CN109097290A - 对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用 - Google Patents

对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用。所述金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）的菌株号为Ma‑JCGR3，其于2015年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11855。本发明从自然感染的蔗根土天牛僵虫直接分离筛选的金龟子绿僵菌菌株，培养简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高；其分生孢子对蔗根土天牛幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于蔗根土天牛的防治。

Description

对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术防治领域，涉及一种金龟子绿僵菌菌株及其应用，具体地说是涉及一种对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用。
背景技术
蔗根土天牛(Dorysthenes granulosus Thomson)又名蔗根锯天牛，鞘翅目，天牛科。该虫主要以幼虫蛀害蔗根、嫩梢和种茎，蛀空内部组织，形成空心蔗，植株被害后易倒伏或整株枯死，造成死苗缺株，严重影响甘蔗的产量及糖份，受害蔗区甘蔗亩产量仅为2-3吨，造成很大的经济损失。此外，该虫还为害柑桔、龙眼、荔枝等果树，蛀害苗木，造成果苗果木枯死。据调查，南宁、北海、崇左、贵港、防城港市等蔗区均受该虫的严重危害，受害率可高达30％～40％以上。
蔗根土天牛是一种保护机制较为完善的昆虫。其幼虫寄居蔗根周围土中或蔗茎基部内部，生活隐蔽，受气候影响不大，采用化学方法防治很难奏效；成虫体壁和鞘翅坚厚，耐药力、生殖力强，种群增殖迅速而稳定，还可远距离扩散为害；世代历期较长，世代重叠，天敌种类少，食物资源充足；加上甘蔗种植面积较大、栽种品种和栽种方式过于单一，天敌的控制作用弱，就导致了蔗根土天牛近年来爆发成灾。当前对该虫的防治，群众还只依赖化学农药，尤其是剧毒农药，但效果并不理想，还使蔗田土壤及河塘水受污染，土壤微生物系紊乱，甚至引起人畜中毒，带来了农药残留、害虫抗药性增强、害虫再猖獗等问题。蔗根土天牛的猖獗发生，已成为甘蔗产业发展的重要障碍。随着环境污染的日益加重和食品安全问题的出现，寻找有效安全的防治方法来解决蔗根土天牛给甘蔗生产带来的巨大损失，已迫在眉睫。
金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是最早用于防治害虫的微生物之一，是一种有效的杀虫真菌，具有寄主范围广，致病力强，对人、作物无毒害等优点，利用该菌防治害虫的研究与实践已愈百年，主要用于防治蝗虫、蛴螬、林木天牛等，特别是对化学农药难以防治的钻蛀性、隐蔽性害虫及土壤害虫具有特殊的防效，有非常良好的应用前景。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用，其分生孢子对蔗根土天牛幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于蔗根土天牛的防治。
一种金龟子绿僵菌菌株，所述金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的菌株号为Ma-JCGR3，其于2015年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11855。
优选的,所述对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株的菌落为橄榄绿色，分生孢子梗产生于营养菌丝，分枝。
优选的,末端瓶梗长8μm-16μm，基部宽2μm-2.5μm，分生孢子链生，长椭圆形，光滑，聚集呈橄榄绿色，6-8μm×2-3μm。
本发明还提供一种杀虫菌剂，它的活性成分是本发明所述的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)。
本发明所述的金龟子绿僵菌在制备植物杀虫剂中的应用：所述植物杀虫剂的靶标害虫为：蔗根土天牛。
所述金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)Ma-JCGR3的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明具有以下有益效果：
本发明从自然感染的蔗根土天牛僵虫直接分离筛选的金龟子绿僵菌菌株，培养简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高；其分生孢子对蔗根土天牛幼虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于蔗根土天牛的防治。
附图说明
图1为金龟子绿僵菌Ma-JCGR3菌株在PDA培养基上27±1℃下培养15天的菌落形态图。
图2为蔗根土天牛幼虫及蔗根土天牛幼虫被金龟子绿僵菌Ma-JCGR3感染症状图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：
实施例1
病原菌的分离、鉴定。
将采集到的自然感染的蔗根土天牛僵虫先用75％酒精浸没3～5s，再用0.1％升汞表面消毒3min，灭菌水冲洗3次，在无菌条件下，用灭菌刀具将感染虫体切3mm见方小块接种于PDA平板上，放入27℃培养箱中培养，长出菌丝后按常规方法进行单孢分离、培养获得纯的金龟子绿僵菌Ma-JCGR3菌株，转移到PDA斜面上培养7天，在4℃冰箱保藏。
形态学鉴定：
将分离纯化的金龟子绿僵菌菌株在直径为90mm的平板PDA培养基上于27±1℃条件下培养，4～5天后挑取菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10～12天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。15天左右观察记录菌落形态特征，如图1所示，培养初期菌落为白色棉絮状，产孢时为橄榄绿色，分生孢子梗产生于营养菌丝，分枝。末端瓶梗长8μm-16μm，基部宽2μm-2.5μm分生孢子链生，长椭圆形，光滑，聚集呈橄榄绿色，6-8μm×2-3μm。最佳生长温度范围为24-28℃。
菌株的ITS序列测定及分子鉴定：
利用Ma-JCGR3菌株的菌丝体提取总DNA，以提取的DNA为模板，进行扩增、测序，经中国农业微生物菌种保藏管理中心鉴定为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，所述金龟子绿僵菌Ma-JCGR3的ITS1-5.8S-ITS2区序列如下：
实施例2
金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)Ma-JCGR3的生物学特性。
菌落生长速率和产孢量的测定：用点滴法将金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)Ma-JCGR3接种于PDA平板培养基中央，置于27±1℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个重复，共观察15d。同时记录开始产孢时间，用直径为1.5cm的打孔器，于菌落中心至边缘1/2处打取小菌碟，取出菌碟置于含20mL的0.1％吐温-80无菌水的锥形瓶内，振荡使孢子充分分散并适当稀释，血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量。
孢子萌发率的测定：将菌株培养10天，用含0.1％吐温-80无菌水收集分生孢子，摇匀制成浓度为106孢子/mL的悬浮液。将孢子悬浮液滴在水琼脂培养基上，用三角玻璃棒涂匀，置于27±1℃培养箱中培养，培养24h后镜检萌发率，每个处理重复3次。菌落直径的生长速率、产孢量测定结果、24h分生孢子萌发率的结果分别如表1、表2和表3所示。
由表1可知，金龟子绿僵菌Ma-JCGR3在PDA培养基上于27±1℃条件下生长良好，生长较快，培养后前7天内菌落直径平均生长速率为0.49cm/d，其中第3天为快速生长期，菌落增长速率为0.66cm/d。由表2可看出，菌落从第4天开始产孢，产孢量为0.19×108孢子/cm2，培养至第7天时产孢量达1.27×108孢子/cm2，产孢速度快，产孢量较高。由表3可看出，24小时孢子的萌发率可达88.47％，表明该菌株的生物学特性好，生长情况好。
表1 菌落直径的生长速率
表2 产孢量测定结果
表3 24h分生孢子萌发率
实施例3
采用浸渍法测定金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)Ma-JCGR3对蔗根土天牛幼虫的致病力。
从PDA平板上刮取一定量的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)Ma-JCGR3孢子置于灭菌的0.1％吐温-80溶液中，配制成107孢子/mL的孢子悬浮液；将健康活泼的蔗根土天牛幼虫浸渍，同时轻轻翻转虫体，10s后取出置于垫有保湿滤纸的灭菌培养皿(直径12cm，高2.5cm)中，皿内放入一段新鲜蔗茎供其取食。每处理20头幼虫，单头饲养，重复4次，以浸渍0.1％土温-80无菌水溶液处理作为对照。处理后置于26±1℃、RH85％±5％恒温培养箱避光饲养，每天观察记录死亡虫数，并将死亡的幼虫继续保留在培养皿中保湿观察，确认是否为供试菌株感染死亡，统计死亡率及僵虫率，蔗根土天牛幼虫及蔗根土天牛幼虫被金龟子绿僵菌Ma-JCGR3感染症状图如图2所示。数据用DPS 7.05软件进行线性回归统计分析。
实验结果表明：金龟子绿僵菌Ma-JCGR3菌株对蔗根土天牛幼虫具有较高的毒力，接种处理后第15天时累积校正死亡率达91.67％，毒力回归方程为Y＝0.13+5.58X(r＝0.96)，LT50＝7.47天。金龟子绿僵菌Ma-JCGR3菌株具有开发为控制蔗根土天牛的微生物农药的潜力。
实施例4
采用孢子拌土法测定金龟子绿僵菌Ma-JCGR3菌株对蔗根土天牛幼虫的致病力。
取金龟子绿僵菌Ma-JCGR3菌株孢子粉与采集于蔗田灭过菌的土壤混合均匀，配制成浓度为107孢子/g土的带菌土壤置于养虫盒中，将健康的蔗根土天牛幼虫小心置于带菌土壤中，并埋置新鲜蔗茎供其取食，然后将养虫盒置于黑暗的26±1℃恒温培养箱中，每5天观察记载蔗根土天牛幼虫死亡情况，虫尸处理方法同浸渍法。每盒放置20头幼虫，每处理做3个重复，结果如表4所示。
由表4可见，采用107孢子/g土的带菌土壤处理蔗根土天牛幼虫后，随着时间的推移，蔗根土天牛幼虫的死亡率逐渐增高，处理15天后，蔗根土天牛幼虫死亡率达83.33％，感染率为100％，对照组的蔗根土天牛幼虫没有出现死亡。
表4 金龟子绿僵菌Ma-JCGR3孢子拌土法对蔗根土天牛幼虫的致病力
实施例2、3、4的结果表明，金龟子绿僵菌Ma-JCGR3菌株，CGMCC No.11464是我们从自然感染的僵虫中分离到的对蔗根土天牛幼虫具有较强致病力的金龟子绿僵菌菌株，该菌株在PDA培养基上，温度为27±1℃条件下生长速度快，产孢量大，孢子萌发率高，杀虫效果好，是一株在蔗根土天牛的防治上具有潜在意义的生防菌株。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 551
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggcggtcta ctgattcgag gtcactataa aaagttgggg gtttttacgg cagtggaccg 60
cgccgggctc ctgttgcgag tgttttacta ctgcgcagag gagggccacg gcgagaccgc 120
caatcaattt aagggacggc tgtgctggaa aaccagcctc gccgatcccc aacaccaagt 180
ccacagggga cttgaggggc gtaatgacgc tcgaacaggc atgcccgcca gaatactgac 240
gggcgcaatg tgcgttcaaa gattcgatga ttcactgaat tctgcaattc acattactta 300
tcgcatttcg ctgcgttctt catcgatgcc agaaccaaga gatccgttgt tgaaagtttt 360
gattcatttt tttttaacca ctcagaagat acttattaaa aaattcagaa ggtttgggtc 420
cccggcgggc gcgaagtccc gccgaagcaa caatgaaagg tataattcac aggggttggg 480
agttggataa ctcggtaatg atccctccgc tggttcacca acggagacct tgttacgatt 540
ttttacttcc a 551

Claims (6)

1.一种金龟子绿僵菌菌株，其特征在于：所述金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）的菌株号为Ma-JCGR3，其于2015年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11855。
2.如权利要求1所述的金龟子绿僵菌菌株，其特征在于,所述对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株的菌落为橄榄绿色，分生孢子梗产生于营养菌丝，分枝。
3.如权利要求1所述的金龟子绿僵菌菌株，其特征在于,末端瓶梗长8μm-16μm，基部宽2μm-2.5μm，分生孢子链生，长椭圆形，光滑，聚集呈橄榄绿色，6-8μm×2-3μm。
4.一种杀虫菌剂，它的活性成分是权利要求1所述的金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）。
5.如权利要求1所述的金龟子绿僵菌在制备植物杀虫剂中的应用：所述植物杀虫剂的靶标害虫为：蔗根土天牛。
6. 如权利要求1所述的对蔗根土天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株，其特征在于：所述金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）Ma-JCGR3的序列如SEQ ID NO:1所示。
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