CN114317289A - 一种草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007及其应用，本发明的一株草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株，该菌株为球孢白僵菌Beauveria baasiana，保藏名称为球孢白僵菌Beauveria baasiana；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCC No.23817。本发明是初次从草地贪夜蛾成虫体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大。其对草地贪夜蛾蛹致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于草地贪夜蛾蛹的防治。

Description

一种草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株及其应用。

背景技术

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E.Smith,1797)，又名行军虫、秋黏虫，隶属于鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾属Spodoptera，该虫原产于美洲热带和亚热带地区，因其食性广、食量大、繁殖和迁飞能力强，已发展成为全球性害虫，2019年1月11日在云南普洱市江城县首次发现草地贪夜蛾幼虫危害冬玉米，随后在全国26个省份均监测到其危害。草地贪夜蛾主要以玉米、甘蔗、小麦等禾本科作物为食，对玉米的为害尤其严重，现已成为影响玉米生产的重要害虫。该虫是危害玉米的重要害虫，主要以幼虫取食玉米叶片、幼虫蛀入玉米心叶，导致玉米整株枯死，严重影响玉米生产。草地贪夜蛾的发生危害日趋严重，目前主要采取以农药防治为主的防治措施。化学农药虽然具有见效快，但化学农药的施用不仅会造成农药残留及严重的环境污染，而且易杀死草地贪夜蛾的自然天敌，再加上草地贪夜蛾已对多种化学农药产生了较强的抗药性，因此化学农药不符合害虫治理的可持续性及生态控制的要求。生物防治人畜安全、无环境污染、害虫不会产生抗药性、持续控制的优点，因而生物防治是草地贪夜蛾的重要途径。球孢白僵菌等虫生真菌对害虫的侵染致病作用强、使用后容易引起害虫的流行病、无环境染污、对人畜等动物安全，而且不会使害虫产生抗药性，虫生真菌已成为害虫生物防治的重要内容。因此，研究草地贪夜蛾的生防真菌，为草地贪夜蛾的持续控制提供依据，也将为玉米生产提供保障。

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)属于接合菌亚门丝孢纲丝孢目白僵菌属真菌，是一种经典的虫生真菌。球孢白僵菌在世界范围被用于害虫生物防治，其中我国使用球孢白僵菌防治玉米螟和马尾松毛虫是国际上利用虫生真菌防治害虫的典型，取得了良好的害虫持续控制效果。球孢白僵菌能寄生鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、双翅目、半翅目、直翅目、等翅目、缨翅目、脉翅目、革翅目、蚤目、螳螂目、蜚蠊目和纺足目等15目149科521属707种害虫，已被开发为防治鳞翅目害虫幼虫及鞘翅目、同翅目等害虫成虫和幼虫的生物农药，应用于作物、蔬菜和林业害虫的防治实践。由于球孢白僵菌能有效控制害虫虫口数量，同时其他天敌昆虫和有益生物无伤害作用，符合有害生物综合治理的宗旨，同时由于其容易大量生产，防治成本较有竞争力，因而其具有广泛的应用前景。

草地贪夜蛾自2019年入侵进入我国以来，许多学者也都开展了球孢白僵菌对草地贪夜蛾幼虫的毒力测定研究，然而对于自然感染草地贪夜蛾蛹的球孢白僵菌还未见报道，因而还缺乏能用于生物防治草地贪夜蛾蛹的球孢白僵菌。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种球孢白僵菌Bbsfa202007及其应用，旨在克服现有球孢白僵菌未发现能寄生草地贪夜蛾蛹的不足，通过生物技术手段防治草地贪夜蛾蛹，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题。

为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一株草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株，该菌株为球孢白僵菌Beauveria baasiana，保藏名称为球孢白僵菌Beauveria baasiana；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCCNo.23817。

进一步地，所述的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株的16S rDNA的基因序列为SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株为白色绒毛状，菌落边缘整齐，呈放射状生长；接种后第6d，菌落开始产孢，略变为淡沙黄色，菌落中间略凸起，孢子层长势均匀，菌落背面淡黄色；在SDAY培养基上培养至7d时，菌落直径22.57mm(图1e-h)。在光学显微镜下营养菌丝无色，分生孢子梗着生于营养菌丝，光滑呈穗状，分生孢子透明、光滑，球形或近球形，直径2.3～2.9μm。

本发明所述的草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株制备的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株菌剂。

进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：

(a)所述的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株的发酵液初提物；

(b)所得球孢白僵菌Bbsfa202007菌株细胞的超声裂解上清；

(c)所得球孢白僵菌Bbsfa202007菌株细胞的超声裂解沉淀。

本发明所述的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株在草地贪夜蛾防治制剂中的应用。

有益效果：本发明是初次从草地贪夜蛾成虫体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大。其分生孢子对草地贪夜蛾蛹致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于草地贪夜蛾蛹的防治。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：球孢白僵菌Bbsfa202007菌株是我们首次从草地贪夜蛾成虫上分离纯化获得的球孢白僵菌Bbsfa202007，CGMCC No.23817，该菌株在温度为25℃、相对湿度80％以上在SDAY培养基上生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对草地贪夜蛾蛹的致病力较好，可以广泛地用于草地贪夜蛾蛹的防治。同时，该菌株培养原料来源广泛，价格便宜，培养方法简单，易大量进行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治草地贪夜蛾蛹，即为典型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药及环境污染等问题，将为草地贪夜蛾蛹的绿色防控提供依据。

附图说明

图1为本发明的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株的分生孢子形态图。

图2为本发明的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株的感染草地贪夜蛾蛹的图。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

病原菌的分离、鉴定

1.1材料与方法

1.1.1材料

在云南省大理采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病草地贪夜蛾成虫。

萨氏培养基(SDAY)：1％蛋白胨+1％酵母粉+4％葡萄糖+1.5-2％琼脂粉+1000mL水。

无菌操作条件：所有的器皿和用具均经高温灭菌锅(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。

培养条件：置于28℃光照(12L：12D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到试管SDAY斜面，培养2-3天，转入4℃冰箱储存。

1.1.2病原菌的分离和纯化

分离：从罹病草地贪夜蛾成虫尸体上分离病原菌。将草地贪夜蛾成虫罹病虫体带回实验室，将罹病草地贪夜蛾成虫尸按顺序依次经过70％酒精浸泡30秒、再经过0.1％升汞溶液浸泡3分钟(彻底消毒)、最后用无菌水冲洗三次，再用接种针取处理好的蔗草地贪夜蛾成虫组织接种于SDAY培养基上。在28℃条件下培养，按单孢分离、培养得到纯的、产孢能力强的菌株球孢白僵菌Beauveria bassiana，转移到SDAY斜面上生长3-4天，在4℃冰箱储存。

复壮：将分离到的菌株在SDAY上培养5天，等产生大量分生孢子后，再收集该分生孢子挑入含1％吐温-80的无菌水中，用磁力搅拌器搅拌均匀，获得孢子悬浮液，用喷雾塔均匀喷于草地贪夜蛾成虫体表，然而在80％以上湿度条件下培养。对死亡虫体进行收集并保湿培养，得到的成虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。

纯化：挑取培养基上分生孢子粉，再次接种在新配制培养基上。如此培养2～3代，纯化得到菌株。

1.1.3病原菌的鉴定

根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用40×10倍显光学微镜，镜检菌丝、分生孢子和产孢结构的形态。

1.2结果

在SDAY培养基上，培养后第3d时菌落平展，白色绒毛状，菌落边缘整齐，呈放射状生长；接种后第6d，菌落开始产孢，略变为淡沙黄色，菌落中间略凸起，孢子层长势均匀，菌落背面淡黄色；在SDAY培养基上培养至7d时，菌落直径22.57mm(图1e-h)。在光学显微镜下营养菌丝无色，分生孢子梗着生于营养菌丝，光滑呈穗状，分生孢子透明、光滑，球形或近球形，直径2.3～2.9μm(图1i-k)。草地贪夜蛾成虫感染症状及球孢白僵菌菌落和分生孢子的形态特征如图1所示。

从被虫生真菌自然侵染的草地贪夜蛾成虫体上分离获得一球孢白佃菌野生菌株，在萨氏琼脂培养基(SDAY)上培养，并回接于草地贪夜蛾蛹复壮获得一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株，即球孢白僵菌Beauveria bassiana Bbsfa202007。

根据田间感染症状、采集罹病虫体室内分离观察，并根据《昆虫真菌学》(蒲蜇龙，李增智，1996)有关球孢白僵菌感染症状、分生孢子及菌丝的形态特征进行鉴定，确定为球孢白僵菌。

实施例2

球孢白僵菌纯化菌株生物学特性

2.1材料与方法

2.1.1供试菌株

选择纯化后生长旺盛、生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到SDAY上，于25℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养。

2.1.2菌落生长速率和产孢量的测定

将分离纯化的球孢白僵菌菌株Bbsfa202007分别接种于SDAY和PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L)上，于(25±1)℃、相对湿度70％、L：D＝14h：10h光照培养箱(恒立(中国)实验室设备科技有限公司，型号RG-300)中培养。在接菌第3、7和14d时，分别测量菌落直径以及观察菌落形态特征。并采用光学显微镜(Leica,750)观察菌株产孢结构和分生孢子形态等显微结构。

2.2结果

本发明从罹病草地贪夜蛾成虫上分离获得球孢白僵菌野生菌株，将野生菌株回接于草地贪夜蛾成虫上复壮得到球孢白僵菌菌株，对该菌株采用按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的球孢白僵菌。表1结果显示，于25℃在SDAY和PDA培养基上，菌落日增长量分别为3.86和4.94mm，培养至第15d时菌落生长量分别为57.90和74.17mm，在SDAY和PDA培养基上培养第15d时产孢量分别为1.60×10⁸个/cm²和2.50×10⁸个/cm²。25℃下球孢白僵菌培养特征如表1所示：

表1

实施例3

球孢白僵菌Bbsfa202007对草地贪夜蛾蛹的室内毒力测定

3.1、材料与方法

3.1.1供试虫源

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E.Smith,1797)蛹，由本实验室，温度(25±1)℃，湿度(80±5)％，光周期12L﹕12D光照培养箱中，用甘蔗饲养。获得健康、大小一致的二日龄蛹作为试虫。

3.1.2孢子悬浮液的制备

取长势良好的纯化球孢白僵菌用无菌水将分生孢子洗下并过滤配成10⁸孢子/mL分生孢子菌悬液，用无菌毛细滴管取分生孢子菌悬液滴于血细胞计数板上，在显微镜下数孢子并记录数据，用含0.5％吐温80的无菌水依次稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵和10⁴五个浓度梯度的孢子悬浮液，以含0.5％吐温80的无菌水为空白对照，用于毒力测定。

3.1.3接种处理

配制1.0×10⁸的孢子悬浮液，采用浸渍法接种草地贪夜蛾2日龄蛹，放入(25±1)℃，RH(75±5％)，光周期L//D＝12h//12h的恒温培养箱中饲养，每隔24h观察供试草地贪夜蛾蛹体染菌情况，统计死亡数量。将死亡的虫体，在灭菌培养皿中于(25±1)℃光照培养箱中保湿培养，每天定时观察死亡虫体上菌体的生长和产孢情况，从而确定死亡虫为白僵菌感染致死。

3.2结果

球孢白僵菌Bbsfa202007对草地贪夜蛾蛹具有较强的致病力，用1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷和1.0×10⁸孢子/mL浓度分生孢子悬浮液接种处理后第10天时，蛹的死亡率分别为3.33、33.33、53.33、60.00、83.33和93.33，而对照组蛹的死亡率仅为3.33％。由此表明，球孢白僵菌Bbsfa202007对草地贪夜蛾蛹具有较强的致病力。

由图2可以看出，生长后期在蛹体上产生大量孢子，蛹的头部基本全部被孢子覆盖，腹部末节没有菌丝生长或生长少量菌丝，身体周围长满菌丝和孢子是因为初期菌丝从气门处生长，并向周围扩散生长，头部长满菌丝和孢子因为头部有蜕裂线和背侧线等，菌丝很容易从这些地方长出。球孢白僵菌对草地贪夜蛾二日龄蛹的感染症状如图2所示。

实施例4

球孢白僵菌Bbsfa202007对草地贪夜蛾蛹的防治应用

4.1、材料与方法

4.1.1供试虫源

在温室内，温度(25±1)℃，湿度(80±5)％，光周期12L﹕12D条件下用玉米饲养草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)，获得健康、大小一致的同日龄蛹作为试虫。

4.1.2防治方法

在室内用PDA培养基，于温度(25±1)℃，湿度(80±5)％，光周期12L﹕12D条件下培养球孢白僵菌Bbsfa202007，配制球孢白僵菌Bbsfa202007的10⁸孢子/mL，然后依次稀释为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴五个浓度梯度的孢子悬浮液，对玉米上草地贪夜蛾蛹进行喷雾处理，以含0.5％吐温80的无菌水为空白对照，每天定时观察和记数蛹的死亡数量，将死亡后的蛹拿回实验室，置于底部放有灭绝滤纸的培养皿(直径＝9cm)中，单头放置，进行培养，观察死亡蛹体上是否长出菌体，若死亡蛹体上长出菌体者，判断为被供试球孢白僵菌感染的蛹。

4.3结果

用球孢白僵菌Bbsfa202007的1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷和1.0×10⁸孢子/mL浓度分生孢子悬浮液喷雾处理草地贪夜蛾蛹后，草地贪夜蛾蛹的死亡率分别为26.67、50.00、70.00、83.33和86.67，而对照组蛹的死亡率仅为3.33％。由此表明，球孢白僵菌Bbsfa202007对草地贪夜蛾蛹具有良好的防治作用。

球孢白僵菌Bbsfa202007菌株是我们首次从草地贪夜蛾成虫上分离纯化获得的球孢白僵菌Bbsfa202007，CGMCC No.23817，该菌株在温度为25℃、相对湿度80％以上在SDAY培养基上生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对草地贪夜蛾蛹的致病力较好，可以广泛地用于草地贪夜蛾蛹的防治。同时，该菌株培养原料来源广泛，价格便宜，培养方法简单，易大量进行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治草地贪夜蛾蛹，即为典型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药及环境污染等问题，将为草地贪夜蛾蛹的绿色防控提供依据。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株及其应用

<130> 2021

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 542

<212> DNA

<213> 人工序列(球孢白僵菌Bbsfa202007菌株的16S rDNA的基因序列)

<400> 1

gggattccga gcttcactcc tacccttctg tgacctacct atcgttgctt cggcggactc 60

gccccagccc ggacgcggac tggaccagcg gcccgccggg gacctcaaac tcttgtattc 120

cagcatcttc tgaatacgcc gcaaggcaaa acaaatgaat caaaactttc aacaacggat 180

ctcttggctc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag 240

aatccagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagcatt ctggcgggca 300

tgcctgttcg agcgtcattt caaccctcga cctcccctgg gggaggtcgg cgttggggac 360

cggcagcaca ccgccggccc tgaaatggag tggcggcccg tccgcggcga cctctgcgta 420

gtaatacagc tcgcaccgga accccgacgc ggccacgccg taaaacaccc aacttctgaa 480

cgttgacctc gaatcaggta ggactacccg ctgaacttaa gcatatcaaa agcccggagg 540

aa 542

Claims (6)

1.一株草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株，其特征在于：该菌株为球孢白僵菌Beauveria baasiana，保藏名称为球孢白僵菌Beauveriabaasiana；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCC No.23817。

2.根据权利要求1所述的草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株，其特征在于：所述的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株的16S rDNA的基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株，其特征在于：所述的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株为白色绒毛状，菌落边缘整齐，呈放射状生长；接种后第6d，菌落开始产孢，略变为淡沙黄色，菌落中间略凸起，孢子层长势均匀，菌落背面淡黄色；在光学显微镜下营养菌丝无色，分生孢子梗着生于营养菌丝，光滑呈穗状，分生孢子透明、光滑，球形或近球形，直径2.3～2.9μm。

4.权利要求1所述的草地贪夜蛾球孢白僵菌Bbsfa202007菌株制备的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株菌剂。

5.根据权利要求3所述的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：

(a)权利要求1所述的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株的发酵液初提物；

(b)权利要求1所得球孢白僵菌Bbsfa202007菌株细胞的超声裂解上清；

(c)权利要求1所得球孢白僵菌Bbsfa202007菌株细胞的超声裂解沉淀。

6.权利要求1所述的球孢白僵菌Bbsfa202007菌株在草地贪夜蛾防治制剂中的应用。

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