CN115074258B - 一种球孢白僵菌Bals-1722及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种球孢白僵菌Bals‑1722及其应用。所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals‑1722已于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62530。该菌是一种高致病力昆虫病原真菌，对十星瓢萤叶甲、甘薯小象甲和黄野螟具有高致病力，经长期的侵染生物学和室内生物测定，表明该菌株对十星瓢萤叶甲、甘薯小象甲和黄野螟具有很强的侵染杀虫效果，用于制备具有高致病力的活体生物农药，防治十星瓢萤叶甲、甘薯小象甲和黄野螟等鞘翅目和鳞翅目害虫。
Description
技术领域
本发明涉及害虫生物防治技术领域，具体地，涉及一种球孢白僵菌Bals-1722及其应用。
背景技术
十星瓢萤叶甲(Oides decempunctata Billberg)，属鞘翅目(Coleoptera)，叶甲科(Chrysomelidae)，又名葡萄十星叶甲、葡萄金花虫。寄主植物主要有柑橘和葡萄等果树，此外，对山葡萄、地锦、爬山虎、紫藤、藤本月季、蔷薇和牡丹等园林植物也会造成较大的危害。其幼虫行动较为缓慢，啃食爬山虎嫩叶，造成叶片孔洞、缺刻；成虫啃食爬山虎嫩叶，造成叶片孔洞、不规则状缺刻，甚至啃食叶片后只留下叶脉。十星瓢萤叶甲是重要的农业害虫，被害植株叶片被十星瓢萤叶甲严重啃食，叶片发灰无光泽，失去营养变黄，整株表现为叶片枯黄脱落。目前国内外对十星瓢萤叶甲的研究进程仍处于初步的形态学特征与生物学特性观察等方面，尚未发现关于十星瓢萤叶甲致病真菌的报道。
甘薯小象甲(Cylas formicarius)属鞘翅目(Coleoplera)三锥象甲科(Brentidae)，又名甘薯蚁象，是国际和国内重要的检疫性害虫。甘薯小象甲可以为害甘薯和蕹菜等旋花科植物，其中对甘薯的危害最大，是甘薯生长期和储藏期的重要害虫。甘薯小象甲的成虫咬食薯藤、叶、幼芽及薯块，其幼虫蛀食粗蔓和薯块，在薯块内部形成隧道，受蛀食部位被诱导产生萜类和酚类等物质，薯块被害后则具有恶臭味道，直接影响甘薯的品质和产量，人和家畜不能食用，一般可造成甘薯产量损失10％～30％，严重者在50％以上，甚至绝收。目前甘薯的大田生产中多用辛硫磷、毒死蜱、乐果、敌百虫和锐劲特等化学药剂对甘薯小象甲进行化学防治。由于化学防治对于环境及其他生物也造成危害，因此急需寻求一种绿色防控技术手段。
黄野螟(Heortia vitessoides Moore)属鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)昆虫，广泛分布于我国广东、广西、海南和云南等南方各省区及香港特别行政区。黄野螟是典型的寡食性害虫，仅取食沉香属(Aquilaria)和漆树属(Rhus)等少数几种植物，是我国土沉香种植区害虫防治的重点对象。黄野螟以幼虫群集咬食叶片，具有爆发性、暴食性特点，发生时，数日内可将叶片与嫩梢吃光，持续为害时可导致土沉香整株死亡。目前对黄野螟的防治研究早期主要集中于药剂防治，多用敌百虫、马拉硫磷和阿维菌素等化学药剂。但针对黄野螟的防控方法，不仅需要考虑经济效益，还要考虑生态效益和社会效益，化学农药使用过度会造成的一系列环境和药材污染问题，因此开发出高效绿色的生物农药，是防控黄野螟的重要策略。
生物防治是指利用生物及其代谢产物防治植物病原体、害虫和杂草的方法。与其它方法相比，对人畜、生态环境安全，高效持效，已成为对害虫最有效和最具应用前景的防治手段。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种虫生真菌，通过菌丝穿透宿主昆虫的体壁，吸收宿主营养，最终导致宿主死亡，是害虫绿色防控中的理想生防菌。寻找到对宿主昆虫具有高致病力的球孢白僵菌(Beauveri a bassiana)对于开展生物防治具有非常重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种球孢白僵菌Bals-1722及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722
本发明的第二个目的是提供所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722在防治叶甲、象甲和/或螟蛾昆虫中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种生防制剂。
本发明的第四个目的是提供所述的生防制剂在防治叶甲、象甲和/或螟蛾昆虫中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种防治叶甲、象甲和/或螟蛾昆虫的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722，所述球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Bals-1722已于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62530。
所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722在防治叶甲、象甲和/或螟蛾昆虫中的应用。
优选地，所述叶甲昆虫为十星瓢萤叶甲；所述象甲昆虫为甘薯小象甲；所述螟蛾昆虫为黄野螟。
一种生防制剂，所述生防制剂中包含所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722和/或其发酵产物。
所述的生防制剂在防治叶甲、象甲和/或螟蛾昆虫中的应用。
一种防治叶甲、象甲和/或螟蛾昆虫的方法，用所述的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Bals-1722和/或其发酵产物进行防治。
优选地，所述叶甲昆虫为十星瓢萤叶甲，所述象甲昆虫为甘薯小象甲；所述螟蛾昆虫为黄野螟。
优选地，防治十星瓢萤叶甲，所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的浓度为1×106～1×108孢子/mL。
优选地，防治甘薯小象甲，所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的浓度为2.5×107～2.5×108孢子/mL。
优选地，防治黄野螟，所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的浓度为2.5×107～2.5×108孢子/mL。
优选地，所述十星瓢萤叶甲为十星瓢萤叶甲幼虫和/或成虫。
优选地，所述甘薯小象甲为甘薯小象甲成虫。
优选地，所述黄野螟为黄野螟幼虫。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种球孢白僵菌Bals-1722及其应用。所述球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Bals-1722已于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62530。该菌是一种高致病力昆虫病原真菌，对十星瓢萤叶甲、甘薯小象甲和黄野螟具有高致病力，经长期的侵染生物学和室内生物测定，表明该菌株对十星瓢萤叶甲、甘薯小象甲和黄野螟具有很强的侵染杀虫效果，用于制备具有高致病力的活体生物农药，防治十星瓢萤叶甲、甘薯小象甲和黄野螟等鞘翅目和鳞翅目害虫。
附图说明
图1为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的菌落正面形态图。
图2为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的菌落背面形态图。
图3为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的孢子形态图。
图4为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的分子鉴定系统发育树。
图5为十星瓢萤叶甲幼虫感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的状态。
图6为十星瓢萤叶甲成虫僵虫感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的状态。
图7为不同浓度球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的孢子悬浮液对十星瓢萤叶甲幼虫的死亡率。
图8为不同浓度球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的孢子悬浮液对甘薯小象甲成虫的死亡率。
图9为甘薯小象甲成虫感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的状态。
图10为黄野螟虫体经保湿处理后出现白色菌丝，其中A为接菌3d后虫体出现少许白色菌丝，B为接菌7d后菌丝几乎覆盖整个虫体，C为接菌14d后菌丝完全包裹整个虫体。
图11为不同浓度球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的孢子悬浮液对黄野螟3龄幼虫的死亡率。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1菌株的分离与鉴定
一、实验方法
1、材料来源
(1)样品：供试菌株由广东海洋大学植物保护实验室继代保存，对该菌株保存样品采用单胞分离法获得纯化菌株。
(2)配置马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：称量去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g。将马铃薯切成小块放入锅中，加水1000mL，煮沸30min，用纱布滤去马铃薯残渣，得马铃薯滤液。将马铃薯滤液和15.0g琼脂加入锅中加热融化，随后加入葡萄糖20.0g，葡萄糖溶解后用去离子水定容至1000mL，按每瓶200mL分装于锥形瓶中，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌(121℃，30min)。
(3)无菌操作条件：所有器皿和用具均经高压灭菌(121℃，103.4kPa，30min)，于超净工作台进行接种等操作。
(4)培养条件：置于28℃光照(L∶DL14∶10)恒温培养箱中培养，待菌落形成后，转移到步骤(2)的PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。
2、菌株的分离与纯化
(1)分离
供试菌株由发明人徐进、郭良珍于2020年9月采集于广东海洋大学校园景观植物爬山虎植株上被寄生的十星瓢萤叶甲幼虫虫体。采集方法为：用5％的次氯酸钠溶液对十星瓢萤叶甲幼虫虫体样品表面消毒，消毒后将虫体样品用无菌水清洗三次，将虫体上的菌丝用无菌镊子溶于少量无菌水中，摇晃震荡后，蘸取溶有菌丝的无菌水涂布于配置好的PDA平板中，倒置于28℃光照(L∶DL14∶10)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面上，放入4℃冰箱贮存。
(2)纯化
将步骤(1)分离的供试菌株在PDA培养基上于28℃光照(L∶DL14∶10)恒温箱中培养10d，待其产孢后，刮取菌丝，制成1×103分生孢子/mL的孢子悬浮液，将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入培养基，放在28℃光照(L∶DL14∶10)恒温培养箱中培养，获得纯化分离菌株。
3、菌株的分离筛选
高产优质的菌株筛选与获得是取得较好防治效果的首要前提。菌株筛选主要考虑的3个指标分别是产孢量、菌落生长速率、致病力。本发明以这些指标为依据，进行优良菌株的筛选。
(1)供试菌株的处理
将步骤2的纯化菌株，在PDA平板上于28℃的恒温箱中光照(L∶DL14∶10)培养。
(2)供试昆虫与寄主植物
十星瓢萤叶甲，采集自广东海洋大学校园景观植物爬山虎上。
(3)菌落生长速率和产孢量的测定
将纯化菌株配成1×107分生孢子/mL浓度的悬浮液，取1mL滴入直径为9cm的PDA平板上内，用三角玻璃棒涂布均匀，待培养7d长出菌丝后，用直径为13mm的打孔器取新鲜菌落，接种于PDA培养基上，6个重复，于接种后第3d、6d、9d、12d测量菌落直径，并在第12d收集分生孢子，用血球计数板测定产孢量。
(4)纯化菌株对十星瓢萤叶甲的致病力
将所得纯化菌株接种于PDA平板上培养10d后，用0.05％Tween-80无菌水收集分生孢子，配成1×108个/mL孢子悬浮液。一株爬山虎上放入15头十星瓢萤叶甲成虫，将配好的孢子悬浮液喷洒至有十星瓢萤叶甲的爬山虎叶片上，形成水滴，用90目网罩将该株植物罩住，确保十星瓢萤叶甲在网罩内活动。用0.05％Tween-80喷洒十星瓢萤叶甲的爬山虎叶片作为对照，重复3次。
将植株放置于27±1℃、湿度RH 80％、光照(L∶DL14∶10)：10D的人工气候箱饲养，每天观察并记录成虫存活情况。
(5)纯化菌株的筛选情况
在筛选优良分离株时，以菌株的产孢量、致病力、菌落生长速率为重要的参考指标。在本发明中，通过这三个指标来比较所得纯化菌株的性状。
4、纯化菌株的鉴定
对纯化菌株进行形态学及分子生物学鉴定，使用PCR扩增纯化菌株的rDNA-ITS序列片段，并在NCBI网站，将该序列在GenBank数据库中进行Nucleotide BLAST比对。选取rDNA-ITS序列片段，使用MEGA7.0软件，运用邻接法(Neighbor-Joining method，NJ)，Bootstrap method重复抽样1000次，系统发育树模型选择p-distance，构建系统发育进化树。
二、实验结果
1、所得纯化菌株的菌落生长速率和产孢量见表1，由此可见该菌生长速度快，产孢量大。
表1所得纯化菌株的菌落生长速率和产孢量
2、纯化菌株对十星瓢萤叶甲成虫的致病力研究结果如表2所示。生物测定结果表明，感染10d后，十星瓢萤叶甲成虫的累计校正死亡率为91.67％，致死中时(LT50)为5.7d，线性回归方程为YL1.963X-2.627；线性回归分析中，相关性系数为0.986(接近1)，说明成虫累计死亡数与侵染天数高度正相关；显著性(P)为0.00<0.01，认为模型在aL0.01的水平上极显著(**)；成虫死亡后的僵虫率为93.75％。
表2纯化菌株对十星瓢萤叶甲成虫的致病性分析
3、纯化菌株的性状优良，呈现较强的产孢能力，通过纯化菌株对十星瓢萤叶甲成虫的累计校正死亡率(表2)，可知其对十星瓢萤叶甲具有较高的致病力。
4、该纯化菌株属肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属。
菌株平板正面单个菌落为近圆形，后期菌落中心位置会产生一个凸起的圆，菌落呈乳白色，边缘有透明圈，质地呈棉花状，非常蓬松(图1)。平板背面菌落呈乳黄色，后期出现淡红色(图2)，分生孢子无色、透明，外部光滑，形状为球形，分生孢子在分生孢子梗上或孢子囊内簇生(图3)。
登录NCBI网站，将该纯化菌株rDNA-ITS序列在GenBank数据库中进行NucleotideBLAST比对，发现纯化菌株的ITS序列与GenBank数据库中已报道的多个球孢白僵菌(Beauveria bassiana)对应序列的相似性均达到99.82％及以上。
系统发育进化树如图4所示，该菌株与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)聚为一支，说明该菌株为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。
目的菌株与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，登录号为MT529272.1，聚于系统发育进化树最小分支，亲缘关系最近，同源性最高。结合形态学鉴定结果，可以确定纯化菌株为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。将该菌株命名为：球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Bals-1722，并于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为：GDMCC No：62530，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲的致病力测定
一、实验方法
生物测定是检验虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，为综合评价该虫生真菌的生物防止潜力提供重要的参考依据。本发明就球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲幼虫、成虫的致病力进行测定，以确定出其对十星瓢萤叶甲致死的最佳虫态、浓度。
1、供试昆虫与寄主植物
十星瓢萤叶甲：广东海洋大学湖光校区采集，接种于干净健康的爬山虎植株上，植株高约30～40cm。每株植株约接入幼虫/成虫20头，用90目尼龙网罩罩住每一株爬山虎。
2、供试菌株的处理
经实施例1纯化处理获得的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株，用PDA平板，于28℃的恒温箱光照(L∶DL14∶10)中培养10d，挑取生长良好的菌落，倒入20mL0.05％的吐温-80无菌水，用接种针轻轻刮取PDA平板上真菌的菌丝及孢子，将其倒入烧杯中，经磁力搅拌器搅拌30min，待孢子分散均匀后，用两层医用纱布过滤，将滤液在40倍物镜下以血球计数板计数母液的孢子浓度，再稀释成1×104、1×105、1×106、1×107、1×108孢子/mL，用0.05％的吐温-80无菌水为对照，对照及上述5个梯度浓度的孢子悬浮液各20mL，待用。
3、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对不同虫态十星瓢萤叶甲的致病力
将球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株1×108孢子/mL孢子悬浮液，喷洒至爬山虎叶片及十星瓢萤叶甲虫体上，形成水滴，每个处理3次重复。将实验植株置于26±1℃，光照(L∶DL14∶10)条件下的恒温气候箱中培养，并将湿度保持在RH 90％以上，记录10天后死亡率，比较幼虫、成虫的累计校正死亡率。
4、不同浓度球孢白僵菌Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲幼虫的致病力和累计死亡率
取球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株1×104、1×105、1×106、1×107、1×108孢子/mL的悬浮液，0.05％的吐温-80无菌水(ck)，各20mL，分别喷洒至爬山虎叶片及十星瓢萤叶甲幼虫体表，形成水滴，每个处理3次重复。将实验植株置于26±1℃，光照(L∶DL14∶10)条件下的恒温气候箱中培养，并将湿度保持在RH 90％以上，每隔两天记录死亡数，记录8天。
5、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲幼虫的致死中浓度
通过数据处理分析获得球孢白僵菌对十星瓢萤叶甲幼虫的致病力回归方程及参数。
6、球孢白僵菌Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲幼虫的时间效应
通过数据处理分析获得球孢白僵菌对十星瓢萤叶甲幼虫的LC50值。
二、实验结果
对于1×108孢子/mL的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株孢子悬浮液，十星瓢萤叶甲幼虫的累计校正死亡率为93.26％，十星瓢萤叶甲成虫的累计校正死亡率为91.67％。该球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲成虫和幼虫都具有很高的致死率，但幼虫略高于成虫，说明幼虫时期防治较佳。感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722后的十星瓢萤叶甲幼虫及成虫僵虫状态分别如图5和图6所示。
如表3所示，在1×104孢子/mL孢子悬浮液条件下，十星瓢萤叶甲幼虫的死亡率很低，在第8天时只有19.23％；在1×105孢子/mL孢子悬浮液条件下，十星瓢萤叶甲幼虫的死亡率在第8天时为42.73％；在1×106孢子/mL条件下，十星瓢萤叶甲幼虫的死亡率在第8天时为61.02％；在1×107孢子/mL条件下，十星瓢萤叶甲幼虫的死亡率在第8天时为81.96％；在1×108孢子/mL条件下，十星瓢萤叶甲幼虫的死亡率在第8天时为90.14％。在第6天时，各浓度下的死亡率明显增加，整体上随着孢子浓度的增加，球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲幼虫的致死效果越来越高(图7)。
表3不同浓度球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲幼虫的致病力
如表4所示，十星瓢萤叶甲幼虫的LC50值随着处理时间的增加而降低，处理后8d时，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株的孢子悬浮液对十星瓢萤叶甲幼虫的致死中浓度为2.88×105个/mL。
表4球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲幼虫的致病力回归方程
通过数据处理分析获得球孢白僵菌对十星瓢萤叶甲幼虫的LC50值随着处理时间的增加而降低(表5)，1×108浓度处理下球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株孢子悬浮液对十星瓢萤叶甲幼虫的致死中时间为3.81d。
表5球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对十星瓢萤叶甲幼虫的致死中时
实施例3球孢白僵菌Bals-1722菌株对甘薯小象甲的致病力测定
一、实验方法
1、材料
供试虫源：甘薯小象甲采自广东省湛江市麻章区东海岛，在室内用甘薯块饲喂，待用。
供试昆虫病原真菌：经实施例1纯化处理获得的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Bals-1722菌株。试验时重新转移菌株至新PDA平板上进行培养，收集孢子待用。用0.05％吐温-80无菌水配制2.5×105/mL、2.5×106/mL、2.5×107/mL和2.5×108/mL浓度的孢子悬浮液，0.05％吐温-80无菌水为对照，每个浓度分别配50mL，待用。
2、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对甘薯小象甲成虫的死亡率
选取羽化日龄、生命活力较一致的甘薯小象甲成虫，用浸渍法用步骤1配置的各梯度浓度的孢子悬浮液和对照无菌处理甘薯小象甲成虫，每个处理浸渍时间为30s，将处理后的甘薯小象甲成虫置于26±1℃的恒温箱中培养，饲以健康甘薯块，相对湿度90％，光照(L∶DL14∶10)。每个浓度共处理15头虫，每5头为一个处理。浸渍处理后每天记录虫子的死亡率。
3、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株甘薯小象甲成虫的致死浓度
通过数据处理分析获得球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对甘薯小象甲成虫的致病力回归方程及参数。
4、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对甘薯小象甲成虫的时间效应
通过数据处理分析获得球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对甘薯小象甲成虫的致死中时间。
二、实验结果
如表6和图8所示，处理后第6d，各浓度的孢子悬浮液都对甘薯小象甲造成死亡，随着孢子悬浮液浓度的增加，死亡率越高，在第9d时，2.5×107孢子/mL浓度下，甘薯小象甲死亡率达到63.69％，2.5×108孢子/mL浓度下，甘薯小象甲死亡率达到82.92％。如图9所示，为感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株的甘薯小象甲成虫，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对甘薯小象甲成虫有较强的致死性。
表6球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对甘薯小象甲成虫的毒力测定情况
如表7所示，甘薯小象甲成虫的LC50值随着处理时间的增加而降低。
表7球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对甘薯小象甲成虫的致病力回归方程
如表8所示，甘薯小象甲的LT50值随着孢子悬浮液浓度的增加而降低。
表8球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株不同浓度孢子悬浮液对甘薯小象甲的致死中时
实施例4球孢白僵菌Bals-1722菌株对黄野螟的致病力测定
一、实验方法
1、材料
供试虫源：黄野螟(Heortia vitessoides)幼虫采集自广东海洋大学中歌艺术学院小剧场后土沉香林，用新鲜嫩绿的土沉香叶片来饲养至所需要的虫龄，待用。
供试昆虫病原真菌：经实施例1纯化处理获得的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Bals-1722菌株。试验时重新转移菌株至PDA平板上进行培养，收集孢子待用。用0.05％吐温-80无菌水配制2.5×105/mL、2.5×106/mL、2.5×107/mL和2.5×108/mL浓度的孢子悬浮液，0.05％吐温-80无菌水为对照，每个浓度分别配50mL，待用。
2、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对黄野螟3龄幼虫的死亡率
用次氯酸钠100倍溶液浸泡饲养黄野螟的塑料饲养皿1h，待水分晾干后备用。分别选取个体大小一致、健康活泼的黄野螟3龄幼虫分别放入上述饲养皿(直径90mm)中，每个饲养皿中放入土沉香叶片和黄野螟2只，共计75个饲养皿，在所有饲养皿中均放入湿润的纸巾团，置于温度26±1℃，湿度75％，光照(L∶DL14∶10)的人工气候箱中饲养，每24h更换1次土沉香叶片并清理排泄物。
用浸液法测定球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对黄野螟的致病力：每个球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722孢子悬浮液浓度为1个处理，共计4个处理组，每个处理重复3次，配置的孢子悬浮液浓度见步骤1，对照组为0.05％吐温-80无菌水溶液，每个处理组处理10头黄野螟幼虫，用毛笔挑起试虫(供试黄野螟幼虫)浸入到孢子悬浮液中10s，对照组将试虫浸入到0.05％吐温-80无菌水溶液10s。浸液完成后，用滤纸吸干试虫体表上多余的孢子悬浮液或0.05％吐温-80无菌水溶液，放置回上述饲养皿，相同条件下保湿处理。
3、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对黄野螟的致死浓度
通过数据处理分析获得球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对黄野螟3龄幼虫的致病力回归方程及参数。
4、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对黄野螟3龄幼虫的时间效应
通过数据处理分析获得球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对黄野螟3龄幼虫的致死中时间。
二、实验结果
接菌1d后，观察黄野螟3龄幼虫的活动，发现处理组和对照组的进食量出现差异，并且处理组的黄野螟3龄幼虫开始出现动作迟钝的现象。第二天开始有死亡个体。如图10所示，经过2.5×108孢子/mL浓度的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的孢子悬浮液保湿处理3d后，黄野螟3龄幼虫虫体开始出现白色菌丝，7d后菌丝蔓延至全身；14d后菌丝完全包裹住整个虫体。
如表9、图11所示，处理后第5d，各浓度的孢子悬浮液都对黄野螟造成死亡，随着孢子悬浮液浓度的增加，死亡率越高，在第9d时，2.5×107孢子/mL浓度下，黄野螟死亡率达到71.19％，2.5×108孢子/mL浓度下，黄野螟死亡率达到83.54％。
表9球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株对黄野螟3龄幼虫的毒力测定
如表10所示，黄野螟3龄幼虫的LC50值随着处理时间的增加而降低。
表10球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株孢子悬浮液对黄野螟3龄幼虫的致死中浓度
如表11所示，黄野螟3龄幼虫的致死中时值随着孢子悬浮液浓度的增加而降低。
表11球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722菌株孢子悬浮液对黄野螟3龄幼虫的致死中时
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722，其特征在于，所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722已于2022年6月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62530。
2.权利要求1中所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722在防治十星瓢萤叶甲(Oides decempunctata Billberg)、甘薯小象甲(Cylas formicarius)和黄野螟(Heortia vitessoides Moore)中的应用。
3.一种生防制剂，其特征在于，所述生防制剂中包含权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722。
4.权利要求3所述的生防制剂在防治十星瓢萤叶甲(Oides decempunctataBillberg)、甘薯小象甲(Cylas formicarius)和黄野螟(Heortia vitessoides Moore)中的应用。
5.一种防治十星瓢萤叶甲(Oides decempunctata Billberg)、甘薯小象甲(Cylasformicarius)和黄野螟(Heortia vitessoides Moore)的方法，其特征在于，用权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722进行防治。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，防治十星瓢萤叶甲，权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的浓度为1×106～1×108孢子/mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，防治甘薯小象甲，权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的浓度为2.5×107～2.5×108孢子/mL。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，防治黄野螟，权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bals-1722的浓度为2.5×107～2.5×108孢子/mL。
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