CN112725218B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法和在防治葡萄溢糖性霉斑病中的应用。本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）LYB219，于2020年11月9日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.21125。本发明获得一株生防效果好的农用生防芽孢菌株—贝莱斯芽孢杆菌LYB219，及其在葡萄溢糖性霉斑病防治中的应用，不仅能提高芽孢萌发效率，其发酵液本身具有较强的抑菌能力，进一步提高生防制剂的应用效果。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法和在防治葡萄溢糖性霉斑病中的应用。

背景技术

葡萄作为一种深受大众喜爱的水果，由于气候环境恶化、大量农化产品的使用等原因，在生产过程中也不断出现新的问题，其中葡萄溢糖性霉斑病就是近年来发现的一种新的真菌病害。健康葡萄果实表皮上会附着大量的真菌微生物，通常青霉属微生物不易在活体葡萄果实表皮附生微生物群落中形成优势地位，推测葡萄溢糖性霉斑有可能是葡萄果实表皮附生微生态被某些因素破坏，从而造成青霉等丝状真菌形成生长优势所引发的病害。目前，已有研究报道巨峰葡萄果实的霉斑为橘青霉。该病害在各类促早栽培及避雨栽培的设施果园中均有发现，果实可溶性固形物含量高、经膨大剂处理、空气湿度大的果园为易发、高发果园。

葡萄溢糖性霉斑病仅在葡萄转色后接近成熟的果实和果柄上发生，尤其是连日降雨，空气湿度大的时期发生。该病一般首先发生在果穗上部，然后逐渐向果穗下部蔓延，初期霉斑为白色，中心有明显的点状凸起，霉斑面积不断扩大，呈雪花状分散在果皮表面，颜色逐渐变深，慢慢霉斑转为灰色，霉斑可被水冲洗掉，中心处点状凸起则不能被水冲洗，点状凸起颜色初期为白色，后期颜色逐渐加深至黑褐色，最终形成痂块。霉斑周围的果粉也随之消失，从而降低了葡萄的商品价值。

目前田间防治多以膨大期、转色期药剂预防为主，以广谱性杀菌剂为主要防治药剂，但各类药剂对于该病的防治效果均不理想，已发生该病的果园，多呈现出连续多年发病的情况。该病发病时葡萄已临近采收期，常规药剂防治安全间隔期很难满足安全生产的要求，且尚未发现有效的治疗药剂。

近年来，人们的环保意识和食品安全意识不断增强，长期使用化学农药所导致的诸如环境污染、农药残留等问题得到了广泛的关注，生物农药由于其所具备的低毒、绿色、安全等特点而得到了快速发展，并使之成为未来农药发展的一个重要方向。植物病害生防微生物包括真菌、细菌和放线菌。细菌由于其抗病机制复杂，包括竞争、拮抗、抗生、寄生、诱导寄主植物抗病性和促进植物生长等特性，同时与真菌和放线菌相比，具有繁殖速度快、营养要求简单、环境适应性良好和根际土壤定殖能力强等优良特性，已成为植物病害生物防治领域的热点。

由于葡萄溢糖性霉斑病发生时葡萄已临近采收期，常规药剂防治安全间隔期很难满足安全生产的要求，同时化学农药的大量使用，还会造成严重的环境污染，也会使得病原菌产生抗性。因此，亟需分离霉斑病菌致病菌并从健康葡萄籽粒分离菌株，筛选对致病菌有拮抗作用的有益菌，有益菌发酵优化后制成制剂应用于葡萄种植上具有较大潜力。

针对四川乃至南方葡萄采摘期易区域性连片感染的溢糖性霉斑病，生物防治是此时期的最佳选择，但其防控技术和产品缺乏的问题；在已经对主要致病菌分离鉴定和系列相关工作的基础上，从高效拮抗菌株筛选、菌株安全性评价、生防菌株发酵优化规模化生产和产品商品性优化等方面进行关键技术研究，初步形成微生物应用制剂和技术；从而促进生物产业发展，促进科技融合创新。同时，减少化学农药的用量，提升葡萄品质和效益，为食品安全保驾护航。

发明内容

本发明为了减少临近采收期发病葡萄的农药残留量，通过从四川省成都市大邑县安仁葡萄产业园的健康葡萄表面分离出的菌株，经过与染病葡萄的致病菌进行拮抗试验，定向筛选出一株对葡萄溢糖性霉斑病有生防效果的贝莱斯芽孢杆菌LYB219菌株。经过研究发现该菌株对葡萄溢糖性霉斑病有较好的防治作用，因此该菌株可作为一种绿色、安全的生防菌株应用到农业生产中。

本发明的首要目的是提供一株对葡萄溢糖性霉斑病具有生防效果的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219，于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNO.21125。

进一步的，所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的16S rDNA序列SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的形态学特征为：单菌落形态呈近圆形，浅黄色，不透明；培养初期菌落表面光滑，边缘整齐，后期表面有褶皱，边缘略不整齐，四周呈云雾状扩散；经革兰氏染色表明：菌株LYB219为革兰氏阳性，杆状，菌体长3.1~6.0μm，宽0.5-0.7μm，芽孢呈椭圆形，近端生，孢囊稍膨大，长1.2~2.0 μm，宽0.6-0.8 μm。

本发明第二方面，提供一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的培养方法，将富集菌株的菌液先在NA培养基上，于35℃培养22-25h；待长出单菌落后挑取单菌落在NA培养基上划线以获得纯化的细菌菌株。

本发明第三方面，提供一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的发酵液，所述发酵液是由以下方法制备得到：将贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的对数期培养液作为种子接种到发酵培养基中，发酵液对数期结束后，按0.1%（V:V）比例加入已培养好的葡萄溢糖性霉斑病菌菌丝，在 35℃，150rpm条件下曝气培养28h ，OD₆₀₀值3~4之间，有大量芽孢形成，即得发酵菌液。

进一步的，提供该菌株最佳抑菌效力的发酵方法，筛选了活菌数和抑菌效率较高的发酵培养基，进一步地在培养基中加入病原真菌菌丝体以刺激贝莱斯芽孢杆菌产生大量的抑菌物质；所述发酵培养基是由以下成分组成：葡萄糖6.0-10.0g/L，酵母膏15.0-25.0g/L，硫酸镁0.3-0.8g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，轻质碳酸钙0.5-1.5g/L，硫酸锰0.01-0.03 g/L；

更进一步的，所述发酵培养基是由以下成分组成：葡萄糖8.0g/L，酵母膏20.0g/L，硫酸镁0. 5g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，轻质碳酸钙1g/L，硫酸锰0.02 g/L。

本发明第四方面，提供一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的水悬浮剂，所述水悬浮剂是由以下制备方法制备得到：在贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）LYB219的发酵液中，按照发酵液质量100%计，添加黄原胶0.15%~0.3wt%、羧甲基纤维素钠0.1~0.2wt%、乙二醇3wt%、改性聚醚 0.3 wt %、甘油3 wt %、对羟基苯甲酸甲酯0.06 wt %、聚醚酯消泡剂0.1 wt %，经过5000~10000rmp高速剪切直至悬浮剂均质化，即得。

本发明第五方面，提供一种上述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219和/或上述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的发酵液和/或上述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的水悬浮剂在葡萄溢糖性霉斑病防治中的应用。

本发明第六方面，通过生物相容性和制剂产品稳定性筛选，提供一种防治葡萄溢糖性霉斑病的微生物菌剂，其活性成分包括上述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）LYB219和/或上述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的发酵液和/或上述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的水悬浮剂。通过筛选的芽孢萌发促进剂，可提高芽孢萌发效率，使其迅速生长定殖形成优势菌群，发挥效果。

进一步的，所述葡萄溢糖性霉斑病的病原菌为链格孢（A. alternata）、尖曲霉（A. aculeatinus）、新拟盘多毛孢（N. chrysea）、奥桑青霉菌（P. olsonii）、踝节菌（T. atroroseus）、塔宾曲霉（A. tubingensis）、烟曲霉（A. fumigatus）、黑曲霉（A. niger）、橘青霉（P. citrinum）、Penicillium georgiense或Penicillium brocae中的至少一种。

本发明第七方面，提供一种上述防治葡萄溢糖性霉斑病的微生物菌剂的使用方法，通过将所述微生物菌剂用水稀释300~500倍，加入稀释液质量的1%的磷酸盐缓冲液、0.1%渗透性助剂有机硅、1%氨基酸以及2%的葡萄糖，自葡萄花谢后起进行喷施，每隔15天喷施一次，共喷施4次。

本发明针对作物病害专一性强，从菌株筛选、抑制病原菌机理到菌株的商品化、菌株田间应用效果的提升方面做了对应的创新，新颖性强，具有实质性进步，能解决农业生产实际问题。

本发明获得一株生防效果好的农用生防芽孢菌株—贝莱斯芽孢杆菌LYB219，及其在葡萄溢糖性霉斑病防治中的应用，不仅能提高芽孢萌发效率，其发酵液本身具有较强的抑菌能力，进一步提高生防制剂的应用效果。

附图说明

图1 葡萄溢糖性霉斑病上分离的病原真菌形态；

其中，LYF 32为链格孢（Alternaria alternata）；

其中，LYF 33为尖曲霉（Aspergillus aculeatinus）；

其中，LYF 34为新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis chrysea）；

其中，LYF 37为奥桑青霉菌（Penicillium olsonii）；

其中，LYF 91为踝节菌（Talaromyces atroroseus）；

其中，LYF 98为Penicillium georgiense；

其中，LYF 99为塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）；

其中，LYF 100为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）；

其中，LYF 105为黑曲霉（Aspergillus niger）；

其中，LYF 108为橘青霉（Penicillium citrinum）；

其中，LYF 110为Penicillium brocae。

图2为贝莱斯芽孢杆菌LY219对病原菌的抑制效果，对照为菌丝正常生长条件下显微镜下形态，LY219处理后在显微镜下可观察到破坏病原菌细胞壁。

图3为葡萄霉斑病菌系统发育树。

图4为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219菌落和菌体形态；

其中，A为单菌落形态；B为10×100倍菌体；C为正在形成芽孢。

图5为基于16S rDNA（27f/1492r）序列构建的系统发育进化树。

图6为基于gyrB（UP1f/UP2r）序列构建的系统发育进化树。

图7为LYB219对葡萄溢糖性霉斑病的防治效果；

其中，A：清水处理的空白对照（CK）；

其中，B：LYB219发酵液稀释100倍的处理效果

其中，C：LYB219发酵液稀释300倍的处理效果；

其中，D：LYB219发酵液稀释500倍的处理效果。

具体实施方式

结合实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

葡萄霉斑病菌的分离培养与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的分离纯化

（1）葡萄溢糖性霉斑病菌的分离与鉴定

从四川省成都市大邑县安仁葡萄产业园采集发病的葡萄500g，采用组织分离法分离病原真菌。挑取发病严重的10粒葡萄，用镊子撕下发病的葡萄表皮，置于75%的酒精中浸数秒后，放入灭菌水中连续漂洗3次，然后将带病组织移至马丁氏培养基表面，每皿可放4~5块，将培养皿置于28℃的恒温培养箱中培养3~4d，再纯化分离的菌株，将纯化的菌株回接到健康的葡萄，观察发病情况。挑取能引起葡萄发病的菌株于PDA液体培养基中，于28℃，150rpm恒温培养3~4d，收集菌丝，采用CTAB法提取DNA。采用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1和ITS4对葡萄溢糖性霉斑病菌的DNA进行PCR扩增。扩增引物序列如下：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

将PCR扩增产物由上海生工测序，测序结果在NCBI数据库进行Blast比对，并采用MEGA 8.0采用Neighbor-Joining Tree法构建系统发树。

从发病的葡萄上面分离出11株病原真菌（图1），将这些真菌回接到健康葡萄上面都能引起不同程度的发病。通过测序、序列比对和构建进化树（图2），这11株致病菌分别是链格孢（A. alternata）、尖曲霉（A. aculeatinus）、新拟盘多毛孢（N. chrysea）、奥桑青霉菌（P. olsonii）、踝节菌（T. atroroseus）、塔宾曲霉（A. tubingensis）、烟曲霉（A. fumigatus）、黑曲霉（A. niger）、橘青霉（P. citrinum）、P. brocae，主要分布于青霉菌属和曲霉菌属。

（2）贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的分离纯化

从四川省成都市大邑县安仁葡萄产业园采集健康葡萄500g，取10粒健康的葡萄加入100ml无菌水中，静置30min后，置于30℃、150rpm充分振荡摇匀，依次取1ml滴入含9ml无菌水的试管中，依次稀释10^-1，10^-2，10^-3倍。分别取100μl均匀涂布于牛肉膏蛋白胨（NA）培养基上，每个浓度设置3个重复，置于35℃培养箱中静置培养2d。待长出单菌落挑取单菌落在NA培养基上划线以获得纯化的细菌菌株。以能引起葡萄致病的菌株作为指示菌，采用点接法和对峙平板法进行拮抗菌株的筛选。通过显微镜观察发现，LY219可破坏病原菌细胞壁结构从而抑制病原菌生长。从而筛选出对葡萄溢糖性霉斑病有明显抑制效果的贝莱斯芽孢杆菌LYB219，同时将LYB219接种到健康成熟的葡萄表面，不会引起葡萄发病。

实施例2

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LYB219的鉴定

（1）菌体的形态特征

贝莱斯芽孢杆菌LYB219在NA培养基上生长后，单菌落形态呈近圆形，浅黄色，不透明；培养初期菌落表面光滑，边缘整齐，后期表面有褶皱，边缘略不整齐，四周呈云雾状扩散。经革兰氏染色表明：菌株LYB219为革兰氏阳性，杆状，菌体长3.1~6.0μm，宽约0.6μm，芽孢呈椭圆形，近端生，孢囊稍膨大，长1.2~2.0 μm，宽约0.7 μm（图3）。

（2）菌株的生理生化特征

对贝莱斯芽孢杆菌LYB219进行生理生化鉴定，并将其生理生化特征参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)和《常见细菌系统鉴定手册》中的检索表进行检索，确定其特征符合芽孢杆菌的生理生化特征。通过酶触反应、葡萄糖氧化发酵、糖醇类发酵、淀粉水解、柠檬酸利用等实验进行生理生化检测。结果表明，甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验、明胶水解、淀粉水解、酪氨酸水解、接触酶、硝酸盐还原、葡萄糖发酵(产酸)呈阳性反应；该菌株能够利用麦芽糖、乳糖、蔗糖、D-葡萄糖、D-甘露醇、可溶性淀粉、甘露糖，不能利用柠檬酸盐、D-木糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖；硫化氢试验、吲哚试验、氧化酶试验呈阴性；能够在含有10%NaCl的培养基上生长；最高耐受温度45℃。

注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。

（3）菌株的分子生物学鉴定

取斜面保存的菌株，在NA平板上划线活化，挑单菌落于含有50mL的NB液体培养基中，30℃、150rpm/min过夜培养。采用生工细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取LYB219基因组DNA。用细菌16S rDNA通用引物（27f/1492r）和看家基因gyrB(UP1f/UP2r)进行PCR扩增。扩增引物序列如下：

27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

UP1f：5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’

UP2r：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’

16S rDNA通用引物（27f/1492r）PCR扩增体系：总体系25μL，10×mix 10μL，引物各0.5μL，模板 1μL，ddH2O 13μL；PCR扩增条件：94℃ 3min，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃2min，共30个循环，72℃ 7min，4℃保存。

gyrB(UP1f/UP2r)PCR扩增体系：总体系25μL，10×mix 10μL，引物各0.5μL，模板 1μL，ddH2O 13μL；PCR扩增条件：95℃ 5min，94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 3min，共30个循环，72℃ 7min，4℃保存。

将PCR扩增产物由上海生工测序，测序结果在NCBI数据库进行Blast比对，并采用MEGA 8.0采用Neighbor-Joining Tree法构建系统发树。

根据16SrDNA序列和gyrB 基因PCR扩增测序结果，在NCBI网站上进行BLAST比对并构建进化树（图4，图5），发现菌株LYB219与Bacillus velezensisQ2B1（MK629006.1）等的同源性均大于99%。菌株LYB219与多个Bacillus velezensis聚于同一分支，结合形态特征，将菌株LYB219鉴定为贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis。

关于 Bacillus velezensis毒理学和致病性，经文献检索，为安全菌株，可进一步开发应用。

实施例3

贝莱斯芽孢杆菌LYB219对橘青霉等葡萄溢糖性霉斑病菌的抑制效果

（1）菌体对橘青霉等葡萄溢糖性霉斑病菌的抑制效果

将贝莱斯芽孢杆菌LYB219在NA培养基上活化，直至长出单菌落，挑单菌落接种到NB培养基中，35℃、150rpm培养18h，将培养好的发酵液5000rpm离心5min，保存上清液备用，用无菌水悬浮菌体，离心弃上清液，重复一次得菌体，用无菌水将菌体的OD600调至0.5~0.8备用。

将病原真菌接种到PDA培养基上，于28℃培养3d~5d。将培养好的病原真菌用打孔器（直径5mm）打取菌饼，将菌饼接种到直径为9cm PDA平板的中心位置，并在距菌饼2cm的4个分区接种2μl的菌体悬浮液，每个处理3个重复。将平板置于28℃黑暗培养3d~5d，测量各处理病原真菌的菌落直径，并计算抑菌率。

（2）发酵滤液对橘青霉等葡萄溢糖性霉斑病菌的抑制效果

将上述制备好的发酵上清液经过孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用融化的培养基稀释100倍、300倍和500倍，倒平板。在平板的中心位置接种病原真菌菌饼，每个处理3个重复。将平板置于28℃黑暗培养5d，测量各处理病原真菌的菌落直径，并计算抑菌率。

本实施例以11种葡萄溢糖性霉斑病原真菌为指示菌，测试贝莱斯芽孢杆菌LYB219及其代谢产物对病原真菌的抑制效果。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌LYB219对11种葡萄溢糖性霉斑病原真菌均有明显的拮抗作用（表2），表明LYB219及其代谢产物的抑菌活性强，抑菌谱广。

表2 贝莱斯芽孢杆菌LYB219菌体、不同稀释倍数的发酵上清液对葡萄溢糖性霉斑病病原真菌的抑制效果

注：“＋＋＋”表示抑制率>90%；“＋＋”表示60%＜抑制率＜90%；“＋”表示5%＜抑制率＜60%；“－”表示抑制率＜5%。

实施例4

贝莱斯芽孢杆菌发酵液抑菌效力的提升方法

以抑菌效力和有效活菌数为指标，通过响应面法进行培养基配方筛选及发酵条件优化，筛选出最优发酵培养基配方为葡萄糖8.0g/L，酵母膏20.0g/L，硫酸镁0. 5g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，轻质碳酸钙1g/L，硫酸锰0.02 g/L，同时，在菌株对数期结束后，按0.1%（V:V）比例加入已培养好的葡萄溢糖性霉斑病菌菌丝，在 35℃，150rpm，通气量0.5L/min，罐压0.02MPa，发酵28h ，OD600值3~4之间有大量芽孢形成，即得有效活菌数达200亿个/ml，抑菌效力强的发酵菌液。同时，将此配方发酵的菌液与其他文献和专利所报道的贝莱斯芽孢杆菌在防治其他病害上的发酵配方（表3）制备的菌液进行对比发现，本发明所筛选的配方10发酵菌液的抑菌活性和有效活菌数均显著高于其他配方，进一步提高抑菌效力的方法形成的配方11，如表4所示。

表4 不同培养基发酵的LYB219的抑菌效力和有效活菌数

注：“＋＋＋＋”表示抑制率>90%；“＋＋＋”表示80%＜抑制率＜90%；“＋＋”表示30%＜抑制率＜80%；“＋”表示5%＜抑制率＜30%；“－”表示抑制率＜5%。

实施例5

贝莱斯芽孢杆菌水悬浮剂的制备

（1）水悬浮剂助剂的筛选

将常见微生物制剂的助剂对菌株的萌发及生长的影响作为指标，设计生物相容性实验。将助剂按表5所示添加到灭菌的NA固体培养基中，待冷却至60℃左右，倒平板；将菌液制备成有效活菌数（芽孢数）约为1000~1500个/mL的稀释液，每皿加入100μL稀释液进行涂布，重复3次。将涂好的平板置于35℃培养48h，统计芽孢萌发率。菌株水悬浮制剂中各助剂添加浓度对芽孢萌发的影响结果表明，只有润湿剂分散剂改性聚醚和防腐剂对羟基苯甲酸甲酯在不稀释时对LYB219的芽孢萌发有100%的抑制作用，其余助剂和稀释300倍的改性聚醚和对羟基苯甲酸甲酯对芽孢萌发无明显的抑制作用，如表5所示。润湿剂分散剂改性聚醚和防腐剂对羟基苯甲酸甲酯在不稀释的情况下可抑制芽孢萌发，但不杀死芽孢，也可增加商品稳定性。

表5 生物相容性添加物质种类、名称、含量及芽孢萌发率

（2）水悬浮剂成分配比

根据文献报道及市场上产品样品分析，设置了以下水悬浮剂成分配比，如表6所示。根据不同的配方首先在发酵液里添加润湿分散剂，充分搅拌均匀后再添加其他组分，最后高速剪切直至悬浮剂均质化。根据国标HG/T 2467.1-2467.20-2003、HG/T 2467.1-2467.20-2003 4.9和GB T 14825-2006测定不同配方菌剂的低温稳定性、热储稳定性、倾倒性、悬浮性，结果如表7 所示，配方5是水悬浮剂最优的组合。

表6 不同的水悬浮剂配方表

表7 根据不同配方水悬浮剂的项目指标测定

注：“＋＋＋”表示效果好，“＋＋”效果一般，“＋”效果较差，“—”没有效果。

（3）贝莱斯芽孢杆菌水悬浮剂的制备

发酵液的制备见实施例四，发酵液的水悬浮剂的制备如下：

在发酵罐液中加入黄原胶0.15%~0.3%、羧甲基纤维素钠0.1~0.2%、乙二醇3%、润湿分散剂改性聚醚 0.3%、甘油3%、对羟基苯甲酸甲酯0.06%、聚醚酯消泡剂0.1%，高速剪切直至悬浮剂均质化即得稳定的具有商品性的产品。

实施例6

实验室平板培养条件下，芽孢萌发剂的筛选

为让改产品能够应用后芽孢快速萌发，迅速定殖占领优势地位。分别制备不添加任何物质的水琼脂和含不同浓度的葡萄糖、磷酸盐缓冲液、渗透性助剂有机硅、氨基酸的水琼脂，经灭菌后倒平板，将有效活菌数为1500~2000个/ml的LYB219孢子液用移液枪吸取100μl均匀涂布于制备好的水琼脂平板上，每个处理设置3个重复。将平板置于35℃的恒温培养箱中倒置培养2d，统计芽孢萌发率。如表8所示，1%的磷酸盐缓冲液、0.1%渗透性助剂有机硅、1%氨基酸以及2%的葡萄糖在促进LYB219芽孢萌发效果最佳。考虑到成本和促进芽孢萌发的机理，选用1%的磷酸盐缓冲液、0.1%渗透性助剂有机硅、1%氨基酸和2%的葡萄糖作为芽孢萌发剂。

实施例7

贝莱斯芽孢杆菌应用制剂对葡萄溢糖性霉斑病的抑制效果

（1）田间生防试验

将贝莱斯芽孢杆菌水悬浮剂分别将发酵液稀释100倍、300倍和500倍，且在稀释液中加入1%的磷酸盐缓冲液、0.1%渗透性助剂有机硅、1%氨基酸以及2%的葡萄糖搅拌均匀备用。

在葡萄基地挑取葡萄溢糖性霉斑病发病严重的相似地块，分别设置空白对照组（CK）、发酵液稀释100倍组（处理1）、发酵液稀释300倍组（处理2）和发酵液稀释500倍组（处理3）。在葡萄花谢后分别用清水、稀释100倍的发酵液、稀释300倍的发酵液和稀释500倍的发酵液，进行喷施，每隔15d喷施1次，共4次。调查发病情况，计算病果率和防治效果：

（2）实验结果

用含有LYB219的发酵液对发病严重的葡萄进行喷施，葡萄溢糖性霉斑病防治效果明显，如表9所示，处理1和处理2的葡萄溢糖性霉斑病发病率分别降低了53.62%、24.26%。处理1和处理2的发病率和病情指数与CK相比，差异显著。同时，处理1和处理2的防效反别达到了62.43%、43.85%。该实验结果说明贝莱斯芽孢杆菌对葡萄溢糖性霉斑病具有良好的防治效果。

表9 贝莱斯芽孢杆菌LYB219对葡萄溢糖性霉斑病的防治效果

注：不同的字母表示在5%水平上差异显著，反之不显著。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

<110> 四川省兰月科技有限公司

<120>一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法和应用

<160> 3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列引物列(Artificial Sequence) (ITS1)

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag

<210>2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列列(Artificial Sequence) (ITS4)

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt

<210> 3

<211>19

<212> DNA

<213> 人工序列引物列(Artificial Sequence) (27f)

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 3

agagtttgat cctggctcag

<210>4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列列(Artificial Sequence) (1492r)

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 4

ggttaccttg ttacgactt

<210>5

<211>1417

<212> DNA

<213> B. velezensis

<223> 16s rDNA

<400> 5

cggcggctgg ctcctaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt 60

gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 120

ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt 180

tgtgggattg gcttaacctc gcggtttcgc tgccctttgt tctgtccatt gtagcacgtg 240

tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300

tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc 420

tgtcactctg cccccgaagg ggacgtccta tctctaggat tgtcagagga tgtcaagacc 480

tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600

gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagtt 720

acagaccaga gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc 780

tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc 840

cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgag ccctttacgc 900

ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960

gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtgccgccct atttgaacgg cacttgttct 1020

tccctaacaa cagagcttta cgatccgaaa accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt 1080

cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt 1140

gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt cgccttggtg 1200

agccgttacc tcaccaacta gctaatgcgc cgcgggtcca tctgtaagtg gtagccgaag 1260

ccacctttta tgtctgaacc atgcggttca aacaaccatc cggtattagc cccggtttcc 1320

cggagttatc ccagtcttac aggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctaa 1380

catcagggag caagctccca tctgtccgct cgactgc 1417

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列引物列(Artificial Sequence) (UPIf)

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 6

gaagtcatca tgaccgttct gcaygcnggn ggnaarttyg a

<210>7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列 (artificial sequence) (up2r)

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400> 7

agcagggtac ggatgtgcga gccrtcnacr tcngcrtcng tcat

<210>8

<211>1171

<212> DNA

<213> B. velezensis

<223> gyrB DNA

<400> 8

ggaagcggat ataaagtatc cggcggtctt cacggtgtag gggcgtccgt cgtaaacgcc 60

ttgtcgacca ctcttgacgt tacggttcat cgtgacggaa aaatccacta tcaggcgtac 120

gagcgcggtg tgcctgtggc cgatcttgaa gtgatcggtg atactgataa gaccggaacg 180

attacgcact tcgttccgga tccggaaatc ttcaaagaaa caactgtata cgactatgat 240

ctgctttcaa accgtgtccg ggaattggcc ttcctgacaa aaggcgtaaa catcacgatt 300

gaagacaaac gtgaaggaca agaacggaaa aacgagtacc actacgaagg cggaatcaaa 360

agctatgttg agtacttaaa ccgttccaaa gaagtcgttc atgaagagcc gatttatatc 420

gaaggcgaga aagacggcat aacggttgaa gttgcattgc aatacaacga cagctataca 480

agcaatattt attctttcac aaataatatc aacacatacg aaggcgggac gcacgaggcc 540

ggatttaaaa ctggtctgac ccgtgtcata aacgactatg caagaagaaa agggattttc 600

aaagaaaatg atccgaattt aagcggggat gatgtgagag aagggctgac tgccattatt 660

tcaattaagc accctgatcc gcaattcgaa gggcagacga aaaccaagct cggcaactct 720

gaagcgagaa cgatcactga cacgctgttt tcttctgcgc tggaaacatt ccttcttgaa 780

aatccggact cagcccgcaa aatcgttgaa aaaggtttaa tggccgcaag agcgcggatg 840

gcagcgaaaa aagcgcggga attgacccgg cgcaaaagtg cgcttgagat ttccaatctg 900

ccgggcaaac tggcggactg ttcttctaaa gatccgagca tttccgagct gtatatcgta 960

gagggtgact ctgcgggcgg atcagcgaaa cagggacggg accgtcattt ccaagccatt 1020

ctgccgctgc gcggtaagat tctgaacgtt gagaaagcca gacttgataa gattctctca 1080

aacaatgagg tcagatcaat gatcccggcc ctcggaacag gaatcggcga agattttaat 1140

cttgaaaaag cgcgttatca taaagtggtt a 1171

Claims (9)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LYB219，于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.21125。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LYB219的培养方法，其特征在于，将富集菌株的菌液先在NA培养基上，于35℃培养22-25h；待长出单菌落后挑取单菌落在NA培养基上划线以获得纯化的细菌菌株。

3.权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LYB219的发酵液。

4.根据权利要求3所述的发酵液，其特征在于，其中发酵培养基是由以下成分组成：葡萄糖6.0-10.0g/L，酵母膏15.0-25.0g/L，硫酸镁0.3-0.8g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，轻质碳酸钙0.5-1.5g/L，硫酸锰0.01-0.03g/L。

5.权利要求1或2所述的贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LYB219的水悬浮剂。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LYB219和/或权利要求3所述贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LYB219的发酵液和/或权利要求5所述贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LYB219的水悬浮剂在葡萄溢糖性霉斑病防治中的应用。

7.一种防治葡萄溢糖性霉斑病的微生物菌剂，其活性成分包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LYB219和/或权利要求3所述贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LYB219的发酵液和/或权利要求5所述贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)LYB219的水悬浮剂。

8.据权利要求7所述的微生物菌剂，其特征在于，所述葡萄溢糖性霉斑病的病原菌为链格孢(Alternaria alternata)、尖曲霉(Aspergillus aculeatinus)、新拟盘多毛孢(Neopestalotiopsis chrysea)、奥桑青霉菌(Penicillium olsonii)、踝节菌(Talaromyces atroroseus)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、橘青霉(Penicillium citrinum)、Penicilliumgeorgiense或Penicillium brocae中的至少一种。

9.权利要求7所述的防治葡萄溢糖性霉斑病的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，将所述微生物菌剂用水稀释300～500倍，加入稀释液质量的1％的磷酸盐缓冲液、0.1％渗透性助剂有机硅、1％氨基酸以及2％的葡萄糖，自葡萄花谢后起进行喷施，每隔15天喷施一次，共喷施4次。

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