CN102120964A

CN102120964A - 冠突散囊菌孢子悬液制备方法

Info

Publication number: CN102120964A
Application number: CN2010105988673A
Authority: CN
Inventors: 赵运林; 刘石泉
Original assignee: Hunan City University
Current assignee: Hunan City University
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2011-07-13

Abstract

一种冠突散囊菌孢子悬液制备方法，其特征在于：这种冠突散囊菌孢子悬液制备方法，其步骤为：1)冠突散囊菌的培养；2)冠突散囊菌液体培养基的制备；3)冠突散囊菌孢子的培养；4)冠突散囊菌孢子的分散；5)冠突散囊菌孢子的过滤；6)冠突散囊菌孢子的浓度确定；7)冠突散囊菌孢子的保存。本发明冠突散囊菌孢子悬液浓度较高，而且金花孢子颗粒均匀，色泽鲜艳，颗粒肥大，能在短期10天内制备冠突散囊孢子悬液，完全能满足茯砖茶接种金花菌的需要，质量稳定可靠。

Description

冠突散囊菌孢子悬液制备方法

技术领域：

本发明涉及农产品加工技术领域，具体涉及茯砖茶优势菌冠突散囊菌俗称金花的孢子悬液培养条件及制备方法。

背景技术

一直以来，茯砖茶是作为边疆少数民族日常生活中不可或缺的必备品，在边疆享有“宁可三日无粮，不可一日无茶”的美誉，其奥妙与茯砖茶的品质风味是不可分割的。发花是形成茯砖茶独特品质风味的关键工艺，其目的是通过对外界条件(如温、湿度等)的控制促使茯砖茶中的优势菌种——冠突散囊菌生长繁殖，从而使茯砖茶具备独特的品质风味。该菌俗称金花，历来边疆少数民族通过判断金花质量和数量来衡量茯砖茶的品质优劣。

茯砖茶因具有独特的金花菌以及品质风味而闻名，边疆少数民族更是将金花视为衡量茯砖茶品质的标志，金花菌慢慢便成为人们研究的焦点。实验资料表明茯砖茶在原料这一阶段茶叶上几乎没有金花菌生长或是没有得到较好的生长。茯砖茶的加工制造过程中微生物分离鉴定也表明主要存在有薛氏曲霉、黑曲霉、栖上曲霉印度变种、娄地青霉、草酸青霉、淡紫青霉、黑青霉、绿色木霉等霉菌。很显然冠突散囊菌的大量生长繁殖形成优势菌群、产生大量孢子需要一定量的维持，一旦进入茯砖的发花工艺，如果预先存在金花菌，又如果得到适宜的外界生存条件，则能够大量生长繁殖形成优势菌，为茯砖茶独特品质风味的形成奠定基础。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：解决上述现有技术存在的问题，而提供一种冠突散囊菌孢子悬液制备方法，使冠突散囊菌孢子悬液浓度较高，而且金花孢子颗粒均匀，色泽鲜艳，颗粒肥大，完全能满足茯砖茶接种金花菌的需要，质量稳定可靠。

本发明采用的技术方案是：这种冠突散囊菌孢子悬液制备方法，其步骤为：

1)冠突散囊菌的培养；

2)冠突散囊菌液体培养基的制备；

3)冠突散囊菌孢子的培养；

4)冠突散囊菌孢子的分散；

5)冠突散囊菌孢子的过滤；

6)冠突散囊菌孢子的浓度确定；

7)冠突散囊菌孢子的保存。

上述技术方案中，所述步骤具体参数如下：

1)冠突散囊菌的培养：用添加10％茶汁的PDA琼脂固体培养基培养；

2)冠突散囊菌液体培养基的制备：用添加10％茶汁、20％蔗糖、10％NaCl的PDA液体培养基；

3)冠突散囊菌孢子的培养：培养条件为28℃、静置培养5-7天；后期升高温度为30-32℃，静置培养2-3天；

4)冠突散囊菌孢子的分散：用震荡摇床在30℃、280rpm分散1小时；

5)冠突散囊菌孢子的过滤：用双层无菌纱布过滤；

6)冠突散囊菌孢子悬液的浓度确定：用722型分光光度计测量其OD，控制在0.6-0.8左右，OD值即吸光值；

7)冠突散囊菌孢子悬液的保存：保存于4℃冰箱中。

上述技术方案中，茶汁的制备方法是：按质量比，茶水比1∶30，100℃水浴浸提2小时，双层纱布过滤备用。

上述技术方案中，PDA琼脂固体培养基指将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块放入烧杯中，加适量蒸馏水，煮沸1小时，稍冷后用双层纱布过滤，在滤液中加入15g琼脂，加热熔化，最后加入蔗糖20g，混匀，用量筒定容至1000mL，趁热分装在三角瓶中，在1.1kg/cm²(121℃)中保持20分钟灭菌。

上述技术方案中，PDA液体培养基指上述培养基配制过程操作，但不添加琼脂。即：将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块放入烧杯中，加适量蒸馏水，煮沸1小时，稍冷后用双层纱布过滤，最后加入蔗糖20g，混匀，用量筒定容至1000mL，趁热分装在三角瓶中，在1.1kg/cm²(121℃)中保持20分钟灭菌。

上述技术方案中，PDA即Potato Dextrose Agar的简称，中文含义为：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。本发明能在短期内(10天)制备冠突散囊菌孢子浓度较高的悬液，其浓度可以达到10⁸-10⁹个/mL，而且金花孢子颗粒均匀、色泽鲜艳金黄、颗粒肥大，完全能满足茯砖茶接种金花菌的需要，质量稳定可靠。事实上，冠突散囊菌的大量生长繁殖形成优势菌群、产生大量孢子需要一定量的维持，一旦进入茯砖茶的发花工艺，如果预先存在金花菌，又如果得到适宜的外界生存条件，则能够大量生长繁殖形成优势菌，为茯砖茶独特品质风味的形成奠定基础。我们的实验证明金花菌孢子悬液的接种应用于茯砖茶的发花工艺，对发花时间、发花质量都有着显著的影响。

附图说明：

图1为冠突散囊菌的培养10天照片；

图2为冠突散囊菌的孢子悬液培养7天照片；

图3为冠突散囊菌的孢子悬液培养10天照片；

图4为冠突散囊菌孢子的分散结果照片；

图5为冠突散囊菌的孢子悬液的绿茶散茶发花照片；

图6为冠突散囊菌的孢子悬液的右极品黑毛茶散茶发花观察照片。

具体实施方式

1、冠突散囊菌的培养：

用接种环挑取从湘益牌茯砖茶中分离的冠突散囊菌株(经广东微生物所鉴定)，接种于添加10％茶汁的PDA琼脂固体培养基平板中，28℃倒置培养4-7天，此期间冠突散囊菌落均可以用于液体培养的菌种。

2、冠突散囊菌液体培养基的制备：

茶汁的制备：以1∶30(质量比)茶水比、100℃水浴浸提2小时，双层纱布过滤备用。

马铃薯汁制备：以3∶10(质量比)马铃薯与水比、100℃水浴浸提1小时，双层纱布过滤备用。

准确称取200克蔗糖、100克NaCl先后溶于适量蒸馏水中，添加100mL已经制备好的茶汁、300mL已经制备好的马铃薯汁，最后定容至1000mL。

分装入250mL摇瓶中，加入20颗左右玻璃珠，121℃灭菌20分钟。

3、冠突散囊菌孢子的培养：

培养条件为28℃、静置培养5-7天；后期升高温度为30-32℃，静置培养2-3天；，待菌落周边金黄色，中央深褐色，菌落直径在5cm以上或长满整个摇瓶表面，说明冠突散囊菌孢子已经大量产生，可以用于制备。

4、冠突散囊菌孢子的分散：

培养好孢子的分散用摇床30℃、280rpm震荡培养分散1小时。

5、冠突散囊菌孢子的过滤：

用双层无菌纱布在超净工作台上过滤。

6、冠突散囊菌孢子的浓度确定：

孢子悬液浓度确定用722型分光光度计测量其OD值，控制在0.6-0.8左右。

7、冠突散囊菌孢子的保存：

制备好的孢子悬液保存于4℃冰箱中备用。

上述画线接种指用灭菌的接种针在超净台中将已经生长好的菌落挑取，在新的固体培养基平皿画线分离相应微生物。

上述金花菌落指金花菌在10％PDA培养基平板上生长到一定时候形成的一个菌落集合体，菌落指聚集在一起的微生物团。

实施例1：金花的分离、纯化：

将成品湘益牌茯砖茶样本用植物微型粉碎机粉碎，200目过筛、65℃干燥2小时后称取1g样品，定容10mL，配成浓度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5各10mL，取10^-3、10^-4、10^-5三个梯度各0.0.5ml涂布于添加10％茶汁的PDA平板，超净台上吹干，28℃培养3天，挑取金黄色优势菌落，画线至添加10％茶汁的PDA平板上，同样条件继续培养直至纯化。

分离纯化的金花菌落见附图1。

实施例2：金花的孢子悬液制备：

挑取纯化的金花菌落，接种至添加10％茶汁、20％蔗糖、10％NaCl的PDA液体培养基中，培养条件为28℃、静置培养5-7天；后期升高温度为30-32℃，静置培养2-3天，再后280rpm振荡培养分散分生孢子，用双层无菌纱布过滤，用722型分光光度计测得OD值为0.6-0.8，即为可用的金花孢子悬液。

金花的孢子悬液培养结果见附图2、附图3、附图4。

实施例3：金花的孢子悬液的散茶发花验证：

分别取绿茶、极品黑毛茶各2Kg，按照前述具体散茶发花程序实施散茶发酵，结果证明均能有效发花，发花均匀，颗粒饱满。

绿茶、极品黑毛茶散茶发花结果见附图4、图5、图6。

上述金花菌落指金花菌在10％PDA培育基平板上生长到一定时候形成的一个菌落集合体，即聚集在一起的微生物团。

Claims

1.一种冠突散囊菌孢子悬液制备方法，其特征在于步骤为：

1)冠突散囊菌的培养；

2)冠突散囊菌液体培养基的制备；

3)冠突散囊菌孢子的培养；

4)冠突散囊菌孢子的分散；

5)冠突散囊菌孢子的过滤；

6)冠突散囊菌孢子的浓度确定；

7)冠突散囊菌孢子的保存。

2.根据权利要求1所述的冠突散囊菌孢子悬液制备方法，其特征在于：具体方法如下：

3)冠突散囊菌孢子的培养：培养条件为28℃、静置培养5-7天；后期升高温度为30-32℃、静置培养2-3天；

5)冠突散囊菌孢子的过滤：用双层无菌纱布过滤；

6)冠突散囊菌孢子悬液的浓度确定：用722型分光光度计测量其OD，控制在0.6-0.8左右；

7)冠突散囊菌孢子悬液的保存：保存于4℃冰箱中。

3.根据权利要求1所述的冠突散囊菌孢子悬液制备方法，其特征在于：茶汁的制备方法是：按质量比，茶水比1∶30，100℃水浴浸提2小时，双层纱布过滤备用。

4.根据权利要求1所述的冠突散囊菌孢子悬液制备方法，其特征在于：PDA琼脂固体培养基指将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块放入烧杯中，加适量蒸馏水，煮沸1小时，稍冷后用双层纱布过滤，在滤液中加入15g琼脂，加热熔化，最后加入蔗糖20g，混匀，用量筒定容至1000mL，趁热分装在三角瓶中，在1.1kg/cm²(121℃)中保持20分钟灭菌。

5.根据权利要求1所述的冠突散囊菌孢子悬液制备方法，其特征在于：PDA液体培养基指上述培养基配制过程操作，但不添加琼脂。即：将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块放入烧杯中，加适量蒸馏水，煮沸1小时，稍冷后用双层纱布过滤，最后加入蔗糖20g，混匀，用量筒定容至1000mL，趁热分装在三角瓶中，在1.1kg/cm²(121℃)中保持20分钟灭菌。