CN106947728A - 昆虫病原真菌分生孢子收集工艺 - Google Patents

昆虫病原真菌分生孢子收集工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，将昆虫病原真菌菌种接种于萨氏液体培养基上，经培养得到昆虫病原真菌液体菌种；再将所得液体菌种接种于大米培养基或麦麸培养基上培育至产孢成熟；将含有成熟产孢的培养基与植物油或矿物油混合后，在3‑30℃的工艺温度中搅拌均匀得到分散体系；将所得分散体系置于120‑150um的筛网上过滤，所得滤液经真空除水后，再经离心过滤或筛选过滤后收取分生孢子油膏。本发明在特定的温度（3‑30℃）下搅拌后结合筛选工艺收集的分生孢子油膏，既能够避免分生孢子受潮，又可以直接用来制备粉剂、悬浮剂等农药产品。

Description

昆虫病原真菌分生孢子收集工艺
技术领域
本发明涉及分生孢子的收集工艺，用于白僵菌、绿僵菌等昆虫病原真菌分生孢子的收集。
背景技术
白僵菌属半知菌纲、链孢霉目、链孢霉科、真菌科，绿僵菌属子囊菌门、肉座菌目、麦角菌科、真菌科，白僵菌和绿僵菌是最具代表性的昆虫病原真菌。
昆虫病原真菌广泛寄生于蛴螬、家蝇、介壳虫、白粉虱、蚜虫、蓟马、马铃薯叶甲、蜚蠊、蝗虫、蚱蜢、蟋蟀、棉铃象、棉跳盲蝽、玉米螟、天牛、甘蔗金龟子等昆虫体内，且能够使昆虫致病至死，其致病原理是：昆虫病原真菌在无性繁殖过程中产生的分生孢子(也称之为孢子)侵入昆虫(寄主)体内后，通过在昆虫(寄主)体内不断生长和繁殖来消耗昆虫(寄主)的营养，并释放毒素，进而使昆虫(寄主)发病至死。由于这种方式致病性强，致病机理复杂，且能够有针对性的杀死目标昆虫，因此，农业上常用昆虫病原真菌分生孢子来制备真菌杀虫剂。目前，主要采用分筛法或旋风收集法收集昆虫病原真菌分生孢子并得到孢子粉，采用这两种方法容易导致昆虫病原真菌分生孢子四处飞散，进而影响操作区域空气质量，甚至危害人员健康。此外，孢子粉需要储存于干燥的环境中，保存不便。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种昆虫病原真菌分生孢子收集工艺。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，包括昆虫病原真菌分生孢子培养和收集步骤；
所述昆虫病原真菌分生孢子培养为：将昆虫病原真菌菌种接种于萨氏液体培养基培养后得到昆虫病原真菌液体菌种；再将所得液体菌种接种于灭菌后的大米培养基或麦麸培养基上发酵至产孢成熟；
所述昆虫病原真菌分生孢子收集为：将含有成熟产孢的培养基与植物油或矿物油混合，于3-30℃的工艺温度下搅拌均匀，得到分散体系；将所得分散体系过滤后进行真空除水，再经离心筛选或过滤筛选后收取分生孢子油膏。
上述技术方案将植物油或矿物油与含成熟产孢的培养基混合，在特定的温度(3-30℃)下搅拌后结合过滤工艺收取分生孢子油膏，解决了分生孢子在收集过程在容易飞散的问题，极大程度避免了分生孢子污染操作区域的空气和危害操作人员健康，在真菌杀虫剂的工业生产中具有极大的应用价值。
优选地，所述植物油为大豆油、菜籽油、棕榈油的一种或几种组合。
优选地，所述植物油或矿物油含量为含有成熟产孢的培养基重量的1-5倍。
为进一步解决昆虫病原真菌分生孢子在收集过程中易飞散的问题，在大米培养基或麦麸培养基与植物油或矿物油混合后的搅拌过程中，工艺温度控制为10-23℃；优选地，在大米培养基与植物油或矿物油混合后的搅拌过程中，工艺温度控制为15-23℃。
优选地，将大米培养基或麦麸培养基与植物油或矿物油混合后，采用三叶浆式搅拌器或螺旋式搅拌器进行搅拌；其中，搅拌速度控制为5-30rpm(转/分钟)，搅拌时间控制为5-10分钟。
为更进一步解决昆虫病原真菌分生孢子在收集过程中易飞散的问题，将昆虫病原真菌菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，于25-27℃条件下培养3-4天，得到昆虫病原真菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基上，并置于25-27℃条件下发酵13-15天，至产孢成熟；将含有成熟产孢的大米培养基与大豆色拉油按照重量比＝1:1-1:5混合后，于15-23℃的工艺温度下搅拌均匀，得到分散体系；将前述分散体系置于120-150um的筛网上过滤，并将所得滤液先用真空干燥机除水后，再用1-5μm的筛网过滤后收取分生孢子油膏。
本发明昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，将含有植物油或矿物油与含成熟产孢的培养基混合，在特定的温度(3-30℃)下搅拌后结合过滤工艺收取分生孢子油膏，解决了分生孢子在收集过程在容易飞散的问题，极大程度避免了分生孢子污染操作区域的空气和危害操作人员的健康，在真菌杀虫剂的工业生产中具有极大的应用价值。
与现有技术相比，本发明还提高了分生孢子的活孢率、纯度和回收率，采用本发明收集到的昆虫病原真菌分生孢子的活孢率非常高，且回收率明显提高；经测试，本发明收集的分生孢子的活孢率可达99.4％(较旋风收集法提高8.2-10.9％)，其纯度较分筛法提高13.2-26.2％，本发明收集的分生孢子的回收率可达98.7％(较旋风收集法、分筛法提高6.4-9.7％)。此外，本发明收集的昆虫病原真菌分生孢子的活性好，能够增强的杀虫效果。
本发明收集的昆虫病原真菌分生孢子直接储存于油膏中，既能够避免分生孢子受潮，方便保存，又可以直接用来制备粉剂、悬浮剂等农药产品。
本发明昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，所用设备简单，生产工艺简单，工序少，在常压下即可完成分生孢子的收集，同时能提高收集率，节约能源和成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，在此指出以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域普通技术人员根据本发明的内容作出一些非本质的改进和调整，均在本发明保护范围内。除特殊说明外，本发明中所述分数均为重量份，所述百分比均为重量百分比；本发明中所述原料均是本领域普通技术人员知晓的市售产品，其中，萨氏液体培养基为上海冠导生物工程有限公司生产的1/4SDAY培养基(1/4指的是培养基的强度)；本发明所用菌种由重庆大学基因工程中心提供；本发明中所述分筛法采用的设备为卓美机械ZM600-1800型振荡分筛机，筛网可按孔径要求替换；本发明中所述旋风收孢机为流能LNC-180A型旋风收孢机，収孢温度可按要求控制。
实施例1：
绿僵菌分生孢子培养，将金龟子绿僵菌CQMa421菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在26℃条件下培养3天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基(将大米在26℃的自来水中浸泡4小时后沥干，将其灭菌后冷却至室温制得大米培养基)上，将大米培养基置于26℃条件下发酵15天，至产孢成熟。绿僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的大米培养基与大豆色拉油按照重量比＝1：2.5混合后(含成熟产孢的大米培养基100Kg，大豆色拉油250Kg)，在15℃的工艺温度下，以20rpm的转速搅拌10分钟得到分散体系；将前述分散体系置于120um的筛网中过滤，并将所得滤液先用真空干燥机除水，再用筛网规格为5μm的过滤机过滤后收取分生孢子油膏。该分生孢子油膏直接加入大豆油、矿物油或棕榈油中分散，即可得到绿僵菌油悬浮剂。
实施例2：
绿僵菌分生孢子培养，将金龟子绿僵菌CQMa102菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在27℃条件下培养4天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基(将大米在27℃的自来水中浸泡4小时后沥干，将其灭菌后冷却至室温制得大米培养基)上，将大米培养基置于27℃条件下发酵15天，至产孢成熟。绿僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的大米培养基与大豆色拉油按照重量比＝1：4混合后(含成熟产孢的大米培养基100Kg，大豆色拉油400Kg)，在17℃的工艺温度下，以20rpm的转速搅拌10分钟得到分散体系；将前述分散体系置于150um的筛网中过滤，并将所得滤液先用真空干燥机除水，再用卧式螺旋离心机离心后收取分生孢子油膏。
实施例3：
白僵菌分生孢子培养，将球孢白僵菌CQBb101菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在25℃条件下培养3天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的麦麸培养基(将麦麸与自来水按照重量比＝2:1混合后拌匀，再经灭菌后冷却至室温制得麦麸培养基)上，将麦麸培养基置于25℃条件下发酵15天，至产孢成熟。白僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的麦麸培养基与菜籽油按照重量比＝1：5混合后(含成熟产孢的大米培养基100Kg，菜籽油500Kg)，在10℃的工艺温度下，以5rpm的转速搅拌10分钟得到分散体系；将前述分散体系置于120um的筛网中过滤，并将所得滤液先用真空干燥机除水，再用筛网规格为5μm的过滤机过滤后收取分生孢子油膏。该分生孢子油膏直接加入大豆油、矿物油或棕榈油分散后，再加入5％(重量比)的脂肪醇聚氧乙烯醚，即可配制成白僵菌可分散悬浮剂。
实施例4：
白僵菌分生孢子培养，将球孢白僵菌CQBb223菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在27℃条件下培养4天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的麦麸培养基(将麦麸与自来水按照重量比＝2:1混合后拌匀，再经灭菌后冷却至室温制得麦麸培养基)上，将麦麸培养基置于27℃条件下发酵20天，至产孢成熟。白僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的麦麸培养基与菜籽油按照重量比＝1：3混合后(含成熟产孢的大米培养基100Kg，菜籽油300Kg)，在23℃的工艺温度下，以30rpm的转速搅拌5分钟得到分散体系；将前述分散体系置于150um的筛网中过滤，并将所得滤液先用真空干燥机除水，再用卧式螺旋离心机离心后收取分生孢子油膏。
实施例5：
绿僵菌分生孢子培养，将金龟子绿僵菌CQMa421菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在25℃条件下培养3天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基(将大米在25℃的自来水中浸泡4小时后沥干，将其灭菌后冷却至室温制得大米培养基)上，将大米培养基置于25℃条件下发酵10天，至产孢成熟。绿僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的大米培养基与混合物油(大豆油与棕榈油混合所得的油)按照重量比＝1：1混合后(含成熟产孢的大米培养基100Kg，大豆油50Kg，棕榈油50Kg)，在3℃的工艺温度下，以5rpm的转速搅拌5分钟得到分散体系；将前述分散体系置于120um的筛网中过滤，并将所得滤液先用真空干燥机除水，再用筛网规格为1μm的过滤机过滤后收取分生孢子油膏。
实施例6：
绿僵菌分生孢子培养，将金龟子绿僵菌CQMa421菌种接种于1/4强度的萨氏液体培养基上，在27℃条件下培养4天，得到金龟子绿僵菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基(将大米在27℃的自来水中浸泡4小时后沥干，将其灭菌后冷却至室温制得大米培养基)上，将大米培养基置于27℃条件下发酵20天，至产孢成熟。绿僵菌分生孢子收集，将含有成熟产孢的大米培养基与矿物油按照重量比＝1：4混合后(含成熟产孢的大米培养基100Kg，矿物油400Kg)，在30℃的工艺温度下，以30rpm的转速搅拌10分钟得到分散体系；将前述分散体系置于150um的筛网中过滤，并将所得滤液先用真空干燥机除水，再用卧式螺旋离心机离心后收取分生孢子油膏。
对比实施例1：
采用分筛法收集孢子粉，参照实施例1中绿僵菌分生孢子培养步骤，制备成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基置于干燥室(温度30℃，湿度≤30％)内干燥2天后，先用120目的振荡筛收集孢子粉，再用震荡分筛机(卓美机械ZM600-1800型分筛机，筛网规格为149μm)收集孢子粉，经低温干燥后得到含水量为4％的孢子粉。
对比实施例2：
采用旋风收集法收集孢子粉，参照实施例1中绿僵菌分生孢子培养步骤，制备成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基置于干燥室(温度30℃，湿度≤30％)干燥2天后，用旋风收孢机(流能LNC-180A型旋风收孢机，収孢温度设为40-50℃)收集孢子粉，经低温干燥后得到含水量为4％的孢子粉。
对比实施例3：
参照实施例2中绿僵菌分生孢子培养步骤，制备成熟产孢，先用150目的振荡筛收集孢子粉，再用震荡分筛机(卓美机械ZM600-1800型分筛机，筛网规格为149μm)收集孢子粉，经低温干燥后得到含水量为5％的孢子粉。
对比实施例4：
参照实施例2中绿僵菌分生孢子培养步骤，制备成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基用旋风收集器(旋风收集法)收集孢子粉，经低温干燥后得到含水量为5％的孢子粉。
对比实施例5：
参照实施例3中白僵菌分生孢子培养步骤，制备成熟产孢，先用120目的振荡筛收集孢子粉，再用震荡分筛机(卓美机械ZM600-1800型分筛机，筛网规格为74μm)收集孢子粉，经低温干燥后得到含水量为4％的孢子粉。
对比实施例6：
参照实施例3中白僵菌分生孢子培养步骤，制备成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基用旋风收集器(旋风收集法)收集孢子粉，经低温干燥后得到含水量为4％的孢子粉。
对比实施例7：
参照实施例4中白僵菌分生孢子培养步骤，制备成熟产孢，先用150目的振荡筛收集孢子粉，再用震荡分筛机(卓美机械ZM600-1800型分筛机，筛网规格为5μm)收集孢子粉，经低温干燥后得到含水量为4％的孢子粉。
对比实施例8：
参照实施例4中白僵菌分生孢子培养步骤，制备成熟产孢，将含有成熟产孢的培养基用旋风收集器(旋风收集法)收集孢子粉，经低温干燥后得到含水量为5％的孢子粉。
孢子飞散情况测试：
选择3m*3m*2m的密闭实验空间，用除尘器清理干净实验空间内的灰尘后在实验空间内均匀放置4台LZJ-01D型粒子计数器。将实施例1中含有成熟产孢的大米培养基置于该实验空间中收集分生孢子，待收集完毕后的第30分钟读取粒子计数器上的数据(该数据反应分生孢子的飞散情况，数值越大说明分生孢子越容易飞散)，结果见表1。参照上述方法，在同样的环境条件下分别测量实施例2-6，对比实施例1-8中分生孢子的飞散情况，结果见表1；
表1昆虫病原真菌分生孢子飞散情况
由表1可知，在本发明实施例1-6收集分生孢子的过程中，粒子计数器上的平均值为15-22，而对比实施例1-8收集分生孢子的过程中，粒子计数器上的平均值为5198.5-5822.3，显著高于本发明的平均值，充分说明采用本发明收集昆虫病原菌分生孢子，收集过程中分生孢子飞散量非常小。
纯度与活孢率测试：
纯度与活孢率测试：纯度测定，先分别称取实施例1中收集到的分生孢子油膏，对比实施例1、对比实施例2中收集到的孢子粉，分别用大豆色拉油分散至80亿孢子/毫升的悬浮液，然后分别取5ml悬浮液离心5分钟后倒弃上清油，再倒于滤纸上过滤，5分钟后分别称离心管中的沉淀重量，并计算沉淀中的含孢量(含孢量＝400亿孢子/沉淀重量)，结果见表2；活孢率测定，分别称取实施例1中收集到的分生孢子油膏，对比实施例1、对比实施例2中收集到的孢子粉，分别用煤油稀释并配制成106个孢子/毫升的孢悬液，均匀涂在1/4SDAY平板培养基(蛋白胨0.25％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖1.0％、琼脂1.8％)上，于26℃条件下保湿培养30h后置于显微镜下统计萌发的孢子数与未萌发的孢子数，计算萌发率(即活孢率)，结果见表2。
参照上述含孢量与活孢率的测试方法，分别测定实施例2-4中和对比实施例3-8的含孢量(含孢量用来表征干孢粉的纯度，含孢量越高表明其纯度较高)与活孢率，结果见表2。比较实施例1与对比实施例1可得其含孢量增率((实施例1含孢量-对比实施例1含孢量)/对比实施例1含孢量)，结果见表2；比较实施例1与对比实施例2可得其活孢率增率((实施例1含活孢率-对比实施例2活孢率)/对比实施例2活孢率)，结果见表2；其它实施例增率同上；
表2昆虫病原真菌分生孢子的纯度与活孢率
实施例 含孢量108/g 活孢率(％)
实施例1 189 98.6
实施例2 231 99.4
实施例3 490 99.2
实施例4 521 98.9
对比实施例1 167 98.4
对比实施例2 185 90.3
对比实施例3 183 99.3
对比实施例4 238 89.6
对比实施例5 429 99.2
对比实施例6 485 91.7
对比实施例7 457 98.6
对比实施例8 535 90.9
从表2可以看出：采用本发明收集的分生孢子的纯度明显高于采用分筛法(对比实施例1、3、5、7)收集的分生孢子的纯度，增率为13.2％-26.2％；采用本发明收集的分生孢子油膏的分生孢子的活孢率可达99.4％，明显高于采用旋风收集法(对比实施例2、4、6、8)收集的分生孢子的活孢率90.2-92.7％，增率达到8.2-10.9％。
回收率测试：
测试依据，昆虫病原真菌分生孢子的回收率＝(分生孢子油膏重量×分生孢子油膏含孢量)/(分生孢子收集前培养基×分生孢子收集前培养基含孢量)×100％。分别测量对比实施例1中分生孢子收集前培养基重量和培养基上的含孢量，收集后的分生孢子油膏重量，分生孢子油膏的含孢量，按照上述公式计算回收率，结果见表3。分生孢子的含孢量测定：称取物料1.0g，置于200ml烧杯中，然后新鲜没有50mL后振荡至孢子分散，得到悬浮液，再吸取1.0mL悬浮液，用新鲜没有稀释后，采用血球计数板在显微镜下测定孢子数，结果见表3。分别测定对比实施例2-8中收集前培养基物料和收集后孢子粉重量和含孢量，结果见表3；
表3昆虫病原真菌分生孢子的回收率
从表3可以看出，采用本发明收集的昆虫病原真菌分生孢子的回收率在98％以上，明显高于分筛法和旋风收集法的回收率(88.6-91.9％)，表明其回收率很高。

Claims (7)

1.一种昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，包括昆虫病原真菌分生孢子培养和收集步骤，其特征在于：
所述昆虫病原真菌分生孢子培养为：将昆虫病原真菌菌种接种于萨氏液体培养基培养后得到昆虫病原真菌液体菌种；再将所得液体菌种接种于灭菌后的大米培养基或麦麸培养基上发酵至产孢成熟；
所述昆虫病原真菌分生孢子收集为：将含有成熟产孢的培养基与植物油或矿物油混合，于3-30℃的工艺温度下搅拌均匀，得到分散体系；将所得分散体系过滤后进行真空除水，再经离心筛选或过滤筛选后收取分生孢子油膏。
2.根据权利要求1所述的昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，其特征在于：所述植物油为大豆油、菜籽油、棕榈油的一种或几种组合。
3.根据权利要求1或2所述的昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，其特征在于：所述植物油或矿物油含量为含有成熟产孢的培养基重量的1-5倍。
4.根据权利要求3所述的昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，其特征在于：在大米培养基或麦麸培养基与植物油或矿物油混合后的搅拌过程中，工艺温度控制为10-23℃。
5.根据权利要求3所述的昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，其特征在于：在大米培养基与植物油或矿物油混合后的搅拌过程中，工艺温度控制为15-23℃。
6.根据权利要求4所述的昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，其特征在于：将大米培养基或麦麸培养基与植物油或矿物油混合后，采用三叶浆式搅拌器或螺旋式搅拌器进行搅拌；其中，搅拌速度控制为5-30rpm，搅拌时间控制为5-10分钟。
7.根据权利要求1所述的昆虫病原真菌分生孢子收集工艺，其特征在于：将昆虫病原真菌菌种接种于1/4 强度的萨氏液体培养基上，在25-27℃条件下培养3-4天，得到昆虫病原真菌液体菌种；将前述液体菌种接种于灭菌后的大米培养基上，并置于25-27℃条件下发酵13-15天，至产孢成熟；将含有成熟产孢的大米培养基与大豆色拉油按照重量比=1:1-1:5混合后，于15-23℃的工艺温度下搅拌均匀，得到分散体系；将前述分散体系置于120-150um的筛网上过滤，并将所得滤液先用真空干燥机除水后，再用1-5μm的筛网过滤后收取分生孢子油膏。
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