小长喙霉71.3％、茄链格孢74.3％、禾谷丝核菌74.3％、串珠镰刀菌79.5％、核果链核盘菌77.4％、尖孢镰刀菌79.1％。
3、对孢子萌发的抑制
(1)生防菌剂的制备：将帕勒隆尼氏假单胞菌菌株MCNB22471接种于LB液体培养基28℃震荡培养过夜，获得菌株培养液。然后用0.01mol/L PBS缓冲液将菌株培养液制成OD600nm＝0.75±0.5的菌液，即为生防菌剂。
(2)根肿菌休眠孢子悬浮液的提取。用水冲洗50g新鲜油菜根肿病根，洗去表面泥土后用无菌水冲洗。70％酒精，1min浸泡清洗后的菌根，3次无菌水冲洗。菌根与300mL无菌水加入到榨汁机中榨汁。将混合物使用8层灭菌纱布过滤后，每50mL离心管中加入35mL过滤液。4℃，2000×g离心15min，弃上清。每管加入5mL 40％蔗糖溶液，涡旋仪震荡至沉淀完全溶解。4℃，4000×g离心10min，上清液置入灭菌的50mL离心管。加入30mL无菌水，混匀后，4℃，4000×g离心10min，弃去上清液。加入10mL无菌水，混匀后，4℃，4000×g离心10min，弃去上清液。加入10mL无菌水，混匀后，4℃，4000×g离心10min，弃去上清液。4℃冰箱保存，即为根肿菌休眠孢子悬浮液。
显微镜下将10μL根肿菌休眠孢子悬浮液滴入血球计数板中观察，计算根肿菌孢子数量。
(3)油菜根系分泌液的收集。将油菜种子均匀铺在使用无菌水浸湿的无菌纸上，置于空的培养皿中，28℃催芽2天，期间进行补水保持无菌纸湿润。种子发芽后，将其放在纱布空隙中与Hoagland’s营养液接触进行培养，每棵油菜10mL营养液。营养液培养7天后，使用0.22μm细菌滤器过滤，收集油菜根系分泌液。放于4℃冰箱中备用。
(3)生防菌与根肿菌休眠孢子悬浮液共培养
将1mL根肿菌休眠孢子悬浮液(浓度1×106个休眠孢子/mL)与10mL油菜根系分泌液混合后，加入1mL生防菌剂(处理组)，在25℃恒温培养箱中黑暗处理培养5天后，获得培养液，以PBS缓冲液代替生防菌剂加入作为对照组。分别取处理组和对照组培养获得的培养液20μL滴在载玻片上烤干，滴上50μL 1％地衣红染液覆盖染色3min，95％乙醇冲去染料，加入10μL 10％甘油，覆盖玻片置于显微镜下观察，其中未萌发孢子染色呈红色且不透明状，萌发孢子未被染色而呈透明状。记录对照组和处理组的孢子萌发数。
按照如下公式计算对根肿菌孢子萌发抑制率：
抑制率(％)＝(对照组孢子萌发数-处理组孢子萌发数)/对照组孢子萌发数ⅹ100％。
结果表明，帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471对根肿菌孢子萌发抑制率为33.5％。
四、生防菌剂对菌核病的防效评价
本研究开展对油菜、大豆和向日葵的离体叶片进行室内和温室条件下的生物防治效果评价，探究生防菌对不同寄主菌核病的生防利用潜力。其中，室内测定主要将播种四周后采自温室栽培大小均一的油菜、大豆和向日葵的叶片，使用稀释至OD600＝0.8的生防菌液作为处理进行接种，设置处理组为叶片喷施生防菌剂，24小时后接种核盘菌，对照组为叶片喷施无菌水，24小时后接种核盘菌。每个处理重复三次，每隔24小时观察发病情况并统计病斑大小。
室内测定对菌核病的防效评价表明，在48小时后在油菜、大豆和向日葵上的防效分别达到87.3％、82.9％和63.7％。此外，菌核病的温室防效评价表明，生防菌剂在48小时后在油菜和大豆上的防效分别达到61.1％和69.9％。因此，在生防菌处理下，对油菜、大豆和向日葵菌核病的发生与发展具有抑制作用，由此推测生防菌能够用于油菜、大豆、向日葵等重要油料作物产业发展中植物病害防治，特别是对菌核病具备绿色防控潜力。
五、生防菌剂对根肿病的防效评价
将提取的根肿菌休眠孢子悬浮液(1×106个休眠孢子/mL)与无菌营养土按照比例1mL菌液：100g土混合配置接种菌土(孢子浓度为1×106个休眠孢子/g土)，均匀铺入72孔穴盘中，每孔1粒油菜种子并注射入1mL生防菌剂，以PBS缓冲液作为对照。接种后将植株移至在25℃温室中，保持16小时光照和8小时黑暗昼夜循环培养。5周后随机采集30个根，按照0-3级分类法评估根肿病严重程度，其中0级：主根与侧根均无肿大；1级：仅侧根上有根部肿大；2级：仅主根上有肿大；3级：主根与侧根上均有根部肿大现象。
病情指数＝Σ(发病等级×对应植株数)/(最高发病等级×调查总株数)
防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％
结果表明，生防菌剂对根肿病的防治效果达到27.5％，表明该生防菌剂具有良好的根肿病防治效果。
六、耐盐碱性检测
将制得的生防菌剂分别接种至LB液体培养基中(pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和NaCl浓度为1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％)，待24h和48h后测定菌液OD600值。
结果如图4所示，帕勒隆尼氏假单胞菌菌株MCNB22471具有耐盐碱性，具备在盐碱环境中作为生防资源的应用潜力。随着NaCl浓度升高，菌液浓度先升高后降低，当NaCl浓度为3.0％时，生防菌浓度最高，表明生防菌繁殖速度最快并最适合生长(图4的a)。此外，随着pH值上升，菌液浓度呈现先升高后下降趋势。当pH＝9.0时，菌浓度最高，表明生防菌繁殖速度最快并最适合生长(图4的b)。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)，其特征在于，所述帕勒隆尼氏假单胞菌为MCNB22471，于2024年04月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.30232。
2.一种生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂是将权利要求1所述的帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471在培养基中培养制得；
所述培养基中包括碳源、氮源、水和无机盐。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂为液体生防菌剂或生防菌粉。
4.根据权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌粉包括所述帕勒隆尼氏假单胞菌MCNB22471和辅料；
所述辅料为黄原胶、羧甲基纤维素钠、碳酸钙、抗坏血酸和硅藻土中的任意一种或几种的组合。
5.一种权利要求3所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体生防菌剂制备过程为：将所述帕勒隆尼氏假单胞菌活化、培养后，用PBS缓冲液制成OD600nm＝0.75±0.5菌液，即为生防菌剂。
6.一种权利要求1所述的帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)或权利要求2-4任一项所述的生防菌剂在抑菌中的应用，其特征在于，所述抑菌是指抑制以下的病原菌：
所述病原菌包括核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，小长喙霉(Ophiostoma minus)，茄链格孢(Alternaria solani)，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，核果链核盘菌(Monilinia laxa)和芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)。
7.一种权利要求1所述的帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)或权利要求2-4任一项所述的生防菌剂在植物病害防治中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物病害包括作物菌核病和根肿病。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述菌核病的病原菌为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，所述根肿病的病原菌为芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)。
10.一种权利要求1所述的帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)或权利要求2-4任一项所述的生防菌剂在盐环境或酸碱环境中防治植物病害中的应用。
CN202410787137.XA 2024-06-18 2024-06-18 一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用 Pending CN118652803A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410787137.XA CN118652803A (zh) 2024-06-18 2024-06-18 一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410787137.XA CN118652803A (zh) 2024-06-18 2024-06-18 一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118652803A true CN118652803A (zh) 2024-09-17

Family

ID=92703386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410787137.XA Pending CN118652803A (zh) 2024-06-18 2024-06-18 一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118652803A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112458012B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂及其应用
CN103695356B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌和微生物菌剂及其应用
CN115058358B (zh) 一株耐盐芽孢杆菌及其应用
CN111876351A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在减轻苹果连作障碍中的应用
CN105820981B (zh) 一株高地芽孢杆菌菌剂的制备及应用
CN105907680B (zh) 一种枯草芽孢杆菌j-5及其生物菌剂和应用
CN111944714B (zh) 一种红掌内生暹罗芽孢杆菌hzy-54及其应用
CN106906172A (zh) 一株微白黄链霉菌及其在苹果树腐烂病防治方面的应用
CN104630086B (zh) 一种防治稻瘟病的解淀粉芽孢杆菌rl263
CN111424004B (zh) 一株亚麻假单胞菌及其应用
CN115927034A (zh) 一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用
CN104673720B (zh) 一种用于防治葡萄霜霉病的巨大芽孢杆菌及其悬浮剂
CN118126858A (zh) 一株萎缩芽孢杆菌tb8及其应用和生防菌剂
CN114774301B (zh) 一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌jl-b16及其应用
CN116064284A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN103952338B (zh) 成团泛菌菌株xm2及其菌悬液的制备方法和对梨黑斑病的防治方法
CN104593284B (zh) 一株核桃内生菌及其应用
CN117660251A (zh) 一株暹罗芽孢杆菌及其在植物病害防治方面的应用
CN116144522B (zh) 一株皮氏类芽孢杆菌及其在防治葡萄白腐病中的应用
CN113832071B (zh) Brevibacillus halotolerans菌及其制备生防菌剂中的应用
CN114395510B (zh) 一株绿针假单胞菌对十字花科作物根肿病的防控应用
CN105349457A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在玉米大斑病生防中的应用
CN118652803A (zh) 一株帕勒隆尼氏假单胞菌、生防菌剂及其制备方法和应用
CN113481125B (zh) 一株解淀粉芽胞杆菌及其在半夏抗病促生长中的作用
CN116606750A (zh) 一种具有防病促生作用的生防菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination