CN105039180B - 一种粉质棒束孢ifyj141025及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种粉质棒束孢IFYJ141025及其应用,该粉质棒束孢IFYJ141025于2014年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.10138。本发明是初次从蔗根锯天牛[Dorysthenes granulosus(Thomson)]幼虫体上分离得到的菌株,培养比较简单,生长快速,产孢量大,孢子萌发率高,其孢子悬浮液对甘蔗锯天牛幼虫致病力强,环保无污染、不易产生抗药性,可以广泛地用于蔗根锯天牛的防治。

Description

一种粉质棒束孢IFYJ141025及其应用
技术领域:
本发明属于微生物技术领域,尤其涉及一种粉质棒束孢(Isaria farinose)IFYJ141025及其应用。
背景技术:
蔗根锯天牛[Dorysthenes granulosus(Thomson)]隶属鞘翅目天牛科,为一种多食性钻蛀害虫,主要分布在广东、海南、云南、广西等甘蔗种植区,该虫以幼虫蛀食蔗篼,严重影响甘蔗生产,是危害甘蔗的重要害虫。由于该虫以幼虫在蔗根取食危害和存活,目前,对该虫的防治较难。化学杀虫剂虽然具有见效快、成本低的优点,但用药防治次数过多,不仅会引起甘蔗农药残留,而且还会造成严重的环境污染,同时还可杀死锯天牛的天敌,并使目标害虫产生抗药性。这些负面影响使人们在防治中更加关注起生物防治。生物防治对人、畜、植物安全,害虫极少或不产生抗性,有利于环境保护。因此,研究蔗根锯天牛的生物防治,避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题,已成为蔗根锯天牛科学治理和可持续控制的重要课题。
粉质棒束孢(Isaria farinose)属于半知菌亚门丝孢纲棒束孢属。据记载,粉质棒束孢在自然界能寄生于多种鳞翅目、双翅目、同翅目、鞘翅目和膜翅目的昆虫,其中明确记载的寄主为一种小刺蛾蛹和幼虫,而对蔗根锯天牛的侵染还未见报道。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种粉质棒束孢IFYJ141025及其应用,旨在克服现有粉质棒束孢未发现能寄生蔗根锯天牛的不足,通过生物技术手段防治蔗根锯天牛,避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题。
本发明是这样实现的,一种粉质棒束孢(Isaria farinose)IFYJ141025,于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.10138,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的进一步的目的在于提供上述粉质棒束孢IFYJ141025在蔗根锯天牛防治方面的应用。本发明于2014年10月,在云南省元江县甘蔗田间调查时发现粉质棒束孢在蔗根锯天牛中大量发生流行,引起大量蔗根锯天牛感染死亡。因此,该菌株是目前国内首次发现的寄生蔗根锯天牛、流行性很强的虫生真菌,在防治蔗根锯天牛中具有很大的开发应用前景。
本发明从罹病蔗根锯天牛幼虫上分离获得粉质棒束孢野生菌株,将野生菌株回接于蔗根锯天牛幼虫上复壮得到粉质棒束孢菌株,对该菌株采用按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的粉质棒束孢菌。在查氏培养基上,25℃条件下培养至第12天时,菌落直径达35mm,呈稀疏绒毛状,平展,中部淡鸭黄色,边缘白色,背面中部橙黄色,边缘白色。分生孢子梗主要从基质菌丝上长出,100-300×1.0-2.5μm;不规则分枝,其上着生有由2-4个瓶梗组成的轮生体,瓶梗基部拟椭圆形膨大,向上变细成明显的颈部,5-15×1.2-2.5μm,分生孢子椭圆形至梭形,光滑,透明,2.0-3.0×1.0-1.8μm。
相比于现有技术的缺点和不足,本发明具有以下有益效果:本发明是初次从粉质棒束孢体上分离得到的菌株,培养比较简单,生长快速,产孢量大。其分生孢子对蔗根锯天牛幼虫致病力强,环保无污染、不易产生抗药性,可以广泛地用于蔗根锯天牛的防治。
附图说明:
图1是粉质棒束孢感染的蔗根锯天牛及病原真菌的形态特征图;其中,a图为粉质棒束孢IFYJ141025在SDAY培养基上的培养症状;b图为粉质棒束孢IFYJ141025的分生孢子。
具体实施方式:
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例一、病原菌的分离、鉴定
1.1材料与方法
1.1.1材料
在云南省元江县采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病蔗根锯天牛幼虫。
查氏培养基(SDAY):1%蛋白胨+1%酵母粉+4%葡萄糖+1.5~2%琼脂粉+1000mL水。
无菌操作条件:所有的器皿和用具均经高温灭菌锅(121℃,30min),接种等操作均在超净工作台内进行。
培养条件:置于25℃光照(12L:12D)恒温箱中培养,待菌落形成后,转移到试管SDAY斜面,培养2~3天,转入4℃冰箱储存。
1.1.2病原菌的分离和纯化
分离:从罹病蔗根锯天牛幼虫尸体上分离病原菌。将罹病死亡的蔗根锯天牛幼虫虫体带回实验室,用5%次氯酸钾溶液进行表面消毒。在温度为25℃条件下培养,长出菌丝和分生孢子后按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、产孢能力强的菌株粉质棒束孢(Isaria farinose),转移到SDAY斜面上生长3~4天,在4℃冰箱储存。
复壮:将分离到的菌株在SDAY上培养5~7天后,产生大量分生孢子,再将该分生孢子挑入含1%吐温-80的无菌水,用玻璃棒搅拌均匀,得到适当浓度(108孢子/mL)的孢子悬浮液,用小型喷雾器均匀喷于蔗根锯天牛幼虫体表(以虫体表面湿润为度),保持相对湿度80%以上。待蔗根锯天牛幼虫死亡后,收集死虫于灭菌培养皿中并保湿,得到的幼虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。
纯化:挑取培养基上分生孢子粉,再次接种在新的培养基上。如此培养2~3代,菌株就被纯化。
1.1.3病原菌的鉴定
根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用40×10倍显光学微镜,镜检菌丝、分生孢子的形态。
1.2结果
从被虫生真菌自然侵染的蔗根锯天牛幼虫虫体上分离获得粉质棒束孢野生菌株,在萨氏琼脂培养基(SDAY)上培养,并回接于蔗根锯天牛幼虫复壮获得一菌株,对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株,即粉质棒束孢(Isaria farinose)IFYJ141025。
在光学显微镜(400倍)下,如图1所示,可以看到分生孢子梗主要从基质菌丝上长出,100-300×1.0-2.5μm;不规则分枝,其上着生有由2-4个瓶梗组成的轮生体,瓶梗基部拟椭圆形膨大,向上变细成明显的颈部,5-15×1.2-2.5μm,分生孢子椭圆形至梭形,光滑,透明,2.0-3.0×1.0-1.8μm。
根据田间感染症状、采集罹病虫体室内分离观察,并根据《中国真菌志第四十三卷:拟青霉属,棒束孢属戴氏霉属》(梁宗琦主编,2013)有关粉质棒束孢感染症状、分生孢子及菌丝的形态特征进行鉴定,确定为粉质棒束孢。
实施例二、粉质棒束孢纯化菌株生物学特性
2.1材料与方法
2.1.1供试菌株
选择纯化后生长旺盛、生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到SDAY上,于25℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养。
2.1.2菌落生长速率和产孢量的测定
取一皿事先培养好的粉质棒束孢,用8mm的打孔器打孔,接种于另一新鲜培养基上,做3个重复,置于25℃的恒温光照(12D:12L)培养箱中培养,每天定时测定其直径并记录,直到菌落长满培养基为止。用直径为8mm的打孔器在培养基相同的位置取菌饼,加1%吐温-80和20mL无菌水,冲洗孢子,制成孢子悬浮液,再用血球计数板测定其产孢量。
2.1.3孢子萌发率的测定
将菌株培养7~10天,分别用无菌水收集分生孢子,制成悬浮液,用带凹槽的载玻片测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上,置于底铺滤纸的培养皿内,滴加几滴无菌水保持湿度在100%RH,培养24小时后镜检,每个处理3次重复。
2.2结果
在SDAY培养上于25℃条件下生长良好,表1结果表明,培养前3天时菌落直径平均生长速度为0.38cm/d,其中在培养1d、2d、3d时菌落生长速度分别为0.018,0.133和0.231cm/d,培养第6、7天时,菌落增长速度最快,分别为1.49和1.19cm/d。表2结果表明,该菌株产孢快、产孢量较高,培养至第5天时产孢量可达1.00×108孢子/菌落。表3结果表明,24小时孢子的萌发率平均可以达到83.50%,表明该菌株的生长情况较好,生物学活性较好。
表1菌落直径的生长速度
表2产孢量测定结果
表3分生孢子萌发率(24小时)
实施例三、粉质棒束孢纯化菌株对蔗根锯天牛的室内毒力测定
3.1、材料与方法
3.1.1供试虫源
选择无病、大小一致的蔗根锯天牛三龄幼虫作为试虫,将供试蔗根锯天牛三龄幼虫置于放置有木削的八角瓶(4.5cm×4.5cm×19.5cm)中,在25±1℃和0L:24D的光周期条件下饲养。
3.1.2孢子悬浮液的制备
取长势良好的纯化粉质棒束孢用无菌水将分生孢子洗下并过滤配置成108孢子/ml分生孢子菌悬液,用无菌毛细滴管取滤液一滴滴于血细胞计数板上,在显微镜下数孢子并记录数据,用含0.5%吐温80的无菌水依次稀释为108、107、106、105、104五个浓度梯度的孢子悬浮液,以含0.5%吐温80的无菌水为空白对照,用于致病力测定。
3.1.3浸渍法
采用浸渍法对蔗根锯天牛3龄幼虫进行处理。即将试虫分别浸入浓度为1.0×108孢子/mL的孢子悬浮液中,轻轻摇动,30s后将试虫取出晾干,选取活力较高的试虫进行试验。将试虫置于八角瓶(4.5cm×4.5cm×19.5cm)中,并用灭菌土将幼虫覆盖,用甘蔗作为饲料,用小喷壶喷水对幼虫进行保湿,(25±1)℃恒温培养箱中饲养。以0.05%吐温-80的无菌水处理的蔗根锯天牛龟3龄幼虫为对照,每个处理设3个重复,每个重复10头试虫,连续观察10d。每天记录试虫的死亡数及僵虫数量,计算平均死亡率和僵虫率。数据用DPS 14.0软件进行线性回归统计分析。
3.2、结果
对蔗根锯天牛三龄幼虫的毒力进行了测定,粉质棒束孢菌株IFYJ141025分生孢子侵染蔗根锯天牛的生活史过程。实验结果表明:粉质棒束孢(Isaria farinose)菌株IFYJ141025对蔗根锯天牛三龄幼虫具有较高的毒力,接种处理后第10天时累积校正死亡率达87.68%,毒力回归方程为Y=2.38+0.47X(r=0.89),其中Y为死亡率机率值,X孢子浓度的对数值。LC50(孢子/mL)为3.75×105孢子/mL,LT50=7.43天。表明粉质棒束孢(Isariafarinose)菌株IFYJ141025具有开发为控制蔗根锯天牛的微生物农药的潜力。
该菌株是我们首次从蔗根锯天牛上分离纯化获得的粉质棒束孢(Isariafarinose)菌株IFYJ141025,CGMCC No.10138,该菌株在温度为25℃、相对湿度80%以上在SDAY培养基上生长快速,产孢量大,孢子萌发率高。其孢子悬浮液对蔗根锯天牛致病力较好,可以广泛地用于蔗根锯天牛的防治。同时,该菌株培养原料来源广泛,价格便宜,培养方法简单,易大量进行生产,具有较大的开发应用潜力,用该菌株防治蔗根锯天牛,即为典型的生物防治,可避免化学农药所带来的抗药及环境污染等问题,将为蔗根锯天牛绿色防控提供依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种粉质棒束孢(Isaria farinose)IFYJ141025,于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.10138。
2.权利要求1所述的粉质棒束孢IFYJ141025在蔗根锯天牛[Dorysthenes granulosus(Thomson)]防治方面的应用。
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