CN109673672A - 一种杂色曲霉hy12菌株的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杂色曲霉HY12在制备防治烟草斜纹夜蛾的真菌杀虫菌剂中的应用。杀虫菌剂包括杂色曲霉HY12的发酵物和农药学上可接受的辅料，辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。杀虫菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。本发明提供的含有杂色曲霉HY12发酵液的杀虫菌剂防治斜纹夜蛾时，可使其提前进入蛹期，提高斜纹夜蛾化蛹期间的畸形率和死亡率，对斜纹夜蛾的繁衍具有一定的抑制作用，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，同时为利用环保健康的方法防治病虫害杀虫菌剂前期的施用推广，提供实验依据。

Description

一种杂色曲霉HY12菌株的应用

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种杂色曲霉HY12菌株的应用。

背景技术

自发明化学农药之后，化学农药以每年5％惊人速度增长。虽然在过去的几十年中，化学农药在农业增产和害虫防治中起到了重要作用，但化学农药的大量使用，带来了严重的“3R”问题(即抗药性Resistance，农药残留Residence，再猖獗Resurgence)，也带来了一系列的生态环境问题。长期大量使用化学农药导致抗药性害虫增加，特别是近10年来，棉铃虫、蚜虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、叶螨类等多发性害虫对菊酯类、有机磷类化学农药的抗药性增加了几百乃至数千倍。化学农药的施用，使农产品中农药残留量增加，严重污染了环境，危及人类建康及生命。随着人们生活水平的提高，人们对环境的要求越来越高，因此迫使人们寻找一种害虫防治替代方法。

斜纹夜蛾(Spodoptera litura)属鳞翅目夜蛾科斜纹夜蛾属的一个物种，危害寄主相当广泛，除十字花科蔬菜外，还可危害包括瓜、茄、豆、葱、韭菜、菠菜以及粮食、经济作物等近100科、300多种植物，是一种重要的农业害虫，以幼虫咬食叶片、花蕾、花及果实，初龄幼虫啮食叶片下表皮及叶肉，仅留上表皮呈透明斑。斜纹夜蛾4龄以后进入暴食，咬食叶片，仅留主脉，在包心椰菜上，幼虫还可钻入叶球内危害，把内部吃空，并排泄粪便，造成污染，使之降低乃至失去商品价值。斜纹夜蛾虫害在国内各地都有发生，对生产带来了极大的损害。

因此，为了规避化学杀虫剂抗性的问题，也使农民和种植者能够回应消费者对农药残留的问题，提供防治烟草斜纹夜蛾的真菌杀虫菌剂是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种杂色曲霉HY12在制备防治烟草斜纹夜蛾的真菌杀虫菌剂中的应用。将杂色曲霉HY12的发酵物和农药学上可接受的分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种进行混合，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂的真菌杀虫菌剂。杂色曲霉HY12的发酵物可感染斜纹夜蛾，使其提前进入蛹期，提高斜纹夜蛾化蛹期间的畸形率和死亡率，对化蛹期间的斜纹夜蛾具有较高的致畸率和致死率，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，同时为利用环保健康的方法防治病虫害杀虫菌剂前期的施用推广，提供实验依据。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

从烟田斜纹夜蛾为害区采集土样，从土样中于偶然情况下分离获得13个真菌菌株并对真菌进行纯培养，经形态学观察初步鉴定，它们分别为白僵菌属(Beauverja)2株，镰刀菌属(Fusarium)2株，曲霉属(Aspergullus)3株，木霉属(Trichoderma)1株，青霉属(Penicillium)1株，枝孢属(Cladosporium)1株、未鉴定真菌3株。用纯培养的13个菌株接种斜纹夜蛾3龄幼虫后观察，筛选出1株繁殖速度快，对斜纹夜蛾致病性强的菌株，得到本发明中的技术方案。

一种杂色曲霉HY12(Aspergillus versicolor)在制备杀虫菌剂中的应用，所述杀虫菌剂为防治烟草斜纹夜蛾的真菌杀虫菌剂；所述菌株于2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC NO：14790。

杂色曲霉HY12对斜纹夜蛾致病性(感染性)强，从接种至斜纹夜蛾起，接种菌株HY12的试虫行动迟缓，且提前进入蛹期，化蛹期间试虫畸形率和死亡率最高。

进一步的，所述杀虫菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。

其中，将杀虫菌剂制备成可湿性粉剂，用于喷雾、拌种和浸种；将杀虫菌剂制备成水分散粒剂可用于喷雾和泼浇，制造和使用简便，成本低；将杀虫菌剂制备成水悬浮剂可用于喷雾、拌种、涂茎、泼浇等，具有湿润展布性和附着性好，渗透性强的优点；将杀虫菌剂制备成可分散油悬浮剂，可直接作超低容量喷雾，工效高。本发明提供的多种剂型，可满足不同区域、不同场地及不同条件下应用本发明，具有较好的利用推广性。

进一步的，所述杀虫菌剂还包括农药学上可接受的辅料，所述辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。

本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

进一步的，所述杀虫菌剂的制备方法为：

(1)将所述杂色曲霉HY12移于液体培养基中，28-30℃恒温培养28-35h制成取菌株母液；

(2)取所述菌株母液与灭菌后的所述液体培养基按照1:40-45的体积比进行混合，在28-30℃，180-200r/min摇床培养28-35h，制成发酵液；

(3)将步骤(2)所述发酵液与所述辅料均匀混合即可。

所述液体培养基为SDAY培养基，其中所述SDAY培养基包括以下重量份数的组分，葡萄糖4份，蛋白胨1份，酵母浸出粉1份和水100份。

其中杂色曲霉HY12菌株在SDAY培养基上生长最快且产孢量最大，发酵结束后，产孢量达到313.8×10⁷/mL；其中利用本发明提供的含有杂色曲霉HY12发酵液的杀虫菌剂，其对烟草斜纹夜蛾的防治效率可达到85.2％，具有突出的防治效果。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种杂色曲霉HY12在制备防治烟草斜纹夜蛾的真菌杀虫菌剂中的应用，具有如下技术优点：本发明将杂色曲霉HY12的发酵物和农药学上可接受的分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种进行混合，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂的真菌杀虫菌剂，杂色曲霉HY12的发酵物可感染斜纹夜蛾，使其提前进入蛹期，提高斜纹夜蛾化蛹期间的畸形率和死亡率，对斜纹夜蛾的繁衍具有较好的抑制作用，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，同时为利用环保健康的方法防治病虫害杀虫菌剂前期的施用推广，提供实验依据。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

杂色曲霉HY12菌株筛选

从湘南烟田斜纹夜蛾为害区采集47个土样，其中永州江华25个土样，衡阳16个土样，江永4个土样，宁远2个土样。其中利用5点取样法采集土样，选择两烟株之间的中心距离处作为取土点，用土铲向下切取长10cm、宽10cm、深5cm土壤样品放入无菌的自封塑料袋中，带回实验室，置于冰箱中保存备以分离。详细记录样品采集的时间、地点及相关信息，不同土样要分别进行标记。

将采回的烟田土样在无菌状态下碾碎并充分混合，过目筛后再充分混合，进一步用四分法进行多次取样，直至最终土壤样品量为20-50g。

土壤悬浮液的制备：随机挑取2.5g土壤样品，加入50mL 0.05％吐温-80溶液置于试管中，充分震荡混匀；取出2mL悬浊液加入到另一试管中，再加入8mL 0.05％吐温80溶液中，震荡混匀，从中再取出2mL，加8mL0.05％吐温80溶液，依次类推，悬浊液的浓度分别为0.05、0.01、0.002mg/L；各浓度取0.2mL悬浊液加入到HECK培养基中进行稀释涂布，25.6℃下培养5天。其中HECK培养基包括下列重量份数的组分：葡萄糖4份、蛋白胨2份，高锰酸钾0.025份，放线菌酮0.5份，庆大霉素0.2份，氨苄青霉素0.048份，琼脂2份和水100份。

挑取HECK培养基中的单菌落，然后在SDAY真菌培养基上采用平板划线法进行分离纯化，获得纯化的生长的菌株。其中SDAY培养基为：葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，酵母浸出粉10g，水1000mL，共获得13个真菌菌株，经形态学观察初步鉴定，它们分别为白僵菌属(Beauverja)2株，镰刀菌属(Fusarium)2株，曲霉属(Aspergullus)3株，木霉属(Trichoderma)1株，青霉属(Penicillium)1株，枝孢属(Cladosporium)1株、未鉴定真菌3株。将每个菌株保存至斜面试管中编号，保存于4℃冰箱中，后期用于接种试验。以上操作均在超净工作台上保持无菌状态进行。

虫体接种试验

供试试虫采用斜纹夜蛾的3龄幼虫，第一代幼虫采自湖南农业大学耘园基地，连续室内饲养2代后用于试验。

将上述得到的菌株在SDAY平面培养基培养15d充分产孢后，用灭菌水(0.05％吐温-80)配制成3.13×10⁹个/mL的孢子悬浮液。选用虫龄、生长状况一致并且健康的斜纹夜蛾3龄幼虫置于直径为90cm的培养皿中，底部垫有一层吸水纸，用移液枪吸取已配置好的孢子悬浮液均匀滴在虫体体壁周围，以充分接触为宜。待斜纹夜蛾幼虫体壁较干时添加干净红薯叶，然后盖上纱布，置于室温中；同时以灭菌水喷洒斜纹夜蛾体壁作对照，每皿处理10头，每个处理3次重复。

将接种处理后的斜纹夜蛾置于室内常温下培养，每隔6h定量添加新鲜红薯叶，每天定时观察记录斜纹夜蛾的发病和死亡情况，如斜纹夜蛾体壁颜色变化、湿润程度和行为特征和取食情况等。连续观察15d，记录相应的数据，将记录的原始数据，计算各处理中始见虫体死亡时间、虫体的累计死亡率。

其中，对照组的斜纹夜蛾生长发育正常，全部都能正常化蛹。用纯培养的13个菌株接种斜纹夜蛾3龄幼虫后观察，有6个菌株(CZ-6青霉属、YJH2青霉属、HY-7木霉属、HY-9曲霉属、HY-10木霉属和NY-1木霉属)没有引起发病，其取食和生长发育未受到影响。其他7个菌株对斜纹夜蛾表现出不同程度的致病性，见表1。

表1分离出的不同菌株对斜纹夜蛾3龄幼虫的影响

菌株HY12接种斜纹夜蛾15天后的累积死亡率为93.33％，但初见死亡时间为3d，较BS\HL的初见死亡时间分别提前2d、1d，死亡时间每提前1d，将减少害虫对作物造成的损失，这在农业生产实践上是非常有意义的。

利用筛选出的曲霉属菌株(HY12)、孢霉菌属(BS)和枝孢属(HL)，对斜纹夜蛾的毒性测定数据进行毒力回归分析：以虫生真菌对斜纹夜蛾的累积死亡率的概率值为因变量(y)，处理浓度对数为自变量(x)，用多重线性回归方法建立各菌株的毒力回归线性模型，再利用此模型求得致死中浓度(LT₅₀)。其中利用筛选出的菌株做毒力测定试验，利用灭菌水处理后，观察斜纹夜蛾生长发育情况。结果如表2。

表2不同菌株对斜纹夜蛾的毒力测定结果

利用筛选出的曲霉属菌株(HY12)、孢霉菌属(BS)和枝孢属(HL)，分别接种斜纹夜蛾幼虫，统计从接种起到幼虫化蛹的时间，所化蛹的畸形率(12d)及蛹的死亡率(20d)，见表格3。

表3不同菌株对斜纹夜蛾的影响

斜纹夜蛾在接种曲霉属菌株(HY12)后在初期症状没有明显的差异，从第3d开始就开始有幼虫死亡，LT₅₀时间最短为8.14d，从接种第1d起，接种菌株HY12的试虫行动迟缓，提前进入蛹期，化蛹期间试虫畸形率最高，死亡率与其他两种菌相当，但是H12从感染到化蛹的时间缩短为5.73d,在生产实际中，极大地缩短了害虫对作物的为害时间，从而可以挽回部分产量上的损失。

实施例2

杂色曲霉HY12发酵液对烟草斜纹夜蛾的实验室防效评价

将实施例1得到的杂色曲霉HY12菌株进行鉴定，杂色曲霉HY12与曲霉属的多株真菌相似性较高，与Aspergillus versicolor相似性系数达到99％，根据rDNA ITS序列，再结合其形态学将菌株HY12鉴定为杂色曲霉真菌(Aspergillus versicolor)，其中杂色曲霉HY12(Aspergillus versicolor)的rDNA ITS区段大小约为500bp；SEQ ID NO.1。

将杂色曲霉HY12移于SDAY液体培养基中，30℃恒温培养30h制成菌株母液；用移液器取0.5mL菌株母液加入20mL灭菌后的SDAY液体培养基中，在30℃，200r/min摇床培养30h，制成杂色曲霉HY12发酵液，其中液体培养基为SDAY培养基，其中SDAY培养基包括以下组分，葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g和水1000mL。

将表1中的供试药剂稀释成试验倍数，各药剂处理的浓度详见表1。

表1供试药剂信息

本实施例中试验组为8组，同时设计清水为对照组，共9组；采用浸叶法进行试验，具体操作方法是：用镊子选取叶片面积大小相近的烟草叶片(未接触过任何农药)浸入各组药液8s后取出，用滤纸吸去多余的药液，稍微晾干后将叶片放入养虫笼内，每笼接入供试虫(斜纹夜蛾2龄幼虫)30头，标注相关信息后，置于室内条件(30±1℃，12L:12D)观察饲养，每组处理4次重复。接虫后，观察记录24h、48h、72h、96h、120h存活虫数，计算防治效果。

其中，校正防效(％)＝[1-(处理组药后活虫数×对照组药前活虫数)/(处理组药前活虫数×对照组药后活虫数)]×100

8种药剂对斜纹夜蛾2龄幼虫的室内毒力结果如表2所示。

表2供试药剂室内校正防效结果

由表2可知，化学药剂2％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂、200g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂、5％甲维盐乳油和4.5％高效氯氰菊酯水乳剂对斜纹夜蛾2龄幼虫药后120h的校正防效均达到95％以上，防治效果显著。生物农药的药后120h的校正防效较化学药剂的效果低，这与生物农药的防虫机制有一定的关系，其中10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂，120h后可达88.34％，而菌株HY12发酵液虽然在24-48h见效慢，但72h后，防效逐步跟上，到120h时，防效达70.25％，略低于8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂的防效。

实施例3

杂色曲霉HY12发酵液对烟草斜纹夜蛾的大田防效评价

大田防效评价试验在湖南省长沙市宁乡喻家坳烟草试验基地中进行，试验基地土壤肥力中等，地势平坦，排灌方便。供试药剂与具体处理详情见表1，清水为空白对照，采用完全随机排列，每小区面积为30m²，4次重复。于斜纹夜蛾幼虫盛发期喷药，施药时对照小区先进行，后为各药剂处理，常规喷雾，叶片正反面均匀喷湿，药前1d调查虫口基数，药后1、3、5、7d分别调查各处理的幼虫活虫数，调查时需要仔细检查叶片正反面活虫数。调查时采取3点取样法，每点固定调查5株，共15株，按照实施例2的计算方法，计算各处理组的防效，结果如表3。

表3供试药剂田间试验校正防效结果

其中，使用药剂后9d，化学药剂2％甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂校正防效达95.11％，其次是4.5％高效氯氰菊酯水乳剂、200g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂、5％甲维盐乳油。菌株HY12发酵液的防治效果达85.2％，和生物农药8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂和10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂的防效相当。

本发明提供了一种杂色曲霉HY12在制备防治烟草斜纹夜蛾的真菌杀虫菌剂中的应用，将杂色曲霉HY12的发酵物和农药学上可接受的分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种进行混合，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂的真菌杀虫菌剂，杂色曲霉HY12的发酵物可感染斜纹夜蛾使其提前进入蛹期，提高斜纹夜蛾化蛹期间的畸形率和死亡率，对斜纹夜蛾的繁衍具有一定的抑制作用，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，同时为利用环保健康的方法防治病虫害杀虫菌剂前期的施用推广，提供实验依据。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种杂色曲霉HY12菌株的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggctggcgcc cggccggccc taatcgagcg ggtgacaaag ccccatacgc tcgaggaccg 60

gacacggtgc cgccgctgcc ttttgggccc gtcccccggg ggggacgacg acccaacaca 120

caagccgggc ttgatgggca gcaatgacgc tcggacaggc atgccccccg gaatgccagg 180

gggcgcaatg tgcgttcaaa gactcgatga ttcactgaat tctgcaattc acattactta 240

tcgcagttcg ctgcgttctt catcgatgcc ggaaccaaga gatccattgt tgaaagtttt 300

gactgatttt atattcaaac tcaaactgca tcactctcag gcatgaagtt cagtagtccc 360

cggcggctcg cccccgagag ggctccccgc caaagcaaca gtgttaggta gtcacgggtg 420

ggaggttggg cgcccg 436

Claims (5)

1.一种杂色曲霉HY12在制备杀虫菌剂中的应用，其特征在于，所述杀虫菌剂为防治烟草斜纹夜蛾的真菌杀虫菌剂；所述菌株于2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：14790。

2.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉HY12在制备杀虫菌剂中的应用，其特征在于，所述杀虫菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。

3.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉HY12在制备杀虫菌剂中的应用，其特征在于，所述杀虫菌剂还包括农药学上可接受的辅料，所述辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的一种杂色曲霉HY12在制备杀虫菌剂中的应用，其特征在于，所述杀虫菌剂的制备方法为：

(1)将所述杂色曲霉HY12移于液体培养基中，28-30℃恒温培养28-35h，制成取菌株母液；

(2)取所述菌株母液与灭菌后的所述液体培养基按照1:40-45的体积比进行混合，在28-30℃，180-200r/min摇床培养28-35h，制成发酵液；

(3)将步骤(2)所述发酵液与所述辅料均匀混合即可。

5.根据权利要求4所述的一种杂色曲霉HY12在制备杀虫菌剂中的应用，其特征在于，所述液体培养基为SDAY培养基，其中所述SDAY培养基包括以下重量份数的组分，葡萄糖4份，蛋白胨1份，酵母浸出粉1份和水100份。