CN104212724B

CN104212724B - 一种球孢白僵菌菌株gzgy‑1‑3及其应用

Info

Publication number: CN104212724B
Application number: CN201410449467.4A
Authority: CN
Inventors: 王海鸿; 王登杰; 张桃; 李雪; 雷仲仁
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2014-09-01
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2034-09-01
Also published as: CN104212724A

Abstract

本发明涉及一种球孢白僵菌菌株(Beaueria bassaria(Balsamo)Vuillemin)GZGY‑1‑3，该菌株的培养方法，由该菌株制备的孢子粉，以及该孢子粉在制备生防制剂中的应用，所述生防制剂可用于烟粉虱、西花蓟马、葱蚜和/或桃蚜的防治。使用该生防制剂能对高温环境下的昆虫进行防治，且防治效果好，田间防治效果均高于75％。

Description

一种球孢白僵菌菌株GZGY-1-3及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种球孢白僵菌菌株GZGY-1-3及其在防治烟粉虱，西花蓟马，桃蚜和葱蚜上的应用。

背景技术

烟粉虱Bemisa tabaci(Gennadius)，西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergand)和桃蚜Myzus persicae(Sulzer)均是世界性的重要农业害虫，寄主包括蔬菜，花卉和烟草等多种经济作物。葱蚜Neotox optera formosana(Takahashi)是近年来我国葱、蒜和韭菜上为害逐年加重的害虫之一。这些害虫的共同特点通过刺吸或锉吸式口器取食植物汁液对作物造成严重的直接为害，更为严重的是，它们作为植物病毒病的传播媒介给温室和露地多种作物造成极大的经济损失。这些害虫的防治通常以化学防治为主，而它们对化学合成的杀虫剂抗性的发展引起人们对其它害虫防治策略的兴趣，其中微生物防治可能扮演着重要角色(Biological control of Bemisia tabaci with fungi.Faria M，Wraight SP.Crop Prot.2001.20：767-778.)。

在众多的微生物防治因子中，虫生真菌是防治具有刺吸式(或锉吸式)口器昆虫的最有前途的一种病原物，因为它具有直接穿透昆虫表皮侵染的独特作用方式(Biologicalcontrol of Bemisia tabaci with fungi.Faria M，Wraight SP.Crop Prot.2001.20：767-778.)。尽管有大量研究筛选出对这些害虫高毒力的真菌菌株，但是这些实验大多是在真菌的适宜温度下完成的。烟粉虱、葱蚜等均为喜温昆虫，在炎热的夏季种群发生达到最高峰；西花蓟马和桃蚜对高温的喜好和耐受能力虽然不如前两种昆虫，但它们在田间自然发生时的温度也经常超出了真菌的适宜温度范围。不利环境温度能降低真菌对于寄主昆虫的侵染效率(Selection of Beauveria bassiana isolates for control of thewhiteflies Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum on the basis of theirvirulence，thermal requirements，and toxicogenic activity.Quesada-Moraga E，Maranhao E.A.A et al.Biological Control.2006.36：274-287.)。以前的研究证明了同一种真菌的不同菌株间有着显著的耐热性差异(Cold activity of Beauveria andMetarhizium，and thermotolerance of Beauveria.Femandes E.K.K.，Rangel D.E.N.etal.Journal of Invertebrate Pathology.2008.98：69-78.对西花蓟马高效的球孢白僵菌菌株筛选及产孢特性研究[J].李银平，雷仲仁，王海鸿.中国生物防治学报.2013.29(2)：219-226.)。因此，为了将虫生真菌有效地应用到害虫的综合治理中，不仅要考虑它对靶标害虫的毒力，还要考虑它对于害虫发生栖境温度的适合度。此外，产孢量也是真菌能否大量生产和实际应用的重要考核指标。

发明内容

球孢白僵菌(Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin)是侵染许多种昆虫的常见的病原物，大量的研究证明有许多有效侵染烟粉虱、西花蓟马，桃蚜和葱蚜的菌株。为了能在高温环境下，例如大棚环境(其温度可高达42-46摄氏度)下有效防治靶标昆虫，以及将筛选出的菌株大量生产和应用。本申请进行了一系列实验，包括(a)筛选了21株不同地理位置和寄主来源的白僵菌菌株对靶标昆虫的致病性，(b)根据(a)的结果，比较了高致病性菌株的产孢量，(c)根据(a)和(b)的结果，检查了高致病性，高产孢量菌株的孢子对高温的耐受性。最终，我们筛选出了GZGY-1-3性状优良的菌株可以作为上述靶标昆虫的有效生防菌株。

因此，本申请提供一种球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin)菌株GZGY-1-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC No.9254，保藏日期为2014年5月28日，属于丛梗孢目，丛梗孢科，球孢白僵菌属。

本发明还提供一种上述菌株的培养方法。

优选的，所述培养方法包括以下步骤：

将球孢白僵菌GZGY-1-3接种于萨氏培养基SDAY上，所述萨氏培养基SDAY含有1％的蛋白胨、1％的酵母膏，4％的葡萄糖和2％的琼脂。优选的，培养条件为保持温度25-27℃，培养7-10d，生产出活化好的GZGY-1-3的孢子粉。

本发明还提供一种菌株GZGY-1-3的孢子粉，所述孢子粉由上述菌株GZGY-1-3经上述培养方法培养制备而成。

本发明还提供一种上述活化孢子粉在制备生防制剂中的应用。优选的，所述孢子粉和其他的杀虫剂联合应用。

本发明还提供一种制备生防制剂的方法。将上述孢子粉经过一级种子液培养、二级种子液培养、固相发酵和孢子粉的干燥和收获步骤制备而成。

优选的，所述步骤为以下步骤：

(1)一级种子液的培养

种取上述活化好的GZGY-1-3的孢子粉，接入萨氏培养液SDY得到种子液，所述萨氏培养液SDY含有1％的蛋白胨、1％的酵母膏，4％的葡萄糖，种子液的初始孢子浓度为1.0×10⁶个·ml^-1，在25℃、120r·min^-1条件下振荡培养48hr，得到一级种子液。

(2)二级种子液的培养

将一级种子液按5％的接种量接入萨氏培养液SDY培养液，在7升液体发酵罐中培养。加入发酵液体积的0.5％豆油，培养温度为25-27℃，转速为100-200rpm，初始溶氧量为50％以上。培养40hr后得到二级种子液。

(3)固相发酵

用开水浸泡大米30分钟，捞出控去多余水份，121℃灭菌30分钟后，按100g大米加入15ml二级种子液的比例接菌，发酵器具为20×30cm的塑料袋。接种后铺放于25-26℃的条件下培养7-10d。

(4)孢子粉的干燥和收获

固相发酵后的物料置于30℃下干燥3d，再用孢子收获机，例如MycoharvesterCompany，UK的收获机，收获孢子粉。

本发明还提供一种生防制剂，由上述方法制备而成。

本发明还提供一种上述生防制剂在防治靶标昆虫的应用，所述靶标昆虫为烟粉虱、西花蓟马、葱蚜和/或桃蚜。优选的所述昆虫生活在高温环境。更优选的，所述高温环境为42-46℃的大棚环境。

本发明还提供一种防治靶标昆虫的方法，所述方法包括向易感作物喷洒上述生防制剂，所述靶标昆虫为烟粉虱、西花蓟马、葱蚜和/或桃蚜。优选的所述昆虫生活在高温环境。更优选的，所述高温环境为42-46℃的大棚环境。

本发明筛选得到的菌株侵染率高，致病力强，对烟粉虱4龄若虫8天内的累积死亡率达到86.5％，致死中时LT₅₀为4.31天；对西花蓟马2日龄成虫8天内的累积死亡率达到84.3％，致死中时LT₅₀为4.17天；对葱蚜1日龄成虫5天内的累积死亡率达到95％，致死中时LT₅₀为2.75天；对桃蚜1日龄成虫5天内的累积死亡率达到91.7％，致死中时LT₅₀为2.93天；产孢量高，为3.87×10⁸个孢子/cm²；耐热性好，45℃处理2h后，GZGY-1-3的相对萌发率仍然高达60.6％。其各项综合指标表现良好，可以有效的防治烟粉虱、西花蓟马、葱蚜和桃蚜，尤其适合在大棚等高温环境下应用。

附图说明

图1：球孢白僵菌对烟粉虱4龄若虫8天的累计死亡率和致死中时LT₅₀(Mean±SE)

图2：不同球孢白僵菌菌株的产孢量

图3：不同菌株的耐热性比较

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，这些实例不能作为本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，所作的修改或替换均属于本发明的范围。若未特别指明，下述实施方案中的手段为本领域所熟知的常规手段。

实施例1筛选毒力高的菌株

1.1昆虫种群

烟粉虱于2013年从中国农业科学院廊坊科研基地的温室大棚中的烟草上采集，并在本试验室中用甘蓝苗饲养2-3代。甘蓝苗放在养虫笼(40×40×30cm)中，饲养条件为26±2℃，光周期为12∶12(L∶D)。为了使甘蓝叶片上有足够且均匀的烟粉虱若虫用于球孢白僵菌的毒力试验，试验时挑选高约25cm，长有5-6片嫩叶的甘蓝幼苗，置于养虫笼中，48h后取出并驱赶所有成虫，使每片叶片上约有100-150只卵。取出后的幼苗放入光照培养箱，条件为26±1℃、12∶12(L∶D)，待烟粉虱的卵发育成4龄若虫时剪下叶片待用。

西花蓟马最初于2006年从门头沟区碧坤蔬菜种植基地的茄子上采集，并在本试验室中用菜豆豆荚多代饲养。豆荚放在两端开口的玻璃筒中，两端用尼龙纱封口。饲养条件26±2℃，光周期为12∶12(L∶D)。其间不规律地从田间采集个数不等的个体放入本种群中，以防种群衰退。

葱蚜于2014年4月从北京市顺义区植保站实验基地的韭菜大棚中采集，然后在本实验室用韭菜饲养。饲养时，将育有韭菜的花盆置于养虫笼中(40×40×30cm)，然后将采集的葱蚜接种上。饲养条件为26℃、光周期12∶12(L∶D)。

桃蚜于2014年4月从中国农业科学院科研温室内的甘兰苗上采集，并在本试验室中用甘兰苗饲养。饲养条件26±2℃，光周期为12∶12(L∶D)。

1.2供试菌株

本试验所用菌株来源于全国各地被白僵菌天然侵染的昆虫上。采集的菌株经分离后接种于斜面培养基上并在4℃条件下储存于本试验室。

1.3菌株准备

从斜面上刮下分生孢子接种于SDA产孢培养基上，在26±1℃的黑暗条件下培养15天，然后用无菌的接种环将孢子从培养基上刮下，置于0.05％吐温-80溶液中配制成孢子悬浮液。试验前，用4层无菌的无纺布将悬浮液中的菌丝过滤掉，然后取20ml经高温灭菌的萌发液与少量孢子悬浮液混合，该萌发液含有0.05％吐温-80，1％酵母提取物，4％葡萄糖，放入50ml经高温高压灭菌的锥形瓶中。锥形瓶用封口膜封口，并在26±1℃，180r/min的摇床上培养18h。取一滴混合液于载玻片上，在400倍显微镜(OLYMPUS，BX51)下镜检，孢子萌发率大于90％的菌株方可用于试验。试验时，孢子悬浮液浓度通过血球计数板计算得出，高浓度的孢子悬浮液用0.05％的吐温-80溶液稀释到合适的浓度。

1.4球孢白僵菌毒力测定

烟粉虱毒力测定：本发明用刚蜕皮的4龄若虫测定不同菌株对烟粉虱的毒力。挑选单片含有100-150头烟粉虱4龄若虫的甘蓝叶片，立即浸入已配制好的1×10⁷个孢子/ml悬浮液中10s，然后取出叶片放在无菌的滤纸上20-30min自然晾干。对照组用0.05％的吐温-80做同样的处理。晾干后的叶片立即放入含有2％琼脂的培养皿(直径：90mm)中，培养皿用封口膜密封，放在26±1℃、12∶12(L∶D)的光照培养箱中培养。每个培养皿的相对湿度保持在100％左右。每天敞开培养皿盖20-30min，使内外气体交换，同时也阻止叶片上腐生真菌的生长。每天记录被感染的烟粉虱数(粉红或红色、有菌丝或孢子产生的尸体)，连续记录8天，计算每个菌株对烟粉虱的累积死亡率和致死中时LT₅₀。每个试验重复3次，试验采用随机区组设计，每株菌株的每次重复都用不同批次的4龄若虫和孢子进行试验。

对西花蓟马的毒力测定：本发明用2日龄西花蓟马成虫进行毒力测定。用软毛笔将蓟马挑到1×10⁷浓度的球孢白僵菌悬浮液中，5s后取出放到吸水纸上吸去残留的悬浮液，再转移到新鲜的菜豆豆荚上，豆荚放入培养皿中(直径90cm)。培养皿在26℃，光周期12∶12(L∶D)条件下培养。对照组用0.05％的吐温-80溶液按上述方法进行同样的处理。每天记录蓟马的死亡情况，连续记录8天。每个实验重复3次，每个重复测试20只蓟马。最后计算每株菌株的累积死亡率和致死中时LT₅₀。

对葱蚜和桃蚜的毒力测定：本发明采用浸渍法对供试蚜虫进行生测。用湿润的毛笔轻轻将蚜虫挑到无菌的尼龙纱布上，然后将纱布浸入至1×10⁷浓度的球孢白僵菌悬浮液中，5s后取出纱布，用吸水纸吸去残留的悬浮液。处理后的葱蚜和桃蚜分别移至刚剪下的新鲜的韭菜苗和甘兰苗上，然后将韭菜苗和甘兰苗分别放入培养皿中(直径90cm)。培养皿事先已加入2％的琼脂并覆盖上一层无菌的滤纸用于保湿。培养皿在26℃，光周期12∶12(L∶D)条件下培养。对照组用0.05％的吐温-80溶液按上述方法进行同样的处理。每天将培养皿盖敞开20-30min，使内外气体交换，防治腐生真菌的生长。每天记录蚜虫的死亡情况，连续记录5天。每个实验重复3次，每个重复测试20只蚜虫。最后计算每株菌株的累积死亡率和致死中时LT₅₀。

1.5结果

球孢白僵菌侵染昆虫引起的累积死亡率、致死中时LT₅₀用SAS 9.2(SAS，2008)进行差异显著性分析，采用Duncan’s新复极差法进行平均数之间的多重比较。其中，LT₅₀由POLO软件计算得到，而累积死亡率数据在分析前应进行反正弦平方根代换，使其符合正态分布和方差齐次性。

用于生测试验的21株球孢白僵菌对靶标昆虫的毒力有所不同，对烟粉虱的毒力结果见图1，不同菌株之间导致试虫死亡的累积死亡率和致死速度都有显著性的差异。其中GZGY-1-3菌株对烟粉虱4龄若虫8天内的累积死亡率达到86.5％，致死中时LT₅₀为4.31天；对西花蓟马2日龄成虫8天内的累积死亡率达到84.3％，致死中时LT₅₀为4.17天；对葱蚜1日龄成虫5天内的累积死亡率达到95％，致死中时LT₅₀为2.75天；对桃蚜1日龄成虫5天内的累积死亡率达到91.7％，致死中时LT₅₀为2.93天。其他结果未显示。

其中包括GZGY-1-3菌株在内，共12株球孢白僵菌对烟粉虱累积死亡率在70％以上，且LT₅₀＜5天，用于后续实验。

实施例2筛选产孢量高的菌株

2.1菌株培养

将上述实施例1筛选出的12株高毒力菌株孢子用0.05％吐温-80溶液配制成1×10⁶分生孢子/ml的悬浮液。取0.1ml悬浮液于90mm的SDAY培养基上，用无菌的三角玻璃棒涂布均匀。每个菌株重复4次。培养基在26±1℃黑暗下培养15天，用直径4mm的无菌打孔器在培养基随机取5个点放入5ml 0.05％吐温-80溶液中。悬浮液在超声波清洗器中进行声处理15min，破坏孢子块结构，然后用漩涡振荡仪振荡10min，获得均匀分散的孢子悬浮液。悬浮液稀释10倍后用血球计数板测定孢子个数，每个重复计数3次，然后计算每平方厘米的孢子个数。

2.2结果

菌株的产孢量用SAS 9.2(SAS，2008)进行差异显著性分析，采用Duncan’s新复极差法进行平均数之间的多重比较。

图2为12株白僵菌产孢量的结果。从图中可以看出，12株白僵菌的产孢量范围在2.3×10⁸～3.9×10⁸个孢子/cm²之间，且有显著性差异。其中，产孢量大于3.0×10⁸的菌株有6株，分别为DZDC-9、HLJ-19、HLJTL-31、HLJTL-35、NMTL-16、GZGY-1-3。其中GZGY-1-3的产孢量为3.87×10⁸个孢子/cm²。

实施例3筛选热耐受性的菌株

3.1筛选热耐受性的菌株

本实施例参照Everton K.K et al(2008)的方法。挑选上述实施例2中对烟粉虱高毒力的6株菌株，接种于SDA培养基上，在26±1℃黑暗条件下培养15天。将收获的孢子与0.05％的吐温-80溶液配制成悬浮液，悬浮液剧烈振荡并过滤，然后稀释至10⁵个孢子/mi。取2ml悬浮液于5ml离心管中，立即放入45±0.1℃的水浴锅中。热激1h或2h后，取20μl滴在4mlSDAY培养基中央，该SDAY培养基为SDA培养基中加入1％的酵母提取物，培养皿直径为35mm，SDAY培养基事先已高温灭菌且含有浓度为0.002％(w/v)、有效成分25％的苯菌灵。低浓度的苯菌灵不会影响孢子的萌发，但是会抑制芽管的生长，因此可以长时间观察孢子的萌发。培养基在26±1℃的黑暗条件下培养48h，然后在培养基中央处滴一滴甲基蓝染料(13mg甲基蓝固体溶于1ml 85％的乳酸溶液中)，盖上盖玻片，在400倍显微镜下观察孢子的萌发情况。孢子的萌发率通过计数至少300个孢子的萌发情况来计算。对照孢子不经任何热处理，但是仍在含有苯菌灵的SDAY培养基上26±1℃黑暗中培养，24h后观察萌发情况。

3.2结果

孢子的萌发率通过计数至少300个孢子的萌发情况来计算。热激后存活的孢子要经过很长一段时间才能恢复活力，重新启动萌发程序，因此，没有经过处理的孢子只需培养24h就能观察其萌发情况，而热激后的孢子要培养48h才能计数。

孢子萌发率用SAS 9.2(SAS，2008)进行差异显著性分析，采用Duncan’s新复极差法进行平均数之间的多重比较。孢子萌发率数据在分析前应进行反正弦平方根代换，使其符合正态分布和方差齐次性。

对上述6株菌株进行耐热性测试结果显示随着高温处理时间的增加，菌株的萌发率逐渐降低。正常情况下，各菌株的萌发率均大于90％；45℃处理1h后，菌株的萌发受到抑制，此时各菌株的相对萌发率显著下降，但仍较高；45℃处理2h后，相对萌发率进一步降低，此时仅有GZGY-1-3的相对萌发率仍然高达60.6％，而其他菌株均低于60％(参见图3)。

实施例4：制备包含菌株GZGY-1-3的生防制剂

(1)一级种子液的培养

种取活化好的菌株GZGY-1-3的孢子粉，加入到接入萨氏培养液SDY得到种子液，，所述萨氏培养液SDY含有1％的蛋白胨、1％的酵母膏，4％的葡萄糖，种子液的初始孢子浓度为1.0×10⁶个·ml^-1，在25℃、120r·min^-1条件下振荡培养48hr，得到一级种子液。

(2)二级种子液的培养

将一级种子液按5％的接种量接入萨氏培养液SDY培养液，在7升液体发酵罐中培养。加入发酵液体积的0.5％豆油，培养温度为25-27，转速为100-200rpm，初始溶氧量为50％以上。培养40hr后得到二级种子液。

(3)固相发酵

(4)孢子粉的干燥和收获

固相发酵后的物料置于30℃下干燥3d，再用孢子收获机收获孢子粉。

实施例5：田间防治效果：

在北京市昌平区的蔬菜生产基地，利用上述生防制剂制成1×10⁷个孢子/ml的悬浮液，加入0.05％吐温-80。对蔬菜叶面进行喷洒，进行防治烟粉虱的田间试验，对烟粉虱，西花蓟马，桃蚜和葱蚜的田间防效到达75％以上。

Claims

1.一种球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin)菌株GZGY-1-3，其特征在于，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC No.9254，保藏日期为2014年5月28日，属于丛梗孢目，丛梗孢科，球孢白僵菌属。

2.权利要求1的球孢白僵菌菌株GZGY-1-3的培养方法，其特征在于，将菌株GZGY-1-3接种于萨氏培养基SDAY上进行培养，所述萨氏培养基SDAY含有1％的蛋白胨、1％的酵母膏，4％的葡萄糖和2％的琼脂。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法将球孢白僵菌GZGY-1-3接种于萨氏培养基SDAY上，保持温度25-27℃，培养7-10d，生产出活化好的GZGY-1-3的孢子粉。

4.一种菌株GZGY-1-3的孢子粉，其特征在于，所述孢子粉由权利要求2-3任意培养方法培养制备而成。

5.权利要求4的孢子粉在制备生防制剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述孢子粉和其他的杀虫剂联合应用。

7.一种包含菌株GZGY-1-3的生防制剂的制备方法，其特征在于，将权利要求4的孢子粉经过一级种子液培养、二级种子液培养、固相发酵和孢子粉的干燥和收获步骤制备而成。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤为以下步骤：

(1)一级种子液的培养

取活化好的GZGY-1-3的孢子粉，接入萨氏培养液SDY得到种子液，所述萨氏培养液SDY含有1％的蛋白胨、1％的酵母膏，4％的葡萄糖，种子液的初始孢子浓度为1.0×10⁶个·ml^-1，在25℃、120r·min^-1条件下振荡培养48hr，得到一级种子液；

(2)二级种子液的培养

将一级种子液按5％的接种量接入萨氏培养液SDY培养液，在7升液体发酵罐中培养，加入发酵液体积的0.5％豆油，培养温度为25-27℃，转速为100-200rpm，初始溶氧量为50％以上，培养40hr后得到二级种子液；

(3)固相发酵

用开水浸泡大米30分钟，捞出控去多余水份，121℃灭菌30分钟后，按100g大米加入15ml二级种子液的比例接菌，发酵器具为20×30cm的塑料袋，接种后铺放于25-26℃的条件下培养7-10d；

(4)孢子粉的干燥和收获

9.一种生防制剂，所述生防制剂由权利要求7-8任意方法制备而成。

10.权利要求9所述生防制剂在防治靶标昆虫的应用，所述靶标昆虫为烟粉虱、西花蓟马、葱蚜和/或桃蚜。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述昆虫生活在高温环境。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述高温环境为42-46℃的大棚环境。

13.一种防治靶标昆虫的方法，所述方法包括向易感作物喷洒权利要求9所述生防制剂，所述靶标昆虫为烟粉虱、西花蓟马、葱蚜和/或桃蚜。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述昆虫生活在高温环境。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述高温环境为42-46℃的大棚环境。