CN103865811A - 一种茶渣添加营养液循环制备金花工艺 - Google Patents
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Abstract
一种茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其步骤如下：（1）从茯砖茶中筛选金花菌菌种；（2）制备改良PDA发酵液，无菌操作接种金花菌,培养；（3）制备金花菌孢子接种液；（4）制备金花菌生长营养液；（5）将干茶渣粉碎制成培养基质；（6）将金花菌孢子接种液置消毒喷壶内；（7）完成营养生长，促进闭囊壳产生；（8）发酵，干燥；（9）基质干燥，筛分两次，获得纯度较高的金花。本发明发酵步骤一次性完成，成本较为低廉，同时减少了杂菌的污染，解决了发酵过程中培养基质受杂菌如青霉、黑曲霉等污染较为严重的问题。
Description
技术领域
本发明涉及菌种培养技术领域，具体涉及一种利用茶渣循环制备金花工艺。
背景技术
金花菌学名为冠突散囊菌（Eurotium cristarum），主要存在于黑茶中的茯砖茶内，是我国制茶行业唯一二级机密保护菌种，其在茶叶上生长产生的闭囊壳堆积成肉眼可见的金黄色颗粒状，俗称金花，金花的多少历来是评价茯砖茶品质好坏的重要指标。近年来大量研究资料表明“金花”对高血压、高血脂、糖尿病等疾病具备良好的保健效果，并有提高机体免疫力的作用。
随着金花保健功效的发掘，对其产品的开发成为了时下研究的热点，这就需要大量的金花作为提取材料。金花菌生长条件较为苛刻，往往只在发酵良好的茯砖茶内部有少量存在，因此从茯砖茶中大量收集金花的方案是不现实的，而利用散茶或其他植物原料培养金花成本亦较高。本发明是为了实现金花产品的开发利用而研制的一种茶渣添加营养液循环制备金花工艺。
中国专利（申请号：201210470477.7）提供了“一种茯砖茶金花菌孢子粉的制备方法”，该专利不足之处在于：
（1）使用250mL/500mL锥形瓶作为培养容器、麸皮平铺厚度为1.0～1.3cm，一次培养获得的曲种较少；
（2）首先需发酵培养获得曲种，再以发酵完成的曲种扩大培养，所有操作均需在无菌条件下进行，发酵容器外需包裹8层纱布，且0~36h时还需加盖透气封口膜，其操作较为繁琐，不适宜大批量生产；
（3）所用培养基质不可重复利用，原料的消耗量较大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：解决现有金花生产工艺原材料消耗大，成本高的问题，而提供一种茶渣添加营养液循环制备金花工艺，实现了对发酵原料的重复利用，并且生产周期较短，能为金花研究与产品开发提供大量的原料。
本发明采用的技术方案是：一种茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其步骤如下：
（1）从茯砖茶中筛选金花菌菌种；
（2）制备改良PDA发酵液，无菌操作接种金花菌，28℃培养6d；
（3）将发酵液瓶180rpm振荡20min，使金花菌孢子与菌丝分离，之后用双层无菌纱布过滤除去菌丝，得到金花菌孢子接种液；
（4）制备金花菌生长营养液；
（5）将干茶渣粉碎（或是之前制备金花工艺中回收的茶渣），加入30％左右营养液充分混匀，即为培养基质，将基质平铺在不锈钢方盘发酵容器内，调节厚度为2.5cm左右，盖上玻璃盖，100℃烘1h，冷却24h后重复烘1h；
（6）将金花菌孢子接种液置消毒喷壶内，均匀喷洒到冷却的培养基质表面，1kg基质用接种液15~20mL，盖上玻璃盖，67℃预烘1h；
（7）将容器取出置于28℃环境下持续发酵3d，待白色菌丝遍布基质表面并开始转黄时，即完成营养生长，此时提高室温为30~32℃并加强室内空气流通，以促进闭囊壳产生；
（8）发酵6d时取下玻璃盖，拌匀发酵底物，控温为38~42℃干燥；
（9）待基质充分干燥后，100目电动筛重复筛分两次，获得纯度较高的金花，并收集茶渣以备下次重复利用。
所述的步骤（1）中金花菌菌种从湖南益阳茶厂有限公司08年产金湘益牌茯砖茶中分离纯化获得，经广东微生物研究所鉴定为冠突散囊菌；
所述的步骤（2）中改良PDA发酵液，其特征在于，每升培养基使用200g马铃薯、50g蔗糖，方法为将去皮切碎的马铃薯置适量水中煮烂，双层纱布滤去马铃薯渣，滤液加入蔗糖并搅拌溶解，定容至1000mL，分装三角瓶灭菌；
所述的步骤（2）和步骤（3）金花菌孢子接种液，其具体制备方法为，待改良PDA发酵液灭菌冷却后，无菌操作接入金花菌，28℃静置培养6d至产生大量的金花菌菌体，将三角瓶置摇瓶机上180rpm振荡20min使孢子与菌丝分离，双层纱布过滤去除菌丝，即获得金花菌孢子接种液；
所述的步骤（3）金花菌孢子接种液，通过涂布平板法测定孢子含量＞108个/mL；
所述的步骤（4）金花菌生长营养液能提供金花菌生长所需的氮源、碳源等生长素，其中含马铃薯30％、蔗糖20％、NaCl 5％，具体制备方法为：将去皮切碎的马铃薯300g置适量水中煮烂，双层纱布滤去马铃薯渣，滤液加入200g蔗糖、50gNaCl并搅拌溶解，定容至1000mL；
所述的步骤（5）发酵容器为不锈钢方盘（500cm×350cm×4.5cm），容器盖为面积略大于方盘的玻璃，以便于在发酵过程中观察，玻璃盖上后应无明显空隙。使用时将培养基质放在方盘内摊平，厚度不超过3.5cm，每盘约可容纳基质500g；该容器盖上玻璃后为半封闭状态，可有效控制培养基质内的水分缓慢散发，培养基质前期湿度较大利于菌丝生长，后期湿度降低则可促使耐干燥的闭囊壳产生。玻璃盖与方盘之间的缝隙有利于空气交换，满足了金花菌对氧气的需求，同时外界霉菌孢子也不易透过缝隙对基质造成污染，正确操作下每盘培养基质杂菌污染面积≤2cm2。
所述的步骤（6）中67℃预烘1h是金花菌发酵前的关键步骤，通过实验可知，金花菌孢子在67℃条件下可存活2~3h，67℃预烘1h即可有效杀死接种过程中所污染的杂菌，并且不对金花菌孢子的活性造成影响，使本工艺对环境要求较低，无需使用无菌操作间等设施。
所述的步骤（7）中菌丝开始转黄并产生少量闭囊壳时，应及时升温以促进闭囊壳产生；
所述的步骤（8）中发酵6d时基质应布满金花菌闭囊壳且颗粒饱满丰富，干燥过程中温度不应超过42℃，此过程可进一步促使金花菌闭囊壳产生；
所述的步骤（9）中产品金花为金黄色粉末状，轻嗅有菌花香，在潮湿处易结块且颜色加深，置于密封清洁容器干燥处保存；
所述的步骤（9）中回收的培养基质中营养物质已基本耗尽，但物理特性基本稳定，较为适宜金花菌菌丝生长，通过加入营养液便可作为发酵底物重复利用。
本发明和现有的专利与文献相比，具备以下显著优点：
（1）由孢子悬液直接接种至培养基质，发酵步骤一次性完成；
（2）所用茶渣可以是通过浸提之后的茶叶渣，也可以是茶叶加工中的边角料，成本较为低廉，通过粉碎进一步提高了金花菌的生长面积，且干燥后金花与茶渣较易分离；
（3）通过加入适宜金花菌生长的营养液，解决了一次发酵后茶渣中营养成分耗尽的问题，实现了对发酵基质的循环利用；
（4）利用改良发酵容器，半封闭式发酵满足了金花菌生长所需的氧气与一定湿度，同时减少了杂菌的污染；
（5）通过发酵容器改良与接种后预烘工艺，杀死了杂菌而保留金花菌孢子活力，解决了发酵过程中培养基质受杂菌如青霉、黑曲霉等污染较为严重的问题。
附图说明
图1为金花菌接种液照片；
图2为发酵过程中的茶渣照片；
图3为茶渣培育金花6d照片；
图4为二次过筛的金花照片；
图5为本发明工艺流程图。
具体实施方式
步骤1.金花菌的分离纯化：金花菌来源为湖南省益阳茶厂有限公司08年产金湘益牌茯砖茶。具体分离纯化步骤为：用镊子取茯砖茶砖心处长有金花的茶叶10g，加入到装有90mL无菌水的三角瓶内，盖上无菌封口膜，置摇床上180rpm振摇20min，制成10-2倍样品稀释液，梯度稀释至10-6，取1mL稀释液涂布于CZG平板上，28℃培养5～6d，用接种针挑取长势较好的金花菌菌落进行划线分离，重复划线2～3次后获得纯培养金花菌菌株。
步骤2.金花菌孢子接种液的制作：马铃薯200g洗净去皮，加1000mL水煮沸15min后过滤，滤液加入50g蔗糖，搅拌至溶解后，分装三角瓶灭菌。在超净工作台下用接种环挑取斜面保存的金花菌菌体，接种至发酵液中，28℃培养6d。
步骤3.将上述发酵液瓶80rpm振摇20min，双层无菌纱布过滤即为金花菌孢子接种液。
金花菌孢子接种液见附图1。
步骤4.制备金花菌生长营养液：将马铃薯去皮洗净，取300g切碎放入烧杯中，加1000mL水，煮沸后维持20min左右，用双层纱布过滤去除马铃薯渣，滤液加入200g蔗糖、50gNaCl，搅拌至溶解，即为金花菌生长营养液。
步骤5.培养基质制备：将干茶渣置于植物粉碎机内粉碎并挑去杂质，选取1kg茶叶渣放在盘内，加入300mL营养液并搅拌均匀，制成金花培养基质。
湿热灭菌：将培养基质平铺在不锈钢方盘内，调节厚度为2.5cm左右，最厚处不超过3.5cm。盖上一块略大于方盘的玻璃盖并确认无明显缝隙，置烘箱内100℃烘1h，冷却24h后重复烘1h，取出冷却；
步骤6：接种与预烘：将金花菌接种液装入已消毒的喷壶内，揭起玻璃盖，将悬液均匀喷洒到培养基质上，保证基质表面被接种液完全覆盖即可。盖上玻璃盖，将方盘置烘箱67℃烘1h。
金花菌发酵中的茶渣见附图2。
步骤7：金花菌发酵：将方盘取出置于28℃环境下发酵3d，待白色的营养菌丝长满基质表明并开始转黄时，将室温升高至30~32℃，并每日打开门窗透气半小时，以促进金花大量产生。
发酵6d的基质见附图3。
步骤8：干燥与金花收集：发酵6d左右，此时金花布满了培养基质，将玻璃盖揭去，拌匀基质，提高室温为38℃~42℃，48h左右即可充分干燥。
步骤9：将上述干燥的基质置于100目电动振摇筛中振摇3min，便可将大部分金花筛下，再次过100目筛即获得纯度较高的金花，用自封袋将金花包装好放置在阴凉干燥处储存，茶渣收集以重复利用。
二次过筛的金花见附图4。
Claims (10)
1.一种茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，其步骤如下：
（1）从茯砖茶中筛选金花菌菌种；
（2）制备改良PDA发酵液，无菌操作接种金花菌，28℃培养6d；
（3）将发酵液瓶180rpm振荡20min，使金花菌孢子与菌丝分离，之后用双层无菌纱布过滤除去菌丝，得到金花菌孢子接种液；
（4）制备金花菌生长营养液；
（5）将干茶渣粉碎（或是之前制备金花工艺中回收的茶渣），加入30％左右营养液充分混匀，即为培养基质，将基质平铺在不锈钢方盘发酵容器内，调节厚度为2.5cm左右，盖上玻璃盖，100℃烘1h，冷却24h后重复烘1h；
（6）将金花菌孢子接种液置消毒喷壶内，均匀喷洒到冷却的培养基质表面，1kg基质用接种液15~20mL，盖上玻璃盖，67℃预烘1h；
（7）将容器取出置于28℃环境下持续发酵3d，待白色菌丝遍布基质表面并开始转黄时，即完成营养生长，此时提高室温为30~32℃并加强室内空气流通，以促进闭囊壳产生；
（8）发酵6d时取下玻璃盖，拌匀发酵底物，控温为38~42℃干燥；
（9）待基质充分干燥后，100目电动筛重复筛分两次，获得纯度较高的金花，并收集茶渣以备下次重复利用。
2.根据权利要求1所述的茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，所述的步骤（1）中金花菌菌种从湖南益阳茶厂有限公司08年产金湘益牌茯砖茶中分离纯化获得，经广东微生物研究所鉴定为冠突散囊菌。
3.根据权利要求1所述的茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，所述的步骤（2）中改良PDA发酵液，其特征在于，每升培养基使用200g马铃薯、50g蔗糖，方法为将去皮切碎的马铃薯置适量水中煮烂，双层纱布滤去马铃薯渣，滤液加入蔗糖并搅拌溶解，定容至1000mL，分装三角瓶灭菌。
4.根据权利要求1所述的茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，所述的步骤（2）和步骤（3）金花菌孢子接种液，其具体制备方法为，待改良PDA发酵液灭菌冷却后，无菌操作接入金花菌，28℃静置培养6d至产生大量的金花菌菌体，将三角瓶置摇瓶机上180rpm振荡20min使孢子与菌丝分离，双层纱布过滤去除菌丝，即获得金花菌孢子接种液；所述的步骤（3）金花菌孢子接种液，通过涂布平板法测定孢子含量＞108个/mL。
5.根据权利要求1所述的茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，所述的步骤（4）金花菌生长营养液能提供金花菌生长所需的氮源、碳源等生长素，其中含马铃薯30％、蔗糖20％、NaCl 5％，具体制备方法为：将去皮切碎的马铃薯300g置适量水中煮烂，双层纱布滤去马铃薯渣，滤液加入200g蔗糖、50gNaCl并搅拌溶解，定容至1000mL。
6.根据权利要求1所述的茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，所述的步骤（5）发酵容器为不锈钢方盘（500cm×350cm×4.5cm），容器盖为面积略大于方盘的玻璃，以便于在发酵过程中观察，玻璃盖上后应无明显空隙；使用时将培养基质放在方盘内摊平，厚度不超过3.5cm，每盘约可容纳基质500g；该容器盖上玻璃后为半封闭状态，可有效控制培养基质内的水分缓慢散发，培养基质前期湿度较大利于菌丝生长，后期湿度降低则可促使耐干燥的闭囊壳产生；玻璃盖与方盘之间的缝隙有利于空气交换，满足了金花菌对氧气的需求，同时外界霉菌孢子也不易透过缝隙对基质造成污染，正确操作下每盘培养基质杂菌污染面积≤2cm2。
7.根据权利要求1所述的茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，所述的步骤（6）中67℃预烘1h是金花菌发酵前的关键步骤，通过实验可知，金花菌孢子在67℃条件下可存活2～3h，67℃预烘1h即可有效杀死接种过程中所污染的杂菌，并且不对金花菌孢子的活性造成影响，使本工艺对环境要求较低，无需使用无菌操作间等设施。
8.根据权利要求1所述的茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，所述的步骤（7）中菌丝开始转黄并产生少量闭囊壳时，应及时升温以促进闭囊壳产生。
9.根据权利要求1所述的茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，所述的步骤（8）中发酵6d时基质应布满金花菌闭囊壳且颗粒饱满丰富，干燥过程中温度不应超过42℃，此过程可进一步促使金花菌闭囊壳产生。
10.根据权利要求1所述的茶渣添加营养液循环制备金花工艺，其特征在于，所述的步骤（9）中产品金花为金黄色粉末状，轻嗅有菌花香，在潮湿处易结块且颜色加深，置于密封清洁容器干燥处保存；所述的步骤9中回收的培养基质中营养物质已基本耗尽，但物理特性基本稳定，较为适宜金花菌菌丝生长，通过加入营养液便可作为发酵底物重复利用。
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