CN105255740A

CN105255740A - 一种粉质棒束孢ifmz130719及其应用

Info

Publication number: CN105255740A
Application number: CN201510587431.7A
Authority: CN
Inventors: 王新中; 徐发华; 陈斌; 韩非; 杜广祖; 肖关丽; 和淑琪; 郑亚强; 王德勋
Original assignee: DALI BRANCH OF YUNNAN TOBACCO Co
Current assignee: DALI BRANCH OF YUNNAN TOBACCO Co
Priority date: 2015-09-16
Filing date: 2015-09-16
Publication date: 2016-01-20

Abstract

本发明提供了一种粉质棒束孢IFMZ130719及其应用，该粉质棒束孢IFMZ130719于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.？10137。本发明是初次从烟草码绢金龟<i>Maladera？</i>sp.幼虫体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其分生孢子对危害烟草的码绢金龟幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于码绢金龟幼虫的防治。

Description

一种粉质棒束孢IFMZ130719及其应用

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种粉质棒束孢[Isariafarinose(Holmskiold)Fries]IFMZ130719及其应用。

背景技术：

码绢金龟Maladerasp.隶属于鞘翅目绒金龟科，是云南省烟草上的一种重要食叶害虫,在云南省分布较普遍，山地种植的烟草发生危害严重.烤烟从移栽还苗至团棵、旺长期，都受到码绢金龟的危害，叶片被咬成孔洞、缺刻，发生盛期虫口数量大的田块，烟株叶片被食尽，仅留叶脉，成扫帚状，使烟叶产量严重受损、质量下降。由于该虫以幼虫在烟草根际取食危害和存活，成虫可取食烟叶，而由于其幼虫长期生活于地下土壤中，因而对其幼虫的控制在码绢金龟幼虫的进行防治的关键。目前，对该虫的防治较难。化学杀虫剂虽然具有见效快、成本低的优点，但用药防治次数过多，不仅会引起农药残留和环境污染，而且能诱导害虫产生抗药性。而利用天敌等生物因素控制害虫已成为发展绿色植保的重要途径。由此，这些负面影响使人们在防治中更加关注生物防治。生物防治对人、畜、植物安全，害虫极少或不产生抗性，有利于环境保护。因此，研究和利用以昆虫病原真菌为基础的蛴螬类的生物防治，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题，已成为金龟甲类害虫科学治理和可持续控制的重要课题。

粉质棒束孢Isariafarinose(Holmskiold)Fries为半知菌亚门丝孢纲棒束孢属真菌。据报道，该菌在自然条件下能侵染寄生鳞翅目、双翅目、同翅目、鞘翅目和膜翅目的昆虫，但有关该菌对鳞翅目、双翅目、同翅目、鞘翅目和膜翅目昆虫中具体的感染种类不太清楚，目前唯一有明确记载的寄主为一种小刺蛾蛹和幼虫，因而就粉质棒束孢对码绢金龟的自然侵染也未见报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种粉质棒束孢IFMZ130719及其应用，旨在克服现有粉质棒束孢未发现能寄生码绢金龟(Maladerasp.)幼虫的不足，通过生物技术手段防治码绢金龟(Maladerasp.)幼虫，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题。

本发明是这样实现的，一种粉质棒束孢[Isariafarinose(Holmskiold)]IFMZ130719，于2014年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.10137，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的进一步的目的在于提供上述粉质棒束孢IFYJ141025在码绢金龟(Maladerasp.)幼虫防治方面的应用。本发明于2013年7月，在云南省蒙自市烟田间调查时发现粉质棒束孢在码绢金龟幼虫中大量发生流行，引起大量码绢金龟幼虫(蛴螬)的感染死亡。因此，该菌株是目前国内首次发现的寄生码绢金龟流行性很强的虫生真菌，在防治码绢金龟中具有很大的开发应用前景。

本发明从罹病码绢金龟幼虫上分离获得粉质棒束孢野生菌株，将野生菌株回接于码绢金龟幼虫上复壮得到粉质棒束孢菌株，对该菌株采用按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的粉质棒束孢菌。在马铃薯葡萄糖(PDA)培养基上,且菌落呈稀疏绒毛状，平展，中部淡呈鸭黄色，边缘呈白色，背面中部收呈橙黄色，边缘呈白色。其分生孢子梗主要从基质菌丝上长出，100-300×1.0-2.5μm；不规则分枝，其上着生有由2-4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗基部拟椭圆形膨大，向上变细形成明显的颈部，5-15×1.2-2.5μm，分生孢子椭圆形至梭形，光滑，透明，大小为2.0-3.0×1.0-1.8μm。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明是初次从粉质棒束孢体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大。其分生孢子对码绢金龟幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于码绢金龟的防治。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一、病原菌的分离、鉴定

1.1材料与方法

1.1.1材料

在云南省蒙自市采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病码绢金龟幼虫。

PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000mL。

无菌操作条件：所有的器皿和用具均经高温灭菌锅(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。

培养条件：置于25℃光照(12L：12D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到试管PDA斜面，培养2～3天，转入4℃冰箱储存。

1.1.2病原菌的分离和纯化

分离：从罹病码绢金龟幼虫尸体上分离病原菌。将罹病死亡的码绢金龟幼虫虫体带回实验室，用5％次氯酸钾溶液进行表面消毒。在温度为25℃条件下培养，长出菌丝和分生孢子后按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、产孢能力强的菌株粉质棒束孢Isariafarinose(Holmskiold)Fries，转移到PDA斜面上生长3～4天，在4℃冰箱储存。

复壮：将分离到的菌株在PDA上培养5～7天后，产生大量分生孢子，再将该分生孢子挑入含1％吐温-80的无菌水，用玻璃棒搅拌均匀，得到适当浓度(10⁸孢子/ml)的孢子悬浮液，用小型喷雾器均匀喷于码绢金龟幼虫体表(以虫体表面湿润为度)，保持相对湿度80％以上。待码绢金龟幼虫死亡后,收集死虫于灭菌培养皿中并保湿，得到的幼虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。

纯化：挑取培养基上分生孢子粉，再次接种在新的培养基上。如此培养2～3代，菌株就被纯化。

1.1.3病原菌的鉴定

根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用40×10倍显光学微镜，镜检菌丝、分生孢子的形态。

1.2结果

从被虫生真菌自然侵染的码绢金龟幼虫虫体上分离获得粉质棒束孢野生菌株，在马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上培养，并回接于码绢金龟幼虫复壮获得一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株，即粉质棒束孢Isariafarinose(Holmskiold)FriesIFMZ130719。

在光学显微镜40×10倍下，观赏可以看到分生孢子梗主要从基质菌丝上长出，100-300×1.0-2.5μm；不规则分枝，其上着生有由2-4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗基部拟椭圆形膨大，向上变细成明显的颈部，5-15×1.2-2.5μm，分生孢子椭圆形至梭形，光滑，透明，2.0-3.0×1.0-1.8μm。

根据田间感染症状、采集罹病虫体室内分离观察，并根据《中国真菌志第四十三卷：拟青霉属，棒束孢属戴氏霉属》(梁宗琦主编，2013)有关粉质棒束孢感染症状、分生孢子及菌丝的形态特征进行鉴定，确定为粉质棒束孢。

实施例二、粉质棒束孢纯化菌株生物学特性

2.1材料与方法

2.1.1供试菌株

选择纯化后生长旺盛、生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到PDA上，于25℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养。

2.1.2菌落生长速率和产孢量的测定

取一皿事先培养好的粉质棒束孢,用8mm的打孔器打孔，接种于另一新鲜培养基上，做三个重复，置于25℃的恒温光照(12D:12L)培养箱中培养，每天定时测定其直径并记录，直到菌落长满培养基为止。用直径为8mm的打孔器在培养基相同的位置取菌饼，加1％吐温-80和20mL无菌水，冲洗孢子，制成孢子悬浮液，再用血球计数板测定其产孢量。

2.1.3孢子萌发率的测定

将菌株培养5～7天，分别用无菌水收集分生孢子，制成悬浮液，用带凹槽的载玻片测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底铺滤纸的培养皿内，滴加几滴无菌水保持湿度在100％RH，培养24小时后镜检，每个处理3次重复。

2.2结果

在PDA培养上于25℃条件下生长良好，表1结果表明，培养前3天时菌落直径平均生长速度为0.44cm/d，其中在培养1d、2d、3d时菌落生长速度分别为0.09，0.59和0.68cm/d,培养第6、7天时，菌落增长速度最快，分别为1.38和1.01cm/d。表2结果表明，该菌株产孢快、产孢量较高，培养至第5天时产孢量可达1.03×10⁸孢子/菌落，第10天时产孢量达2.13×10⁸孢子/菌落,由此表明该菌株具有较高的产孢能力。表3结果表明，24小时孢子的萌发率平均可以达到80％以上，表明该菌株的生长情况较好，生物学活性较好。

表1菌落直径的生长速度

表2产孢量测定结果

表3分生孢子萌发率(24小时)

实施例三、粉质棒束孢纯化菌株对码绢金龟的室内毒力测定

3.1、材料与方法

3.1.1供试虫源

在室内盆栽烤烟，饲养码绢金龟，选择健康活跃、大小一致的码绢金龟三龄幼虫作为试虫，将供试码绢金龟三龄幼虫接种后，放置于盛有马铃薯切片的培养皿(R＝12cm)中，在25±1℃和0L：24D的光周期条件下饲养。

3.1.2孢子悬浮液的制备

取长势良好的纯化粉质棒束孢用无菌水将分生孢子洗下并过滤配置成10⁸孢子/ml分生孢子菌悬液，用无菌毛细滴管取滤液一滴滴于血细胞计数板上，在显微镜下数孢子并记录数据，用含0.5％吐温80的无菌水依次稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴五个浓度梯度的孢子悬浮液，以含0.5％吐温80的无菌水为空白对照，用于致病力测定。

3.1.3浸渍法

采用浸渍法对码绢金龟3龄幼虫进行处理。即将试虫分别浸泡在浓度为1.0×10⁸孢子/mL的孢子悬浮液中，轻轻摇动，30s后将试虫取出晾干，选取活力较高的试虫进行试验。将试虫置于24孔板中，并用灭菌土将幼虫覆盖，用马铃薯薯块切成小块作为饲料，每天更换马铃薯薯块，用小喷壶喷水对幼虫进行保湿，(25±1)℃恒温培养箱中饲养。以0.05％吐温-80的无菌水处理的码绢金龟2龄幼虫为对照，每个处理设3个重复，每个重复10头试虫，连续观察10d。每天记录试虫的死亡数及虫体表面出现绿色绿僵菌孢子的僵虫数量，计算平均死亡率和僵虫率。数据用DPS14.0软件进行线性回归统计分析。

3.2、结果

对码绢金龟三龄幼虫进行毒力测定，粉质棒束孢菌株IFMZ130719分生孢子侵染码绢金龟幼虫的生活史过程。实验结果表明：粉质棒束孢Isariafarinose(Holmskiold)Fries菌株IFMZ130719对码绢金龟三龄幼虫具有较高的毒力，接种处理后第10天时累积校正死亡率达86.43％，毒力回归方程为Y＝2.87+0.37X(r＝0.97)，其中Y为死亡率机率值，X孢子浓度的对数值。LC₅₀(孢子/mL)为5.71×10⁵孢子/mL，LT₅₀＝6.98天。表明粉质棒束孢Isariafarinose(Holmskiold)Fries菌株IFMZ130719具有开发为控制烟田码绢金龟幼虫的微生物农药的良好潜力。

该菌株是我们首次从码绢金龟幼虫上分离纯化获得的粉质棒束孢Isariafarinose(Holmskiold)Fries菌株IFMZ130719，CGMCCNo.10138，该菌株在温度为25℃、相对湿度80％以上在PDA培养基上生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对码绢金龟致病力较好，可以广泛地用于码绢金龟的防治。同时，该菌株培养原料来源广泛，价格便宜，培养方法简单，易大量进行生产，具有较大的开发应用潜力，用该菌株防治码绢金龟幼虫，即为典型的生物防治，可避免化学农药所带来的抗药及环境污染等问题，将为码绢金龟绿色防控及绿色烟叶生产提供依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种粉质棒束孢IFMZ130719，于2014年12月4日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.10137。

2.权利要求1所述的粉质棒束孢IFMZ130719在码绢金龟幼虫防治方面的应用。