CN103865810A - 一种茶叶下脚料培养金花菌粉的方法 - Google Patents
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Abstract
一种茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其步骤如下：（1）从茯砖茶中筛选金花菌菌种；（2）制备改良PDA发酵液，无菌操作接种金花菌，培养；（3）制备成金花菌孢子接种液；（4）将茶叶下脚料粉碎，制成培养基质；（5）将金花菌孢子接种液置消毒喷壶内；（6）完成营养生长，促进闭囊壳产生；（7）发酵；（8）基质干燥，筛分，获得纯度较高的金花菌粉。本发明发酵步骤一次性完成；对设备要求较低，同时减少了杂菌的污染；降低了杂菌污染概率；成本较低，提高了生长面积，菌粉产率较高。
Description
技术领域
本发明涉及菌种培养技术领域，具体涉及一种茶叶下脚料培养金花菌粉的方法。
背景技术
金花菌学名为冠突散囊菌（Eurotium cristarum），主要存在于黑茶中的茯砖茶内，是我国制茶行业唯一二级机密保护菌种，其在茶叶上生长产生的闭囊壳堆积成肉眼可见的金黄色颗粒，人工将其筛分出来即为金花菌粉，简称为金花。近年来大量研究资料表明金花菌粉对高血压、高血脂、糖尿病等疾病具备良好的保健效果，并有提高机体免疫力的作用。
随着金花菌保健功效的发掘，对其产品的开发成为了时下研究的热点，这就需要大量的金花菌粉作为研究材料。金花菌生长条件较为苛刻，对氧气、湿度、培养基质均有严格的要求，往往只在发酵良好的茯砖茶内部有少量存在，因此从茯砖茶中大量收集金花菌粉的方案是不现实的。而通过常规培养基（如PDA、CZG）培养的金花菌粉，却不具备茶叶内所筛分金花菌粉的品质（菌花香较低、颜色较暗淡）。
中国专利（申请号：201210470477.7）提供了一种茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法，但该专利申请存在下述不足：
（1）使用250mL/500mL锥形瓶作为培养容器、麸皮平铺厚度为1.0～1.3cm，一次培养获得的曲种较少；
（2）首先需发酵培养获得曲种，再以发酵完成的曲种扩大培养，所有操作均需在无菌条件下进行，发酵容器外需包裹8层纱布，且0~36h时还需加盖透气封口膜，其操作较为繁琐，不适宜大批量生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：解决现有茯砖茶金花菌粉产率低的问题，而提供一种茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，产率可达到等重量茯砖茶的6倍以上，对金花保健产品的研发具有重要意义。
本发明采用的技术方案是：
一种茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其步骤如下：
（1）从茯砖茶中筛选金花菌菌种；
（2）制备改良PDA发酵液，无菌操作接种金花菌，28℃培养6d；
（3）将发酵液瓶180rpm振荡20min，使金花菌孢子与菌丝分离，之后用双层无菌纱布过滤除去菌丝，制成金花菌孢子接种液；
（4）将茶叶下脚料粉碎，加入茶叶下脚料重量30％左右自来水充分混匀成培养基质，将基质平铺在不锈钢方盘发酵容器内，调节厚度为2.5cm～3.5 cm，盖上玻璃盖，100℃烘1h，冷却24h后重复烘1h；
（5）将金花菌孢子接种液置消毒喷壶内，均匀喷洒到冷却的培养基质表面，1kg基质用接种液15~20mL，盖上玻璃盖，67℃预烘1h；
（6）将容器取出置于28℃环境下持续发酵3d，待白色菌丝遍布基质表面并开始转黄时，即完成营养生长，此时提高室温为30~32℃并加强室内空气流通，以促进闭囊壳产生；
（7）发酵6d时取下玻璃盖，拌匀发酵底物，控温为38~42℃干燥；
（8）待基质充分干燥后，100目电动筛重复筛分两次，获得纯度较高的金花菌粉。
上述技术方案中，所述步骤（1）从茯砖茶中筛选金花菌菌种，金花菌菌种从湖南益阳茶厂有限公司08年产金湘益牌茯砖茶中分离纯化获得，经广东微生物研究所鉴定为冠突散囊菌。
上述技术方案中，所述步骤（2）制备改良PDA发酵液，每升培养基使用200g马铃薯、50g蔗糖，方法为将去皮切碎的马铃薯置适量水中煮烂，双层纱布滤去马铃薯渣，滤液加入蔗糖并搅拌溶解，定容至1000mL，分装三角瓶灭菌。
上述技术方案中，所述步骤（3）中金花菌孢子接种液，其具体制备方法为，待改良PDA发酵液灭菌冷却后，无菌操作接入金花菌，28℃静置培养6d至产生大量的金花菌菌体，将三角瓶置摇瓶机上180rpm振荡20min使金花菌孢子与菌丝分离，之后用双层纱布过滤去除菌丝，即获得金花菌孢子接种液；所述的金花菌孢子接种液，通过涂布平板法测定孢子含量＞108个/mL。
上述技术方案中，所述步骤（4）中所述的发酵容器为不锈钢方盘（500cm×350cm×4.5cm），容器盖为面积略大于方盘的玻璃，以便于在发酵过程中观察，玻璃盖上后应无明显空隙。使用时将培养基质放在方盘内摊平，厚度不超过3.5cm，每盘约可容纳基质500g。该容器盖上玻璃后为半封闭状态，可有效控制培养基质内的水分缓慢散发，培养基质前期湿度较大利于菌丝生长，后期湿度降低则可促使耐干燥的闭囊壳产生。玻璃盖与方盘之间的缝隙有利于空气交换，满足了金花菌对氧气的需求，同时外界霉菌孢子也不易透过缝隙对基质造成污染，正确操作下每盘培养基质杂菌污染面积≤2cm2。
上述技术方案中，所述步骤（5）中67℃预烘1h是金花菌发酵前的关键步骤，通过实验可知，金花菌孢子在67℃条件下可存活2~3h，67℃预烘1h即可有效杀死接种过程中所污染的杂菌，并且不对金花菌孢子的活性造成影响，使本工艺对环境要求较低，无需使用无菌操作间等设施。
上述技术方案中，所述步骤（6）菌丝开始转黄并产生少量闭囊壳时，应及时升温以促进闭囊壳产生。
上述技术方案中，所述步骤（7）所述的发酵6d时基质应布满金花菌闭囊壳且颗粒饱满丰富，干燥过程中温度不应超过42℃，此过程可进一步促使金花菌闭囊壳产生。
上述技术方案中，所述步骤（8）产品金花菌粉为金黄色粉末状，轻嗅有菌花香，在潮湿处易结块且颜色加深，置于密封清洁容器干燥处保存。
本发明和现有的专利与文献相比，具备以下显著优点：
（1）由孢子悬液直接接种至培养基质，发酵步骤一次性完成；
（2）对设备要求较低，全过程中除接种液制备外均不需要无菌环境；
（3）利用改良发酵容器，发酵量较大，半封闭式发酵满足了金花菌生长所需的氧气与湿度，同时减少了杂菌的污染；
（4）接种之后控温预烘，杀死杂菌而保存了金花菌孢子活力，进一步降低了杂菌污染概率；
（5）利用茶叶下脚料作为培养基质，成本较低，所产金花菌粉与茯茶内金花菌粉品质一致（培养基质化学成分相似）；
（6）培养基质经粉碎，提高了生长面积，菌粉产率较高，每公斤茶叶渣可收获纯金花菌粉50g以上（传统工艺从粉碎茯砖茶内提取金花菌粉的产率为0.6％~0.8％）。
附图说明
图1为金花菌菌种CZG培养基生长7d照片；
图2为金花菌孢子接种液照片；
图3为黑茶下脚料培养金花6d照片；
图4为二次过筛的金花照片；
图5为不同预烘温度与发酵状况之间的关系表；
图6为本发明工艺流程图。
具体实施方式
从茯砖茶中筛选金花菌菌种，金花菌的分离纯化：金花菌来源为湖南省益阳茶厂有限公司08年产金湘益牌茯砖茶。具体分离纯化步骤为：用镊子取茯砖茶砖心处长有金花的茶叶10g，加入到装有90mL无菌水的三角瓶内，盖上无菌封口膜，置摇床上180rpm振摇20min，制成10-2倍样品稀释液，梯度稀释至10-6，取1mL稀释液涂布于CZG平板上，28℃培养5~6d，用接种针挑取长势较好的金花菌菌落进行划线分离，重复划线2~3次后获得纯培养金花菌菌种。
纯培养的金花菌菌种见附图1。
金花菌孢子接种液的制作：马铃薯200g洗净去皮，加1000mL水煮沸20min后过滤，滤液加入50g蔗糖，搅拌至溶解后，分装灭菌。接种金花菌，28℃培养6d后，置于摇瓶机上180rpm振摇20min，双层无菌纱布过滤即为金花菌孢子接种液。
金花菌孢子接种液见附图2。
培养基质制备：将茶叶下脚料用植物粉碎机粉碎，称量1000g加入300g自来水，搅拌均匀后平铺到不锈钢方盘内，厚度调节为2.5cm左右，最厚处不超过3.5cm，基质无需压紧，盖上玻璃盖并确认四周无孔隙。将准备好的方盘放入烘箱，调节温度为100℃维持1h，冷却24h后，重复升温至100℃维持1h，取出冷却备用。
接种与培养：将金花菌孢子接种液倒入用70％酒精消过毒的喷壶内，揭开玻璃盖，将接种液均匀喷洒到冷却的培养基质上。盖上玻璃盖，将方盘置烘箱67℃烘1h，取出置于28℃环境下发酵3d，待白色的营养菌丝长满基质表明并开始转黄时，将室温升高至30~32℃，并每日打开门窗透气半小时，以促进子囊果大量产生。
不同预烘温度与发酵状况之间的关系见附表图5。
干燥与金花收集：发酵6d左右，此时金花布满了培养基质，将玻璃盖揭去，拌匀基质，提高室温为38℃~42℃，48h左右即可干燥充分，将干燥基质置于100目电动振摇筛中振摇3min，便将大部分金花筛下，再次过100目筛即获得纯度较高的金花，用自封袋将金花包装好放置在阴凉干燥处储存。
发酵6d的培养基质见附图3。
二次过筛的金花见附图。
Claims (9)
1.一种茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）从茯砖茶中筛选金花菌菌种；
（2）制备改良PDA发酵液，无菌操作接种金花菌，28℃培养6d；
（3）将发酵液瓶180rpm振荡20min，使金花菌孢子与菌丝分离，之后用双层无菌纱布过滤除去菌丝，制成金花菌孢子接种液；
（4）将茶叶下脚料粉碎，加入茶叶下脚料重量30％左右自来水充分混匀成培养基质，将基质平铺在不锈钢方盘发酵容器内，调节厚度为2.5cm～3.5 cm，盖上玻璃盖，100℃烘1h，冷却24h后重复烘1h；
（5）将金花菌孢子接种液置消毒喷壶内，均匀喷洒到冷却的培养基质表面，1kg基质用接种液15～20mL，盖上玻璃盖，67℃预烘1h；
（6）将容器取出置于28℃环境下持续发酵3d，待白色菌丝遍布基质表面并开始转黄时，即完成营养生长，此时提高室温为30～32℃并加强室内空气流通，以促进闭囊壳产生；
（7）发酵6d时取下玻璃盖，拌匀发酵底物，控温为38～42℃干燥；
（8）待基质充分干燥后，100目电动筛重复筛分两次，获得纯度较高的金花菌粉。
2.根据权利要求1所述茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其特征在于，所述步骤（1）从茯砖茶中筛选金花菌菌种，金花菌菌种从湖南益阳茶厂有限公司08年产金湘益牌茯砖茶中分离纯化获得，经广东微生物研究所鉴定为冠突散囊菌。
3.根据权利要求1所述茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其特征在于，所述步骤（2）制备改良PDA发酵液，每升培养基使用200g马铃薯、50g蔗糖，方法为将去皮切碎的马铃薯置适量水中煮烂，双层纱布滤去马铃薯渣，滤液加入蔗糖并搅拌溶解，定容至1000mL，分装三角瓶灭菌。
4.根据权利要求1所述茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其特征在于，所述步骤（3）中金花菌孢子接种液，其具体制备方法为，待改良PDA发酵液灭菌冷却后，无菌操作接入金花菌，28℃静置培养6d至产生大量的金花菌菌体，将三角瓶置摇瓶机上180rpm振荡20min使金花菌孢子与菌丝分离，之后用双层纱布过滤去除菌丝，即获得金花菌孢子接种液；所述的金花菌孢子接种液，通过涂布平板法测定孢子含量＞108个/mL。
5.根据权利要求1所述茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述的发酵容器为不锈钢方盘（500cm×350cm×4.5cm），容器盖为面积略大于方盘的玻璃，以便于在发酵过程中观察，玻璃盖上后应无明显空隙；使用时将培养基质放在方盘内摊平，厚度不超过3.5cm，每盘约可容纳基质500g；该容器盖上玻璃后为半封闭状态，可有效控制培养基质内的水分缓慢散发，培养基质前期湿度较大利于菌丝生长，后期湿度降低则可促使耐干燥的闭囊壳产生；玻璃盖与方盘之间的缝隙有利于空气交换，满足了金花菌对氧气的需求，同时外界霉菌孢子也不易透过缝隙对基质造成污染，正确操作下每盘培养基质杂菌污染面积≤2cm2。
6.根据权利要求1所述茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其特征在于，所述步骤（5）中67℃预烘1h是金花菌发酵前的关键步骤，通过实验可知，金花菌孢子在67℃条件下可存活2~3h，67℃预烘1h即可有效杀死接种过程中所污染的杂菌，并且不对金花菌孢子的活性造成影响，使本工艺对环境要求较低，无需使用无菌操作间等设施。
7.根据权利要求1所述茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其特征在于，所述步骤（6）菌丝开始转黄并产生少量闭囊壳时，应及时升温以促进闭囊壳产生。
8.根据权利要求1所述茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其特征在于，所述步骤（7）所述的发酵6d时基质应布满金花菌闭囊壳且颗粒饱满丰富，干燥过程中温度不应超过42℃，此过程可进一步促使金花菌闭囊壳产生。
9.根据权利要求1所述茶叶下脚料培养金花菌粉的方法，其特征在于，所述步骤（8）产品金花菌粉为金黄色粉末状，轻嗅有菌花香，在潮湿处易结块且颜色加深，置于密封清洁容器干燥处保存。
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