CN107794234B - 一株具有杀虫活性的菌株Pr－nj01及其生产杀虫菌剂和应用 - Google Patents
一株具有杀虫活性的菌株Pr－nj01及其生产杀虫菌剂和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株具有杀虫活性的菌株Pr‑nj01及其生产杀虫菌剂和应用，该菌株Pr‑nj01经鉴定为雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年5月10日，保藏编号为CCTCC NO：M2017251。本发明经分离筛选获得具有杀虫活性的菌株Pr‑nj01，可用于田间害虫的防治，该菌株对田间害虫具有广谱杀灭效果，可以杀灭鳞翅目和半翅目等田间害虫，并且杀灭效果好。本发明的杀虫菌剂制备简单，具有生产成本低，使用方便，杀虫效果好的优点，本菌剂的使用可以减少化学农药的使用，对保护生态环境和保障食品安全具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及农业害虫生物防治，具体涉及一株具有杀虫活性的菌株Pr-nj01 及其生产杀虫菌剂和应用。
背景技术
农业生产上化学农药的大量使用，一方面造成生态环境的破坏，另一方面农药的残留影响食品安全。为了减少化学农药的使用，生物农药的开发越来越收到重视。生物农药与传统化学农药相比，有很多优点。例如，生物农药对生态环境影响很小；生物农药选择性高，对人畜安全性高；生物农药不易引起害虫的抗药性等等。
目前，农业生产上已在使用一些生物农药等进行病虫害的生物防控。例如利用Bt制剂防治水稻螟虫等害虫；利用核型多角体病毒制剂防治甜菜夜蛾和斜纹夜蛾等害虫；利用枯草芽孢杆菌制剂防控水稻条纹叶枯病、大豆锈病等病害。这些生物制剂的使用降低了农业生产上化学农药的使用量，这既保护了我们的生态环境，又保障了人们的食品安全。为此，收集和发掘更多的生物防治资源对于作物的病虫害防控和农产品的绿色无公害生产具有重要意义。
普罗威登斯菌是直杆菌，革兰氏染色呈阴性，兼性厌氧，不出现群集。普罗威登斯菌可以用于污水净化处理(专利申请号：CN201310243703)，也可以用于制备抗菌药物(专利申请号：CN201410159344)。但用于农业害虫的防控鲜见报道，专利KR20120089522A和专利CN 104663724 A公开了普罗威登斯菌可以防治鳞翅目田间害虫，但是作用范围小，只能杀死小菜蛾、甜菜夜蛾等鳞翅目田间害虫，而对于田间其他类型害虫，如半翅目等不能杀死，不具有广谱性，并且效果一般。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一株具有杀虫活性的菌株 Pr-nj01；该菌株对田间害虫具有广谱杀灭效果，可以杀灭鳞翅目和半翅目等田间害虫，并且杀灭效果好；本发明的另一目的是提供该菌株Pr-nj01生产的杀虫菌剂及其应用。该菌株制备的杀虫菌剂可在短时间内杀灭鳞翅目和半翅目等田间害虫。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一株具有杀虫活性的菌株 Pr-nj01，经鉴定为雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏时间为 2017年5月10日，保藏编号为CCTCC NO：M 2017251。该菌株是从被感染的二化螟虫体中分离到的。主要生物学特性为：革兰氏阴性菌，在LB固体培养基上培养2-3天后，菌落形状不规则，边缘整齐，最外部边缘呈乳白色，内部呈棕色。
本发明所述的菌株Pr-nj01在杀灭田间害虫中的应用。
其中，所述的害虫包括鳞翅目田间害虫和半翅目田间害虫。
进一步地，所述的鳞翅目田间害虫包括斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和二化螟；所述半翅目田间害虫包括褐飞虱、灰飞虱和烟粉虱。
本发明所述的菌株Pr-nj01生产的杀虫菌剂。
本发明所述的杀虫菌剂的制备方法，包括如下步骤：在无菌操作条件下，将菌株Pr-nj01接种到灭菌的LB液体培养基中，在摇床中振荡培养，由此获得菌株Pr-nj01的具有杀虫活性的杀虫菌剂。
其中，所述振荡培养的转速200-250rpm，培养温度为28-37℃，培养时间为 12-48小时。
本发明所述的杀虫菌剂在杀灭田间害虫中的应用。
其中，所述的害虫为鳞翅目和半翅目。
进一步地，所述的鳞翅目田间害虫包括斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和二化螟；斜纹夜蛾和甜菜夜蛾属于夜蛾科害虫，咀嚼式口器，食性杂，对各类经济作物特别是蔬菜会造成极大的危害；二化螟属于螟蛾科，对水稻能造成极大的危害；所述半翅目田间害虫包括褐飞虱、灰飞虱和烟粉虱。褐飞虱和灰飞虱属于飞虱科，刺吸式口器，对水稻会造成很大的危害；烟粉虱属于粉虱科，刺吸式口器，对多种蔬菜等作物造成极大危害。
本发明涉及的主要试剂和仪器：
胰化蛋白胨Casein Peptone(上海生工生物工程股份有限公司)
酵母提取物Yeast Extract(上海生工生物工程股份有限公司)
盐NaCl(上海生工生物工程股份有限公司)
琼脂粉Agar(上海生工生物工程股份有限公司)
超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)
恒温培养箱HZQ-X100(哈尔滨东联电子技术开发公司)
立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50FBS(哈尔滨东联电子技术开发公司)
台式高速离心机(德国Eppendorf公司)
PCR仪(BIO-RAD Laboratories-Segrate(Milan)Italy)
凝胶成像分析仪(BIO-RAD Laboratories-Segrate(Milan)Italy)
LB培养基(1000mL体系)
胰化蛋白胨 10.0g
酵母提取物 5.0g
NaCl 10.0g
固体LB培养基中加入大约重量体积比g/ml 1.5％琼脂粉，121℃高压灭菌 30min。
有益效果：与现有技术相比，本发明经分离筛选获得具有杀虫活性的菌株 Pr-nj01，可用于田间害虫的防治，该菌株对田间害虫具有广谱杀灭效果，可以杀灭鳞翅目和半翅目等田间害虫，并且杀灭效果好。本发明的杀虫菌剂制备简单，具有生产成本低，使用方便，杀虫效果好的优点，可杀死大多数田间害虫，包括鳞翅目和半翅目等田间害虫，本菌剂的使用可以减少化学农药的使用，对保护生态环境和保障食品安全具有重要意义。
附图说明
图1为菌株Pr-nj01菌落照片；
图2为菌株Pr-nj01菌剂对甜菜夜蛾的致死活性；
图3为菌株Pr-nj01菌剂对斜纹夜蛾的致死活性；
图4为菌株Pr-nj01菌剂对二化螟的致死活性；
图5为菌株Pr-nj01菌剂对褐飞虱的致死活性；
图6为菌株Pr-nj01菌剂对灰飞虱的致死活性；
图7为菌株Pr-nj01菌剂对烟粉虱的致死活性。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
菌株Pr-nj01的分离和鉴定：
饲养的二化螟试虫，有些二化螟幼虫个体被致病微生物感染后死亡，收集死亡试虫的尸体，经体积分数75％的乙醇消毒后用灭菌研磨棒将虫体研磨。研磨液离心后用灭菌水稀释，再取稀释后的研磨液涂布与固体LB培养基上，30℃培养 2d后，挑取长出的一个单菌落接种于含LB液体培养基中，30℃，200rpm培养2d，获得该菌株的菌剂。利用菌剂在室内对甜菜夜蛾进行杀虫活性测定，结果显示该菌剂能够杀死甜菜夜蛾幼虫，得到一株具有杀虫活性的菌株，命名为Pr-nj01。
将菌株Pr-nj01在LB固体培养基上培养2-3天后，菌落形状不规则，边缘整齐，最外部边缘呈乳白色，内部呈棕色，如图1所示。
以上述菌株的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行 PCR扩增，得到长度为1401bp的16S rDNA基因序列，如SEQ ID No：1所示。在 EzTaxon数据库(www.ezbiocloud.net)中进行Blast分析，结果表明上述菌株与 Providencia rettgeriDSM 4542T的同源性达到99.7％，结合形态和生理生化特征，将菌株Pr-nj01初步鉴定为雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)。因此，将上述菌株命名为雷氏普罗威登斯菌Pr-nj01(Providencia rettgeri Pr-nj01)。将该菌株 Pr-nj01送交位于中国武汉，中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏时间为2017年5月10日，保藏编号为CCTCC NO：M2017251。
实施例2
上述菌株Pr-nj01的菌剂制备：
1)制备LB液体培养基分装于三角瓶中，进行灭菌备用；
2)在无菌操作条件下，用接种针将菌株Pr-nj01接种到上述灭菌好的LB三角瓶中，在摇床中振荡培养，转速200rpm，培养温度为28℃，培养时间为48小时，由此获得菌株Pr-nj01制备的具有杀虫活性的杀虫菌剂。
实施例3
1)制备LB液体培养基分装于三角瓶中，进行灭菌备用；
2)在无菌操作条件下，用接种针将菌株Pr-nj01接种到上述灭菌好的LB三角瓶中，在摇床中振荡培养，转速250rpm，培养温度为37℃，培养时间为12小时，由此获得菌株Pr-nj01制备的具有杀虫活性的杀虫菌剂。
试验例1
菌株Pr-n101的培养菌剂对甜菜夜蛾的生测试验：
利用人工饲料喷施实施例2制备的杀虫菌剂进行生测试验。分别用2龄和3 龄甜菜夜蛾幼虫进行试验。生测试验在六孔塑料板内进行。挑取日龄一致的2 龄(2nd)甜菜夜蛾，每孔3头，两个板为一组，共设置四组，每孔中加入喷施菌剂的饲料。2龄对照组(2nd CK)试虫设置如处理组，但饲料上不喷施菌剂。另外，挑取日龄一致的3龄(3rd)甜菜夜蛾，每孔3头，两个板为一组，共设置四组，每孔中加入喷施菌剂的饲料。3龄对照组(3rd CK)试虫设置如处理组，但饲料上不喷施菌剂。每天记录死虫数，直至试虫化蛹，最后统计总体死亡率，试验结果如图2。生测结果显示所述菌株Pr-nj01的培养菌剂对甜菜夜蛾的2龄和3龄幼虫具有较高的杀虫活性。
试验例2
菌株Pr-nj01的培养菌剂对斜纹夜蛾的生测试验：
试验方法与试验例1的方法相同，试验结果如图3。生测结果显示所述菌株 Pr-nj01的培养菌剂对斜纹夜蛾的2龄和3龄幼虫具有较高的杀虫活性。
试验例3
菌株Pr-nj01的培养菌剂对二化螟的生测试验：
试验方法与试验例1的方法相同，试验结果如图4。生测结果显示所述菌株 Pr-nj01的培养菌剂对二化螟的2龄和3龄幼虫具有一定的杀虫活性。
试验例4
菌株Pr-nj01的培养菌剂对褐飞虱的生测试验：
褐飞虱的生测采用浸苗法。选择高度基本一致的7日龄稻苗，完全浸没在实施例2制备的杀虫菌剂中，浸泡15秒后取出并在室温中自然晾干。晾干后将稻苗根部用吸水纸包裹并保湿，并放入350ml的一次性塑料杯中，杯口用纱布罩住。随机挑选日龄一致的2龄和3龄褐飞虱若虫，分别接入到准备好的塑料杯中，每杯接入10头若虫，设置4组重复。对照组稻苗用清水处理。试验结果如图5。生测结果显示所述菌株Pr-nj01的培养菌剂对褐飞虱的2龄(2nd)和3龄(3rd) 若虫具有较高的杀虫活性。
试验例5
菌株Pr-nj01的培养菌剂对灰飞虱的生测试验：
试验方法与试验例4的方法相同，试验结果如图6。生测结果显示所述菌株 Pr-nj01的培养菌剂对灰飞虱的2龄(2nd)和3龄(3rd)若虫具有较高的杀虫活性。
试验例6
菌株Pr-nj01的培养菌剂对烟粉虱的生测试验：
烟粉虱生测采用浸叶法。首先取直径35mm的干净培养皿，将琼脂高压灭菌后倒到培养皿内，待琼脂凝固后备用。其次采集新鲜的黄瓜叶片，按照培养皿内径将黄瓜叶片剪成圆形。剪好的圆形叶片浸没在实施例2制备的杀虫菌剂中，浸泡15秒后取出并在室温中自然晾干。晾干后放置在上述有琼脂的培养皿中。随机挑取日龄一致的烟粉虱成虫接入到上述准备好的圆形叶片上。每个叶片接虫 10头，设置四组重复。对照组的叶片用清水处理。试验结果如图7。生测结果显示所述菌株Pr-nj01的培养菌剂对烟粉虱成虫(Adult)具有较高的杀虫活性。
Claims (10)
1.一株具有鳞翅目和半翅目害虫杀虫活性的菌株Pr-nj01，经鉴定为雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年5月10日，保藏编号为CCTCC NO：M 2017251。
2.权利要求1所述的菌株Pr-nj01在杀灭田间害虫中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述害虫包括鳞翅目和半翅目田间害虫。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鳞翅目田间害虫包括斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和二化螟；所述半翅目田间害虫包括褐飞虱、灰飞虱和烟粉虱。
5.一种杀虫菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的菌株Pr-nj01。
6.一种权利要求5所述的杀虫菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在无菌操作条件下，将菌株Pr-nj01接种到灭菌的LB液体培养基中，在摇床中振荡培养，由此获得菌株Pr-nj01的具有杀虫活性的杀虫菌剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述振荡培养的转速为200-250rpm，培养温度为28-37℃，培养时间为12-48小时。
8.如权利要求5所述的杀虫菌剂在杀灭田间害虫中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的害虫为鳞翅目和半翅目。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的鳞翅目田间害虫包括斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和二化螟；所述半翅目田间害虫包括褐飞虱、灰飞虱和烟粉虱。
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Application publication date: 20180313 Assignee: Nanjing weidite Electronic Technology Co.,Ltd. Assignor: JIANGSU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023980049145 Denomination of invention: A strain Pr-nj01 with insecticidal activity and its production and application of insecticidal agents Granted publication date: 20190903 License type: Common License Record date: 20231203 |