CN111548944B - 一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和应用。一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基，由包括以下质量份的原料制备得到：大米1～3份、大豆1～2份和补充料1～2份；所述补充料包括乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油，所述乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油的质量比为(10～20):(4～8):(16～32):(8～16):(5～10)。采用本发明提供的培养基得到的莱氏绿僵菌的产孢量得到大幅度提高，产孢周期短，孢子萌发率达到95％以上，且成本低。

Description

一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和应用。
背景技术
现阶段，害虫对作物的危害是造成农业减产的重大因素之一。化学农药的长期大量使用在杀灭害虫的同时也带来了农产品药残超标，害虫抗性水平逐年上升，污染环境等一系列的副作用。鉴于此，生物防治被人们日益重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是害虫生物防治的重要手段之一。与其他杀虫微生物相比，杀虫真菌具有易流行，对环境友好，不易产生抗药性等优点，在害虫的生物防治中占有重要地位。
莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)是一种在我国分布广泛的昆虫病原真菌，可侵染多种鳞翅目害虫，尤其对甜菜夜蛾、大豆夜蛾、斜纹夜蛾、草地贪夜蛾等夜蛾科害虫的侵染力极高，具有较高的开发利用价值。
目前，培养莱氏绿僵菌最常用的培养基为萨斯麦芽糖-酵母培养基和马铃薯培养基，但仍存在产孢率低、孢子萌发率低、产孢周期长和成本高等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和应用，采用本发明提供的培养基得到的莱氏绿僵菌的产孢量得到大幅度提高，产孢周期短，孢子萌发率达到95％以上，且成本低。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基，由包括以下质量份的原料制备得到：大米1～3份、大豆1～2份和补充料1～2份；
所述补充料包括乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油，所述乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油的质量比为(10～20):(4～8):(16～32):(8～16):(5～10)。
优选的，所述大豆为大豆粉，所述大豆粉的粒径为50～100目。
本发明还提供了上述固体发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述大米经水浸泡后晾干，得到处理大米；
(2)将所述步骤(1)得到的处理大米与大豆、补充料混合后，得到混合物，将所述混合物灭菌，得到固体发酵培养基。
优选的，所述步骤(2)灭菌为蒸汽灭菌，所述蒸汽灭菌的温度为121～125℃，所述蒸汽灭菌的时间为25～30min。
本发明还提供了上述固体发酵培养基在制备莱氏绿僵菌孢子中的应用。
优选的，所述应用包括以下步骤：
a、将莱氏绿僵菌接种至分生孢子培养基中培养，得到分生孢子；
b、将所述步骤a得到的分生孢子接种于权利要求1所述的固体发酵培养基中进行预发酵，得到预发酵料；
c、将所述步骤b得到的预发酵料在光照下发酵3～5天，得到莱氏绿僵菌孢子。
优选的，所述步骤a中将莱氏绿僵菌接种至分生孢子培养基中培养，得到培养料，用吐温-80溶液将培养料上的分生孢子洗下，得到分生孢子接种液，将所述分生孢子接种液接种于权利要求1所述的固体发酵培养基中，所述分生孢子接种液的接种量为5～15％。
优选的，所述步骤b中预发酵的温度为25～30℃，所述预发酵的环境湿度为60～80％。
优选的，将所述预发酵料在光照下发酵3～5天，得到发酵料后还包括：将所述发酵料干燥、过150～200目筛后，得到莱氏绿僵菌孢子粉。
优选的，所述干燥包括第一干燥和第二干燥；所述第一干燥的温度为30～45℃；所述第一干燥的时间为24～36h；所述第二干燥的温度为25～40℃；所述第二个干燥的时间为24～36h。
本发明提供了一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基，由包括以下质量份的原料制备得到：大米1～3份、大豆1～2份和补充料1～2份；所述补充料包括乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油，所述乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油的质量比为(10～20):(4～8):(16～32):(8～16):(5～10)。在本发明中，大米为莱氏绿僵菌的生长提供了主要的碳源，由于大米属于固体颗粒，使得固体发酵培养基不仅具有透气作用，为莱氏绿僵菌的发酵提供了充足的氧气，达到促进莱氏绿僵菌产孢的技术效果，还具有粘附大豆粉和补充料的作用，进一步促进大米、大豆粉和补充料的协同的作用；大豆粉为莱氏绿僵菌的生长提供了主要的氮源；补充料作为补充碳源和氮源，保证了莱氏绿僵菌生长所需的营养。采用本发明提供的固体发酵培养基不仅可以大幅度增加莱氏绿僵菌的产孢量，每克固体发酵培养基可以生产8.4×109个以上的孢子，还缩短了莱氏绿僵菌的产孢周期，采用本发明提供的固体发酵培养基培养周期为7天；而且采用本发明提供的固体发酵培养基的得到的孢子粉的萌发率可达95％以上；同时本发明提供的固体发酵培养基的原料价格低量，降低了培养成本。
并且，本发明使用大米作为原料，可以增加培养基的透气性，使莱氏绿僵菌可以自由生长至培养基的各个角落，在整个培养过程中无需人工翻料，省工省时。
此外，本发明还提供了一种促进真菌产孢的固体发酵培养基的制备方法，该加工方法简单易行，可以广泛应用于工业生产。
另外的，本发明还提供了一种促进真菌产孢的固体发酵培养基在莱氏绿僵菌产孢上的应用。
附图说明
图1为实施例1的产孢量；
图2为对比例1的产孢量；
图3为对比例2的产孢量；
图4为对比例3的产孢量。
具体实施方式
本发明提供了一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基，由包括以下质量份的原料制备得到：大米1～3份、大豆1～2份和补充料1～2份；所述补充料包括乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油，所述乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油的质量比为(10～20):(4～8):(16～32):(8～16):(5～10)。
本发明提供的固体发酵培养基包括质量份数为1～3份的大米。在本发明中，大米为莱氏绿僵菌的生长提供了主要的碳源，由于大米属于固体颗粒，使得固体发酵培养基不仅具有透气作用，为莱氏绿僵菌的发酵提供了充足的氧气，达到促进莱氏绿僵菌产孢的技术效果，还具有粘附大豆和补充料的作用，进一步促进大米、大豆粉和补充料的协同的作用。
本发明提供的固体发酵培养基包括质量分数为1～2份的大豆。在本发明中，所述大豆优选为大豆粉，所述大豆粉的粒径优选为50～100目。在本发明中，大豆粉为莱氏绿僵菌的生长提供了主要的氮源。
本发明提供的固体发酵培养基包括质量份数为1～2份的补充料。在本发明中，所述补充料包括乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油，所述乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油的质量比为(10～20):(4～8):(16～32):(8～16):(5～10)。在本发明中，补充料作为补充碳源和氮源，保证了莱氏绿僵菌生长所需的营养。
本发明还提供了上述技术方案所述促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述大米经水浸泡后晾干，得到处理大米；
(2)将所述步骤(1)得到的处理大米与大豆、补充料混合后，得到混合物，将所述混合物灭菌，得到固体发酵培养基。
本发明将大米经水浸泡后晾干，得到处理大米。本发明中，所述水的温度优选为90～100℃，更优选为95～100℃；所述浸泡时间优选为30～40min，更优选为33～38min。在本发明中，将大米经水浸泡后晾干后还优选包括过滤；所述过滤的方式优选为纱布过滤；所述纱布的孔隙优选为16～20目。本发明中对晾干的具体方式没有任何特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的常规方式即可。
得到处理大米后，本发明将处理大米与大豆、补充料混合后，得到混合物，将所述混合物灭菌，得到固体发酵培养基。在本发明中，所述灭菌优选为蒸汽灭菌，所述蒸汽灭菌的温度优选为121～125℃；所述蒸汽灭菌的时间优选为25～30min，更优选为26～28min。本发明对混合的具体方式没有任何特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的常规方式即可。
本发明还提供上述的促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基在制备莱氏绿僵菌孢子中的应用；所述应用优选包括以下步骤：
a、将莱氏绿僵菌接种至分生孢子培养基中培养，得到分生孢子；
b、将所述步骤a得到的分生孢子接种于上述技术方案所述的固体发酵培养基中进行预发酵，得到预发酵料；
c、将所述步骤b得到的预发酵料在光照下发酵3～5天，得到莱氏绿僵菌孢子。
在本发明中，将莱氏绿僵菌接种至分生孢子培养基中培养，得到分生孢子。本发明将莱氏绿僵菌接种至分生孢子培养基中培养，得到培养料，用吐温-80溶液将培养料上的分生孢子洗下，得到分生孢子接种液将所述分生孢子接种液接种于上述技术方案所述的固体发酵培养基中，所述分生孢子培养基优选为SMAY培养基；所述分生孢子接种液的接种量优选为5～15％，更优选为8～12％，最优选为10％；所述接种液中分生孢子的含量优选为5×105～5×108个/mL，更优选为5×107个/mL；所述吐温-80的质量浓度优选为0.02～0.05。在本发明中，采用吐温-80能使孢子更好的粘附在虫体表面。
得到分生孢子后，本发明将分生孢子接种于上述技术方案所述的固体发酵培养基中进行预发酵，得到预发酵料。在本发明中，所述预发酵时间优选为2～4d，更优选为3d；所述预发酵的温度优选为25～30℃，更优选为26～28℃；所述预发酵的湿度优选为60～80％，更优选为70～75％。在本发明中，通过预发酵获得更多的菌丝，进而保障莱氏绿僵菌的产孢量。
得到预发酵料后，本发明将所述预发酵料在光照下发酵3～5天，得到莱氏绿僵菌孢子；所述光照的强度优选为60000～100000lx，更优选为70000～90000lx。在本发明中，将发酵料放置光下发酵的目的在于通过光照进一步诱导莱氏绿僵菌产孢。
本发明将预发酵料在光照下发酵3～5天，得到发酵料后优选还包括：将所述发酵料干燥、过150～200目筛后，得到莱氏绿僵菌孢子粉；所述干燥优选包括第一干燥和第二干燥；所述第一干燥优选在鼓风干燥箱中进行；所述第一干燥的温度优选为30～45℃，更优选为35～40℃；所述第一干燥的时间优选为24～36h，更优选为28～32h；所述第二干燥优选在烘箱中进行；所述第二干燥的温度优选为25～40℃，更有选为30～35℃；所述第二个干燥的时间优选为24～36h，更有选为28～30h。在本发明中，采用干燥和过筛，使得孢子粉与固体发酵培养基完全分开，减少人工费用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
备料：大米100g、大豆粉100g和补充料43g，所述大豆粉的粒径为50目；
所述补充料包括乳糖10g、葡萄糖4g、酵母粉16g、硝酸钾8g和花生油5g。
按照以下步骤进行制备固体发酵培养基：
先称取100g大米置于大烧杯中，加入100℃水浸泡30min，洗净，用16目(缝隙)的纱布过滤，晾干表面水分。再称取100g大豆粉加入，拌入43g补充料，混合均匀后，等量分装于直径15cm、长30cm的保鲜袋中，121℃蒸汽灭菌30min，冷却后备用。
按照以下步骤进行应用：
(1)分生孢子液培养阶段
将莱氏绿僵菌接种至固体SMAY培养基(麦芽糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，琼脂18g/L)中培养，置于28℃光照培养箱培养(16L/8D，光暗交替)，培养7天后长出分生孢子，在超净工作台上用经过灭菌的质量体积为0.02％的吐温-80溶液将培养料上的分生孢子洗下，转移到灭菌的玻璃的三角瓶中，震荡10分钟，使孢子分散均匀，获得分生孢子液；
(2)发酵培养阶段
在超净工作台上，用移液枪按10％的莱氏绿僵菌接种量接种至装有固体发酵培养基、直径为15cm的培养皿中，置于温度28℃，湿度75％的恒温恒湿培养箱中培养，发酵3天后，将培养皿取出，在超净工作台中将固体发酵培养基中的米粒打散，移至100000lx进行继续培养，培养4天产孢完成，即培养出大量产孢的莱氏绿僵菌。
(3)孢子粉制备阶段
将发酵后的固体发酵培养皿盖揭去，换用烘干的报纸覆盖，在35℃鼓风干燥箱中干燥36h后取出，然后在摇床上过200目筛，使孢子粉与大米基质分开，收集莱氏绿僵菌所产生的孢子，将所收集的孢子放入烘箱中干燥，温度30℃下干燥24h取出，即制备出莱氏绿僵菌孢子粉。
实施例2
按质量份备料：大米100g、大豆粉100g和补充料50g，所述大豆粉的粒径为50目；
所述补充料包括乳糖10g、葡萄糖6g、酵母粉16g、硝酸钾8g和花生油10g。
按照以下步骤进行制备固体发酵培养基：
先称取100g大米置于大烧杯中，加入100℃水浸泡30min，洗净，用16目(缝隙)的纱布过滤，晾干表面水分。再称取100g大豆粉加入，拌入50g补充料，混合均匀后，等量分装于直径15cm、长30cm的保鲜袋中，121℃蒸汽灭菌30min，冷却后备用。
按照以下步骤进行应用：
(1)分生孢子液培养阶段
将莱氏绿僵菌接种至固体SMAY培养基(麦芽糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，琼脂18g/L)中培养，置于28℃光照培养箱培养(16L/8D，光暗交替)，培养7天后长出分生孢子，在超净工作台上用经过灭菌的质量体积为0.02％的吐温-80溶液将培养料上的分生孢子洗下，转移到灭菌的玻璃的三角瓶中，震荡10分钟，使孢子分散均匀，获得分生孢子液；
(2)发酵培养阶段
在超净工作台上，用移液枪按10％的莱氏绿僵菌接种量接种至装有固体发酵培养基、直径为15cm的培养皿中，置于温度28℃，湿度75％的恒温恒湿培养箱中培养，发酵3天后，将培养皿取出，在超净工作台中将固体发酵培养基中的米粒打散，移至100000lx进行继续培养，培养4天产孢完成，即培养出大量产孢的莱氏绿僵菌。
(3)孢子粉制备阶段
将发酵后的固体发酵培养皿盖揭去，换用烘干的报纸覆盖，在35℃鼓风干燥箱中干燥36h后取出，然后在摇床上过200目筛，使孢子粉与大米基质分开，收集莱氏绿僵菌所产生的孢子，将所收集的孢子放入烘箱中干燥，温度30℃下干燥24h取出，即制备出莱氏绿僵菌孢子粉。
对比例1
本对比例与实施例1不同的是无添加大米，其他工艺操作同实施例1。
对比例2
本对比例与实施例1不同的是无添加补充料，其他工艺操作同实施例1。
对比例3
本对比例与实施例1不同的是无添加大豆粉，其他工艺操作同实施例1。
对比例4
本实施例与实施例1不同的是固体发酵培养条件为温度28℃，湿度75％，黑暗培养，其他工艺操作同实施例1。
对实施例1～2、对比例1～4中产孢量、菌丝生长、产包周期及孢子粉萌发率进行调查，具体操作为：用电子天平精确称取粗菌粉0.1g，将其在盛有30mL水的烧杯中稀释，用移液管吸取0.2mL菌液放入装有100mL的烧杯中，在震荡器上充分混匀，借助血球计数板和显微镜求出每克菌粉的含孢量。每克菌粉含孢量＝平均每小格孢子数×4×106×稀释倍数/称取克数，结果如表1所示。
表1实施例1～2、对比例1～4中产孢量、菌丝生长、产孢周期及孢子粉萌发率调查数据
Figure BDA0002526489350000081
Figure BDA0002526489350000091
由图1～图4的实施例1、对比例1、对比例2及对比例3的产孢量可知，采用本发明提供的固体发酵培养基莱氏绿僵菌产孢量大，而其他培养基产孢量极少甚至无孢子产生。
由表1可知，采用本发明提供的固体发酵培养基的产孢量高达8.40×109个/g，而其他培养基的产孢量为0.00～0.03×109个/g；采用本发明提供的固体发酵培养基产孢周期为7d，相较于对比例的培养基缩短了3～5d；同时采用本发明提供的固体发酵培养基所得的孢子粉的萌发率高达95％以上，而对比例提供的培养基的萌发率仅为80％左右。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (6)

1.一种固体发酵培养基在促进莱氏绿僵菌产分生孢子中的应用，所述应用包括以下步骤组成：
a、将莱氏绿僵菌接种至分生孢子培养基中培养，得到分生孢子；
b、将所述步骤a得到的分生孢子接种于固体发酵培养基中进行预发酵，得到预发酵料；
c、将所述步骤b得到的预发酵料在光照下发酵3~5天，得到莱氏绿僵菌孢子；
所述固体发酵培养基由以下质量份的原料制备得到：
大米1~3份、大豆粉1~2份和补充料1~2份；
所述补充料为乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油，所述乳糖、葡萄糖、酵母粉、硝酸钾和花生油的质量比为（10~20）:（4~8）:（16~32）:（8~16）:（5~10）；
所述大豆粉的粒径为50~100目；
所述预发酵的温度为25~30℃，所述预发酵的环境湿度为60~80％；
所述光照的强度为60000~100000lx。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的固体发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
（1）将所述大米经水浸泡后晾干，得到处理大米；
（2）将所述步骤（1）得到的处理大米与大豆粉、补充料混合后，得到混合物，将所述混合物灭菌，得到固体发酵培养基。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）灭菌为蒸汽灭菌，所述蒸汽灭菌的温度为121~125℃，所述蒸汽灭菌的时间为25~30min。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤a中将莱氏绿僵菌接种至分生孢子培养基中培养，得到培养料，用吐温-80溶液将培养料上的分生孢子洗下，得到分生孢子接种液；所述步骤b中将所述分生孢子接种液接种于所述的固体发酵培养基中，所述分生孢子接种液的接种量为5~15％。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，将所述预发酵料在光照下发酵3~5天，得到发酵料后还包括：将所述发酵料干燥、过150~200目筛后，得到莱氏绿僵菌孢子粉。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述干燥包括第一干燥和第二干燥；所述第一干燥的温度为30~45℃；所述第一干燥的时间为24~36h；所述第二干燥的温度为25~40℃；所述第二个干燥的时间为24~36h。
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