CN105349457A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其在玉米大斑病生防中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌及其在玉米大斑病生防中的应用。所述解淀粉芽孢杆菌的16S？rDNA含有如SEQ？I？D？NO:1所示的序列。一种优选的解淀粉芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.11488。本发明提供的应用为利用所述的解淀粉芽孢杆菌抑制玉米大斑病菌。所述解淀粉芽孢杆菌为玉米大斑病的生防提供了具有强拮抗作用并易于定植的新型微生物。所述解淀粉芽孢杆菌在玉米大斑病生防中的应用，提供了一种高效稳定的玉米大斑病生防方法，其利用了所述解淀粉芽孢杆菌在玉米叶片上易于定植且对玉米大斑病菌具有强拮抗作用的特点，能够更好地满足农业生产中防治玉米大斑病的要求。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其在玉米大斑病生防中的应用

技术领域

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在玉米大斑病生防中的应用。

背景技术

玉米大斑病是大斑刚毛座腔菌(Setosphaeriaturcica)侵染引起的一种严重的叶枯性病害，造成玉米叶片大面积坏死，影响光合作用，导致玉米减产。近几年来，由于生产中缺乏相应的抗大斑病种质资源，且大斑病菌生理小种的变异速度较快，因此，玉米大斑病在我国东北春玉米区和黄淮海夏玉米区呈明显加重趋势。目前，针对玉米大斑病主要采用种植抗病品种、化学防治等方法。然而，由于玉米大斑病菌的抗药性以及化学防治对环境污染严重等问题，开展玉米大斑病的生物防治研究具有重大意义。

目前，已经筛选到一些对玉米大斑病菌具有生防作用的微生物。

中国专利申请CN101698828A公开了一种铜绿假单胞菌D10，PseudomonasaeruginosaD10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M209104。在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈棕色，圆形，有光泽，湿润，边缘整齐，菌落直径0.2～0.5cm，菌体成短杆状，无芽孢。所述铜绿假单胞菌D10抑菌谱广，可抑制玉米大、小斑病，对玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌也均有较强的拮抗作用。

中国专利申请CN101698829A公开了一种枯草芽孢杆菌A16，BacillussubtilisA16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M209105。该枯草芽孢杆菌A16在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，形状不规则，无光泽，不湿润，边缘不整齐，菌落直径0.5～1cm，表面有皱褶，菌体成直杆状，芽孢呈椭圆形。该枯草芽孢杆菌A16抑菌谱广，可抑制玉米大、小斑病，对玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌也均有较强的拮抗作用。

尽管已经筛选到一些对玉米大斑病菌具有生防作用的微生物，但还远远不够。一方面，生防中拮抗微生物的多样化使用有利于防止病菌产生抗性，所以对病菌具有拮抗作用的微生物的种类多多益善；另一方面，现有的能够抑制玉米大斑病菌的微生物的拮抗作用还不够理想，需要筛选定植能力和拮抗作用更强的微生物，以使生物防治方法能够更好地满足农业生产中防治玉米大斑病的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型微生物，其对玉米大斑病具有强拮抗作用并易于定植。

本发明的另一个目的是提供上述微生物在玉米大斑病生防中的应用，以显著提升玉米大斑病生防效果。

本发明的再一个目的是提供一种生防制剂，其制备工艺简单，且可以显著提升玉米大斑病生防效果。

本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA含有如SEQIDNO:1所示的序列。

根据本发明所述的解淀粉芽孢杆菌，优选地，所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11488。

本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌在玉米大斑病生防中的应用为，利用以上所述的解淀粉芽孢杆菌抑制玉米大斑病菌。

根据本发明提供的所述应用，优选地，将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂施于玉米叶片上，使所述解淀粉芽孢杆菌在玉米叶片上定植，抑制玉米大斑病菌。

根据本发明的所述应用，优选地，将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂施于玉米植株上的时期为六叶期以后。

根据本发明的所述应用，优选地，所述菌剂为所述解淀粉芽孢杆菌与含有助悬剂的无菌水配成的悬浮液。

根据本发明的所述应用，优选地，所述无菌水中的助悬剂的质量浓度为0.02～0.1％，所述悬浮液中的解淀粉芽孢杆菌的浓度为10⁸～10¹⁰个/毫升。

根据本发明的所述应用，优选地，将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂施于玉米植株上的方法为，将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂制成解淀粉芽孢杆菌的浓度为10⁷～10⁹个/毫升的喷液进行喷雾。

根据本发明的所述应用，优选地，所述喷液的喷施量为5～10升/亩。

本发明还涉及一种生防制剂，即为本发明的上述应用中的所述悬浮液。

本发明的解淀粉芽孢杆菌对玉米大斑病菌具有强拮抗作用并易于定植。本发明利用解淀粉芽孢杆菌对玉米大斑病进行生防，是一种高效稳定的玉米大斑病生防方法，其利用了所述解淀粉芽孢杆菌在玉米叶片上易于定植且对玉米大斑病菌具有强拮抗作用的特点，能够更好地满足农业生产中防治玉米大斑病的要求。

附图说明

图1-1、1-2和1-3分别为所述解淀粉芽孢杆菌的菌落以及油镜和电镜下的菌体形态；

图2为解淀粉芽孢杆菌D3的16SrDNA片段的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为解淀粉芽孢杆菌D3的16SrDNA系统发育树；

图4为玉米大斑病菌和解淀粉芽孢杆菌D3对峙培养结果；

图5为用于检验解淀粉芽孢杆菌D3对玉米大斑病生防作用的试验中对照和处理条件下玉米大斑病菌菌落形态。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明所述的“生防”是植物保护领域的常用术语，即，“生物防治”的简称。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌在没有特别说明的情况下，可以为营养体，也可以为芽孢。

本发明提及的“D3”为本发明的解淀粉芽孢杆菌在研发过程的代号，为了表述方便，本发明继续沿用。

<解淀粉芽孢杆菌>

本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA含有如SEQIDNO:1所示的序列。

本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌，是从河南新乡的玉米大斑病发生田的玉米叶片表面分离、筛选和培养而得的菌株，其对于玉米大斑病具有稳定而显著的拮抗效果，经微生物学形态分类与分子鉴定，属于解淀粉芽孢杆菌。

所述解淀粉芽孢杆菌在LB培养基平板上，30℃，培养24小时。菌落呈淡黄色不透明，表面粗糙，有隆起，边缘不规则。显微观察菌体呈杆状，两端钝圆，大小为长1.5-1.7μm，宽0.4-0.6μm。图1-1、1-2和1-3分别为所述解淀粉芽孢杆菌的菌落以及油镜和电镜下的菌体形态。

所述解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA的扩增方法为：挑取少量单菌落，置于PCR管中，加入20μL去离子水，95℃处理10分钟，冷却后作为PCR模板，进行PCR扩增。

扩增所用引物为细菌16SrDNA序列通用引物27F和1492R。正向引物为如SEQIDNO:2所示的引物(27F)，反向引物为如SEQIDNO:3所示的引物(1492R)。

PCR扩增体系为20μL：模板1μL，正向引物和反向引物各1μL，Taq酶0.3μL，Buffer2μL，dNTP1.2μL，其余用dd水补足。扩增条件：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃90s，30循环，72℃5min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像参见附图2所示。经序列分析扩增所得的16SrDNA序列长度约为1500bp。将所述16SrDNA序列进行测序并进行BLAST比对分析，结果显示所述16SrDNA与Bacillusamyloliquefaciens的相似度最高，达到了99％。

将所述16SrDNA序列在NCBI数据库进行比对后，构建系统进化树。参见附图3所示，本发明的菌株(图3中标记为D3)与B.amyloliquefaciens的进化距离最短，是B.amyloliquefaciens的近似种。结合形态特征和分子生物学鉴定，确定本发明的菌株为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2015年10月13日，保藏号是CGMCCNo.11488。

<解淀粉芽孢杆菌在玉米大斑病生防中的应用>

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌在玉米大斑病生防中的应用，为将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂施于玉米叶片上，使所述解淀粉芽孢杆菌在玉米叶片上定植，抑制玉米大斑病菌。将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂施于玉米叶片上的时期可以为任一时期；优选为六叶期以后，且在吐丝期之前为好；更优选为六叶期到十叶期，这个时期的玉米植株具有了易于承载菌剂的叶片面积，而且大斑病一般不会发展到严重的程度，所以利用发挥较好的防控效果。

将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂施于玉米植株上的方法可以采用本领域通常采用的喷施法，即，利用喷雾设备将含有所述解淀粉芽孢杆菌的喷液喷到玉米植株上。所述喷液的解淀粉芽孢杆菌的浓度可以参照普通生防菌喷液的浓度，例如可以为10⁶～10¹⁰个/毫升，优选为10⁷～10⁹个/毫升。所述喷液的喷施量可以为1～20升/亩，优选为5～10升/亩，以多次喷施为佳。

所述喷液可以直接由各种形式和浓度的含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂配置而成。在本发明的一个优选实施方式中，用以配置所述喷液的菌剂为由所述解淀粉芽孢杆菌与含有助悬剂的无菌水配成的悬浮液。所述助悬剂可以为本领域常用的各种助悬剂，例如可以选自吐温、羧甲基纤维素、海藻酸钠、明胶、甘露醇、山梨醇等，优选为吐温，更优选为吐温80。所述悬浮液中的所述解淀粉芽孢杆菌的浓度，可以为10⁷～10¹¹个/毫升，优选为10⁸～10¹⁰个/毫升。所述悬浮液中助悬剂的质量浓度可以为0.02～0.1％，优选为0.03～0.08％。

用以配置所述喷液的菌剂中的解淀粉芽孢杆菌可以为其营养体或芽孢。优选为芽孢，芽孢代谢相对静止，抗逆能力强，能够长期保存，利于开发为菌剂。所述解淀粉芽孢杆菌的芽孢可以采用如下方法而获得：利用LB培养基，在30℃温度下培养解淀粉芽孢杆菌3天，大量产生解淀粉芽孢杆菌的芽孢。

<生防制剂>

含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂就是本发明要保护的生防制剂。所述生防制剂通常为含有解淀粉芽孢杆菌的悬浮液，优选地，所述生防制剂为由所述解淀粉芽孢杆菌与含有助悬剂的无菌水配成的悬浮液。所述悬浮液中的所述解淀粉芽孢杆菌的浓度，可以为10⁷～10¹¹个/毫升，优选为10⁸～10¹⁰个/毫升。所述悬浮液中助悬剂的质量浓度可以为0.02～0.1％，优选为0.03～0.08％。所述助悬剂可以为本领域常用的各种助悬剂，例如可以选自吐温、羧甲基纤维素、海藻酸钠、明胶、甘露醇、山梨醇等，优选为吐温，更优选为吐温80。

用以配置所述喷液的菌剂中的解淀粉芽孢杆菌可以为其营养体或芽孢。优选为芽孢，芽孢代谢相对静止，抗逆能力强，能够长期保存，利于开发为菌剂。所述解淀粉芽孢杆菌的芽孢可以采用如下方法而获得：利用LB培养基，在30℃温度下培养解淀粉芽孢杆菌3天，大量产生解淀粉芽孢杆菌的芽孢。优选的保存温度为23～28℃，更优选为24～26℃。

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例涉及到的各种培养基都是本领域常用的标准培养基，例如：

LB液体培养基为胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，氯化钠1％(w/v)，pH7.0-7.2。

LB固体培养基(简称LB培养基)是在上述LB液体培养基的基础上添加了琼脂1.5-2％(w/v)，即为胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，氯化钠1％(w/v)，pH7.0-7.2。

实施例1

本发明的解淀粉芽孢杆菌对玉米大斑病菌抑制作用的简单鉴定：

将本发明的解淀粉芽孢杆菌(菌株D3)和玉米大斑病菌(由中国农业科学院植物保护研究所病害组提供)同时接到PDA平板上。将菌株D3以点接法接到平板中央，将玉米大斑菌接到菌株D3等距离一侧，设置3个重复及空白对照。28℃培养，记录抑菌带宽度。根据抑菌带宽度大小及生长情况可以看出对玉米大斑病的抑制强度。参见图4，本发明的解淀粉芽孢杆菌抑菌带宽，表明其对玉米大斑菌的生长抑制效率很高。

实施例2

本发明的解淀粉芽孢杆菌对玉米大斑病菌抑制作用的进一步鉴定：

纯化后的解淀粉芽孢杆菌(D3菌株)，单菌落接种在LB培养基上，30℃培养48h。挑取一接种环接入装有100mLLB液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm/min振荡培养24h。菌悬液经12000rpm离心，再经孔径0.22μL细菌过滤器过滤。吸取1mL滤液加入到19mL45℃左右的PDA培养基中，混匀，待培养基冷却后，接入直径5mm玉米大斑病菌菌饼，25℃培养。无菌水为对照。每个处理3次重复。培养7d后，采用十字交叉法测量菌落直径。计算抑制率。

抑制率＝[(对照菌直径－处理菌直径)/(对照菌直径－菌饼直径)]×100％。

参见图5，在对照处理下，玉米大斑病菌生长快速，生长7天的菌落直径为3.85cm，而加入菌株D3发酵液的PDA培养基上，玉米大斑病菌生长缓慢，菌落直径为1.22cm，因此计算抑菌率为78.5％。

实施例3

本发明的生防制剂(悬浮液菌剂)的制备方法：

LB培养基，将本发明的解淀粉芽孢杆菌培养3d，30℃，产生大量芽孢。用无菌水(含有0.05重量％吐温80)将芽孢配制成悬浮液，浓度为10⁸个/mL，25℃保存。

其他保存温度的对比试验：

分别在4℃、20℃、25℃、30℃保存1个月、2个月，检测解淀粉芽孢杆菌菌体活力，发现25℃条件下，菌体活力最强，未见衰退，且保存期1个月和2个月菌体活力无显著差别，因此选择该条件为芽孢的保存条件。

实施例4

在玉米植株上测试本发明的解淀粉芽孢杆菌在玉米大斑病生防中的应用的效果。

该测试为温室盆栽试验，尽量排除外界干扰条件。温室位于中国农业科学院植物保护研究所。玉米品种为B73，对玉米大斑病高感。处理和对照分别30株玉米。营养基质为草炭：蛭石按照2：1比例混合。将玉米种子种于营养钵中。当玉米长至六叶期，将实施例3得到悬浮液稀释10倍，通过喷雾法喷到玉米叶片上，24h后，再通过喷雾法将玉米大斑菌分生孢子接种到玉米叶片，浓度为10⁶个/mL。对照为无菌水，然后接种同样的玉米大斑分生孢子悬浮液。每株玉米喷洒枯草芽孢杆菌菌剂10倍稀释液2mL、玉米炭疽菌分生孢子悬浮液2mL和无菌水2mL。温室环境温度为28～30℃，相对湿度80％。培养21d检查玉米叶片发病情况，统计病情指数，计算防效。利用本发明实施例3的悬浮液处理的玉米叶片大斑病发病率病情指数为15，而对照下病情指数为38，实施例3的悬浮液的平均防效为60.5％。

实施例5

解淀粉芽孢杆菌D3在玉米叶片定植能力检测：

实施例4的试验中，调查玉米大斑病病情指数的同时，采回玉米叶片，分离叶片表面细菌，并鉴定是否存在解淀粉芽孢杆菌。用无菌水刷洗玉米叶片表面微生物到1.5ml离心管中，12000rpm离心3min，弃上清后，加入无菌水后重悬，将悬浮液涂布在LB培养基表面，30℃培养24h，待细菌菌落长出后，纯化菌落，并进行16SrDNA鉴定。经鉴定，从玉米叶片表面能够分离出解淀粉芽孢杆菌，占所有分离细菌总数的23.5％。由此可见，解淀粉芽孢杆菌在玉米叶片的定植能力很好，能够持续的发挥生防效果。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA含有如SEQIDNO:1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11488。

3.一种解淀粉芽孢杆菌在玉米大斑病生防中的应用，其特征在于，利用权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌抑制玉米大斑病菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂施于玉米植株上，使所述解淀粉芽孢杆菌在玉米植株上定植，抑制玉米大斑病菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂施于玉米植株上的时期为六叶期以后。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌剂为所述解淀粉芽孢杆菌与含有助悬剂的无菌水配成的悬浮液。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述无菌水中的助悬剂的质量浓度为0.02～0.1％，所述悬浮液中的解淀粉芽孢杆菌的浓度为10⁶～10¹⁰个/毫升。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂施于玉米植株上的方法为，将含有所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂制成解淀粉芽孢杆菌的浓度为10⁷～10⁹个/毫升的喷液进行喷雾。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述喷液的喷施量为5～10升/亩。

10.一种生防制剂，其特征在于，为权利要求6或7所述的应用中的悬浮液。