CN116064291B - 一种霍氏肠杆菌en-314t及其在茶谷蛾幼虫期的生物防治方法与应用 - Google Patents

一种霍氏肠杆菌en-314t及其在茶谷蛾幼虫期的生物防治方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种霍氏肠杆菌EN‑314T及其在茶谷蛾幼虫期的生物防治方法与应用，本发明的一株霍氏肠杆菌EN‑314T，保藏名称为EN‑314T(Enterobacter hormaechei)；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉.武汉大学；保藏日期：2022年8月4日；其微生物保藏编号：CCTCC No.M 20221244。本发明是初次从茶树上分离得到的菌剂，培养比较简单，生长快速，菌液浓度大。该菌剂对茶谷蛾蛹幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于茶谷蛾幼虫的防治。

Description

一种霍氏肠杆菌EN-314T及其在茶谷蛾幼虫期的生物防治方 法与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种霍氏肠杆菌EN-314T及其在茶谷蛾幼虫期的生物防治方法与应用。
背景技术
茶谷蛾(Agriophara rhombata)，又名茶灰木蛾、茶木蛾，属鳞翅目谷蛾科，是茶树重要的食叶害虫之一。在我国台湾、海南、广东、福建曾有茶谷蛾发生的记录，在印度等地一度为茶树主要害虫。成虫体长约10毫米，翅展27～33毫米，胸部有一圆点。前翅淡黄白色，翅中部有1条黑褐色纹，外有一列小黑点，后翅白色。卵椭圆形，黄绿色。成熟幼虫体长23～27毫米，体淡黄色，头黑色，各体节有2条黑色纵带，两侧均有2个黑色毛疣。蛹为淡褐色，背面隆起呈龟壳状。幼虫蚕食成叶和老叶，部分初孵幼虫亦可蛀害嫩梢茶谷蛾幼虫吐丝缀叶成苞，隐藏于苞内咀食成龄叶片叶肉，暴食期能将成龄叶、嫩枝树皮一并吃光，受害严重茶园呈现一片枯竭，对产量和树势造成巨大影响。近几年茶谷蛾在云南部分茶区发生极其严重。茶谷蛾幼虫隐蔽性强，隐匿在叶苞内取食，受惊吓或干扰后，立即落入地面或其他隐蔽场所。福建每年发生3代，海南岛4代。1～4代幼虫分别于1月中旬、5月中旬、7月中旬及9月下旬盛孵。成虫日间栖于丛间，夜晚活动、交尾，无趋光性，不善飞翔，每雌产卵200余粒，散布叶背。幼虫在叠叶中咬食叶片，幼虫最多达8龄，6～7龄时暴食，为害大。幼虫食性单一，只害茶，耐饥力强，迁移性小老熟后在虫苞内、叶片上或土表枯枝上化蛹。喜在阴凉湿润的条件下发生，在海南岛全年以秋凉季节第3代虫口最多，为害重，12月底达高峰。其天敌有小茧蜂、大腿蜂和寄生蝇。目前的防治方法，除人工采虫外，主要如下：1.发生初期人工剪除虫苞。秋、冬季结合清园(修剪)可去除虫苞，减少翌年虫口数量。2.在发生初期(幼龄期)用80％的敌敌畏、40.7％的毒死蜱800倍稀释液，或用90％的巴丹1000倍稀释液、35％赛丹1500倍稀释液等进行防治。随着茶谷蛾的发生危害日趋严重，目前主要采取以农药防治为主的防治措施。化学农药虽然具有见效快，但化学农药的施用不仅会造成农药残留及严重的环境污染，而且易杀死茶谷蛾的自然天敌，再加上茶谷蛾已对多种化学农药产生了较强的抗药性，因此化学农药不符合害虫治理的可持续性及生态控制的要求。生物防治人畜安全、无环境污染、害虫不会产生抗药性、持续控制的优点，因而生物防治是茶谷蛾的重要途径。肠杆菌等真菌对害虫的侵染致病作用强，使用后容易引起害虫的流行病、无环境染污、对人畜等动物安全，而且不会使害虫产生抗药性，虫生真菌已成为害虫生物防治的重要内容。因此，研究茶谷蛾的生防真菌，为茶谷蛾的持续控制提供依据，也将为茶叶生产提供保障。
霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)属于肠杆菌属，广泛分布在自然界中，在动植物中均有发现。霍氏肠杆菌是条件致病菌，广泛存在于人与动物的肠道中。在对植物的应用中发现其对番茄生长具有促进作用，通过处理能够增加番茄种子的生物量，并且促进芽的生长。在另一株霍氏肠杆菌的研究中发现可以提高番茄产量，提高抗病性以及耐盐性。研究表明，肠杆菌ludwigii的感染会影响黑腹果蝇的发育，并且造成果蝇神经退行性疾病。肠杆菌sp.532通过分泌十二烷基硫酸钠形成蛋白与毒素的复合物，对家蚕具有致病性。但目前霍氏肠杆菌在生物防治方面的应用十分有限。
目前还未检索到茶谷蛾生物防治的报道，也没有检索到霍氏肠杆菌对茶谷蛾致病性报道，因而还缺乏能用于生物防治茶谷蛾的肠杆菌。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种霍氏肠杆菌EN-314T及其应用，旨在克服现有技术中缺乏对茶谷蛾生物防治的不足，通过生物技术手段防治茶谷蛾幼虫，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题。
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：
一种霍氏肠杆菌EN-314T，该菌保藏名称为EN-314T(Enterobacter hormaechei)；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉.武汉大学；保藏日期：2022年8月4日；其微生物保藏编号：CCTCC No.M 20221244。
进一步地，所述的霍氏肠杆菌EN-314T的16S rDNA的基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述的霍氏肠杆菌EN-314T为直杆状，革兰氏阴性细菌，周生鞭毛，兼性厌氧，菌落呈圆形，边缘整齐,半透明状,表面光滑，呈淡黄色。
本发明还保护霍氏肠杆菌EN-314T菌液的培养方法，包括以下步骤：
S1分离纯化用2％次氯酸钠对大叶种茶树叶片进行表面消毒，将叶片剪碎后放入TSB液体培养基中，摇菌10-12个小时后得到扩增内生菌培养液；吸取1μL扩增内生菌培养液涂布于TSB固体培养基平板上进行培养；28℃培养1天后在TSB培养基上形成单个菌落；然后使用接种环挑取单个菌落进行划线分离，对分离后的菌落培养1天后得到在划线平板上培养的菌落；挑取划线平板上的单个菌落获得分离纯化的霍氏肠杆菌EN-314T菌株，再把分离纯化后的菌株转移到TSB斜面上生长2天，在4℃冰箱保存；
S2菌株鉴定采用分子鉴定的方法，将步骤S1中得到的分离纯化菌株提取DNA，通过16S引物27F 5'AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG 3'和1492R 5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'进行扩增测序，获得菌株16S序列，将扩增序列导入NCBI网页中进行序列比对分析鉴定菌种；
S3菌株复壮将冰箱内存放的霍氏肠杆菌EN-314T菌株取出，挑取菌落至TSB液体培养基，28℃摇菌10-12小时获得状态良好的霍氏肠杆菌EN-314T菌株；
S4菌液培养和菌剂配制将复壮后的菌株在TSB液体培养基中培养，培养温度为28℃，200转/分钟条件下摇菌培养2天，即得到菌液，所述的TSB液体培养基的成份为30gTSB培养基干粉+30g琼脂粉+1000ml水。
本发明还提供霍氏肠杆菌EN-314T菌剂在制备防治茶谷蛾制剂中的应用。
进一步地，所述的菌剂是根据权利要求4得到的菌液的浓度添加适量的红糖、水配制得到肠杆菌菌剂。
本发明还保护一种茶谷蛾幼虫期的生物防治方法，将所述的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂喷洒到茶树叶片上进行防治。
优选地，所述的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂的浓度1×105CFU/mL-1×108CFU/mL。
优选地，所述霍氏肠杆菌EN-314T菌剂的施用量为40L/亩。
优选地，所述霍氏肠杆菌EN-314T连续喷施处理3天。
相对于现有技术，本发明的有益效果：本发明是初次从茶树上分离得到的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂，培养比较简单，生长快速，菌液浓度大。其菌液对茶谷蛾幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于茶谷蛾幼虫的防治。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：霍氏肠杆菌EN-314T菌剂是发明人首次从茶树上分离纯化获得的肠杆菌EN-314T，CCTCC No.M 20221244，该菌剂在温度为28℃，TSB培养基生长快速，细菌。其菌液在相对湿度80％以上的茶园内对茶谷蛾幼虫的致病力较好，可以广泛地用于茶谷蛾幼虫的防治。同时，该菌剂培养原料来源广泛，价格便宜，培养方法简单，易大量进行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌剂防治茶谷蛾幼虫，即为典型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药及环境污染等问题，将为茶谷蛾幼虫的绿色防控提供依据。
附图说明
图1为本发明的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂形态图，其中图1(A)为TSB平板培养的菌落图，图1(B)为培养的菌液图；
图2为本发明的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂的感染茶谷蛾幼虫的形态图；其中图2(A)为喷施3天后(第5天统计)的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂的感染茶谷蛾幼虫的形态图；图2(B)为喷施3天后(第5天统计)的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂的感染茶谷蛾幼虫的形态图(放大4倍)；图2(C)为茶谷蛾幼虫的形态图(放大4倍)；
图3为霍氏肠杆菌EN-314T菌培养生长曲线图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1菌株分离纯化、鉴定、保存及菌液
1.1材料准备
选择云南省普洱市采集的健康大叶种茶树叶片，无菌操作条件：所有器皿和用具放入高压灭菌锅121℃下，灭菌25分钟，菌种分离等操作在超净工作台内进行。
1.2菌液的培养
S1分离纯化用2％次氯酸钠对大叶种茶树叶片进行表面消毒，将叶片剪碎后放入TSB液体培养基中，摇菌10-12个小时后得到扩增内生菌培养液；吸取1μL扩增内生菌培养液涂布于TSB固体培养基平板上进行培养；28℃培养1天后在TSB培养基上形成单个菌落；然后使用接种环挑取单个菌落进行划线分离，对分离后的菌落培养1天后得到在划线平板上培养的菌落；挑取划线平板上的单个菌落获得分离纯化的霍氏肠杆菌EN-314T菌株，再把分离纯化后的菌株转移到TSB斜面上生长2天，在4℃冰箱保存；在TSB培养基上，培养2天后菌落呈圆形,边缘整齐,半透明状,表面光滑，呈淡黄色。所述的霍氏肠杆菌EN-314T为直杆状，革兰氏阴性细菌，周生鞭毛，兼性厌氧。
S2菌株鉴定采用分子鉴定的方法，将步骤S1中得到的分离纯化菌株提取DNA，通过16S引物27F 5'AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG 3'和1492R 5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'进行扩增测序，所述的引物序列如SEQ ID No.2-3所示；获得菌株16S序列，将扩增序列导入NCBI网页中进行序列比对分析鉴定菌种；鉴定结果是菌株与霍氏肠杆菌EN-314T菌种具有100％相似度，故鉴定为霍氏肠杆菌EN-314T；
S3菌株复壮将冰箱内存放的霍氏肠杆菌EN-314T菌株取出，挑取菌落至TSB液体培养基，28℃摇菌10-12小时获得状态良好的霍氏肠杆菌EN-314T菌株；
S4菌液培养和菌剂配制将复壮后的菌株在TSB液体培养基中培养，培养温度为28℃，培养2天，即得到菌液，所述的TSB液体培养基的成份为30gTSB培养基干粉+30g琼脂粉+1000ml水。
实施例2霍氏肠杆菌EN-314T菌落生长及形态
2.1菌落生长速率和菌液浓度的测定
将正常生长的霍氏肠杆菌EN-314T接入TSB液体培养基中，28℃，200转/分钟条件下摇菌培养，使用酶标仪每隔一小时检测培养基在600nm波长下的OD值，通过测量后的数值建立生长曲线，见图3。
2.2结果
本发明从茶树叶片中分离的霍氏肠杆菌EN-314T容易培养，在接入培养基5小时后进入指数生长期，经过12小时培养可达到峰值，对该菌进行过夜培养即可获得大量菌液，最大浓度可达到3×109CFU/ml。
实施例3霍氏肠杆菌EN-314T菌剂对茶谷蛾幼虫的致病性测定
3.1、材料与方法
供试虫源
茶谷蛾采集于普洱市思茅区茶园内，并且采集带有健康叶片的茶树枝条用作饲养。在温度25±2℃，湿度65±5％，光周期12L：12D条件下的人工气候箱内培养茶谷蛾，饲养1代后，收集健康的继代培养茶谷蛾3至5龄幼虫作为供试虫源。
3.2菌剂的准备及处理茶谷蛾
取实施例1中获取的菌种在TSB液体培养基中，28℃培养条件下进行扩增培养，获得菌液；测定菌液的浓度，利用无菌水制备1×108、1×107、1×106、1×105CFU/ml四个浓度梯度的供试菌液，并在菌液中加入红糖50g/L。以无菌水加50g/L红糖制备溶液为空白对照，用于毒力测定。
3.3接种处理
将实例3.2中制备的4组菌液喷施在茶谷蛾低龄幼虫上，继续饲养，每天统计死亡数量。结果见表1。
结果表明：用霍氏肠杆菌EN-314T的1×108、1×107、1×106、1×105CFU/ml四个浓度菌液连续喷施3天处理茶谷蛾幼虫。第5天统计茶谷蛾幼虫死亡率分别为13％、14％、40％和70％，对照死亡率为2％，一些不致死幼虫的吐丝能力收到影响，进而影响幼虫虫包的形成。这些表明4组浓度菌液接种浓度皆可以对茶谷蛾幼虫产生致病性，且最高浓度在1×108下致病力最强，达到70％。
霍氏肠杆菌EN-314对茶谷蛾幼虫感染症状如图2所示，图2C为健康幼虫，由霍氏肠杆菌EN-314T处理后幼虫活动能力变弱，致死后虫体变黑(见图2(A)和图2(B))。
表1不同浓度肠杆菌菌剂茶谷蛾低龄幼虫的死亡率
实施例4霍氏肠杆菌EN-314T菌剂对茶谷蛾幼虫的防治应用
4.1、材料与方法
4.1供试虫源
通过调查选定茶谷蛾低龄幼虫期进行菌剂防治实验。
4.2防治方法
在室内用上述方法制备1×108CFU/mL的菌剂，对茶树上茶谷蛾幼虫进行喷雾处理，以无菌水为空白对照，每亩喷施40L，连续喷施处理3天，每天定时观察记录茶谷蛾幼虫死亡数量。将死亡后的幼虫带回实验室，分离死亡幼虫上的菌，判断为供试霍氏肠杆菌感染的幼虫。
结果表明：通过本发明的方法制备1×108的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂，喷雾处理茶谷蛾低龄幼虫，茶谷蛾低龄幼虫死亡率为25％。由此表明霍氏肠杆菌EN-314T对茶谷蛾幼虫具有一定的防治作用。

Claims (6)

1.一种霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）EN-314T，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉武汉大学；保藏日期：2022年8月4日；其微生物保藏编号：CCTCC No：M 20221244。
2.霍氏肠杆菌EN-314T菌剂在制备防治幼虫期茶谷蛾制剂中的应用，其特征在于：所述的霍氏肠杆菌EN-314T为权利要求1所述的霍氏肠杆菌。
3.一种茶谷蛾幼虫期的生物防治方法，其特征在于：将权利要求2所述的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂喷洒到茶树叶片上进行防治。
4.根据权利要求3所述的生物防治方法，其特征在于：所述的霍氏肠杆菌EN-314T菌剂的浓度1×105CFU/mL-1×108CFU/mL。
5.根据权利要求3所述的生物防治方法，其特征在于，所述霍氏肠杆菌EN-314T菌剂的施用量为40L/亩。
6.根据权利要求3所述的生物防治方法，其特征在于，所述霍氏肠杆菌EN-314T连续喷施处理3天。
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