CN103110180A - 利用冠突散囊菌改善初烤烟叶质量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用冠突散囊菌改善初烤烟叶质量的方法，其包含以下步骤：（1）冠突散囊菌菌株的活化培养；（2）产分生孢子菌落的培养：制作分生孢子培养基，并将分生孢子培养基制平板，将步骤（1）中菌株斜面的菌落点种于平板上，倒置培养5-7天；待闭菌落长满平板；（3）孢子悬液的制备及接种按步骤（2）的制备的分生孢子，用无菌水洗下并制成孢子悬液；将孢子悬液作为接种体，均匀喷施于初烤烟叶。当处理条件为培养温度为30℃，孢子浓度为10⁶，10⁷时，初烤烟叶的香气质变好,杂气和刺激性减轻,烟气甜感增大、细腻且醇和,余味变得纯净舒适，烟碱有所下降，烟叶总体质量得到提高。

Description

利用冠突散囊菌改善初烤烟叶质量的方法

技术领域

本发明涉及微生物促进烤烟烟叶微生物醇化（发酵）方法。 

背景技术

烟叶醇化（发酵）是烟草加工中改善烟叶品质的重要环节，其实质上是在一定的温度和湿度条件下,促使烟叶理化特性发生变化，烟叶香气和品质明显改善的加工过程。烟叶醇化（发酵）主要有3 个方面的作用：氧化作用，微生物作用，烟叶本身所具有的酶的作用。然而3种作用对烟叶发酵贡献如何、主次原因还没有统一的定论。但研究发现微生物是推动烟叶醇化发酵、提高烟叶品质香气不可忽视的重要原因之一。 

我国学者用从烤烟烟叶上分离鉴定的4 个优势菌种处理烟叶,不仅大大缩短了发酵时间,而且使烟叶品质及色香味均有一定的提高。用芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌混合配制成生物制剂(TFA) 用于烟叶发酵,可加速烤烟发酵,提高烟叶品质,并且具有抑制烟叶霉变的作用。也有学者利用4 种由优势增香菌种和高生物活性的α- 淀粉酶、蛋白酶等配制而成的烟草发酵增质剂,对人工发酵和自然陈化过程中的烤烟烟叶的增质、增香效果进行了对比研究。发现烟草发酵增质剂具有促进烟叶内部有机物质的分解与转化,加速烟叶发酵过程、缩短发酵周期。枯草芽孢杆菌对烟叶的还原糖和蛋白氨基酸含量的变化影响显著，并使得烟叶发酵后,杂气减少,刺激性有所降低,香味略有增加,余味舒适。另外食用菌中的一些菌株对初烤烟叶品质的改善也值得关注。微生物发酵不仅能够显著地缩短烟叶醇化时间,而且在一定程度上可以提高烟叶的内在质量。目前，对烟叶人为添加各种优势微生物及酶制剂来加快烟叶醇化进程、降低有害物质、改善烟叶品质、提高烟叶吸食安全性、降低生产成本是生物技术在烟叶醇化上应用的热点。 

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）属灰绿曲霉，是茯砖茶发花过程中的优势菌种，对茯砖茶独特品质的形成具有重要的作用。在茶叶发花过程中冠突散囊菌从茶叶中获取营养物质，进行自身代谢转化，同时产生各种胞外酶催化茶叶中各种相关物质发生氧化、聚合、降解、转化，基本完成茯砖茶特有的色、香、味品质的物质转化。该菌好气耐干燥高渗透能力强，生长的pH范围在3-6，最适生长pH为5，最适生长温度为28-30℃，最高生长温度为38℃。冠突散囊菌最主要的特征是具冠状突起及表面明显粗糙具小疣的子囊孢子和具小刺的分生孢子，是产生有性型（子囊孢子）和无性型（分生孢子）的全型真菌。温琼英将冠突散囊菌接种在以淀粉、单宁、葡萄糖为碳源的琼脂培养基培养，结果表明该菌能分解老茶中的淀粉和单宁物质，减低茶叶苦涩味，使茶叶滋味醇和。冠突散囊菌在发酵茶叶过程中对部分真菌、细菌和酵母的生长具有不同程度的抑制作用。肖文军等研究了速溶茯砖茶对小鼠与大鼠的毒理特性，结果表明，茯砖茶属无毒物。王志刚等研究表明，冠突散囊菌的培养液对卤虫无毒性。1994年，王志刚等又用卤虫生物法研究了冠突散囊菌的毒性，发现10株冠突散囊菌菌体提取物在蔗糖酵母浸汁培养基上培养后均未发现明显产毒，进一步证实冠突散囊菌确实是无毒的。 

在烟叶发酵与陈化过程中伴随大量微生物参与活动，通过烟叶的微生物发酵作用，使烟叶中的一些化学成分发生变化，微生物消耗或转化了烟叶中的有关成分，同时又产生一些代谢产物或生物量，从而能增强烟叶的抗感染能力，消除烟叶本身的不利因素，提高烟叶的香味质量。但在微生物发酵过程中，还存在微生物诱香安全性的问题，利用微生物改善烟叶内在品质，烟叶安全性评价是不容忽视的问题。将食品微生物应用于烟叶发酵，减少有害物质的来源，提高烟叶吸食安全性对于烟草行业发展有重要作用。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是：将食品微生物应用于烟叶发酵，减少有害物质的来源，提高烟叶吸食安全性对于烟草行业发展有重要作用。 

本发明的技术方案是：利用冠突散囊菌改善初烤烟叶质量的方法，包含以下步骤： 

（1）冠突散囊菌菌株的活化培养  

将冰箱保存的斜面菌株置于30℃的培养箱中48小时，用接种针将其接种于新配制的PDA斜面培养基上，30℃培养待其菌落长满斜面后备用； 

（2）产分生孢子菌落的培养

制作分生孢子培养基，并将分生孢子培养基制平板，将步骤（1）中菌株斜面的菌落点种于平板上，倒置培养；待菌落长满平板；

（3）孢子悬液的制备及接种  

将步骤（2）的制备的分生孢子，用无菌水洗下并制成孢子悬液；将孢子悬液作为接种体，均匀喷施于初烤烟叶。

所述的分生孢子培养基：蔗糖400g，麦芽20g，酵母膏5 g ，琼脂20g，水1000mL，121℃灭菌30min。 

所述的步骤（3）中发酵的最优条件为：温度30℃、湿度70%±2%的条件下接种孢子浓度为10⁶个/mL或10⁷个/mL并发酵50天。 

本发明的有益效果：理化指标：发酵的样品还原糖、水溶性多糖变化幅度较大，蛋白质含量有所下降，糖/碱、氮/碱比例变得更为协调，在一定程度上降低烟碱含量。说明冠突散囊菌对烟叶的助醇、降害方面效果显著。人工评吸指标：冠突散囊菌处理后的样品在香气质、香气量、吃味上有很大改善，甜感增加，更加柔和，杂气、刺激性明显降低。总体效果：利用冠突散囊菌发酵处理后的烟叶质量的改观很明显，可使香气前体物质、还原性糖含量增加，烟碱和石油醚提取物有不同程度的降低，使化学成分趋于协调平衡，杂气和刺激性减轻，香气外露，对烟叶品质的改善具较明显的促进作用，并形成独特的烟质特点。 

具体实施方式

冠突散囊菌的活化培养  

将冰箱保存的斜面菌株置于30℃的培养箱中48小时，用接种针将其接种于新配制的PDA斜面培养基上，30℃培养待其菌落长满斜面后备用。

产分生孢子的培养

1.M40y培养基（分生孢子培养基）：蔗糖400g，麦芽20g，酵母膏5 g ，琼脂20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌30min；

2. 将M40y培养基制平板，用接种针挑取适量闭囊壳点种于平板中央，于30℃下倒置培养，待菌落长满平板；

3. 平板产生表面黄色、颜色较浅，较密集，有灰绿色分生孢子子的菌落。

孢子悬液的制备及接种  

挑取活化后的冠突散囊菌采用点接法接种到M40y培养基上，于30℃下培养7天，待产生足够的分生孢子后，用无菌水洗平板上的菌落，分别制成10⁸，10⁷，10⁶个/mL三种浓度的孢子悬液，将三种孢子悬液均匀喷施于烟叶。

冠突散囊菌DNA提取与扩增

总DNA的提取按照真菌DNA提取的方法进行，采用真菌5.8S rDNA的通用引物ITS4和ITS5：

ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)

ITS5 (5’-GGT GAGAGATTTCTGTGC-3’) 

以冠突散囊菌DNA为模板，利用PCR反应扩增其5.8rDNA片段。

M₄₀y培养基上菌落为黄色, 菌株形成的菌落较密集，颜色较浅，镜检发现，菌落基本由菌丝组成，并有灰绿色分生抱子头产生。 

  

冠突散囊菌是产生有性型(子囊孢子阶段)和无性型(分生孢子阶段)的全型真菌。闭囊壳球形或近球形，黄色，直径90-310μm；子囊球形至近球形，壁薄易破，10.0-17.5μm；子囊孢子双凸镜形，具有两个明显的冠状突起，大小为4.0-6.0×3.0-5.8μm，凸面明显粗糙，具小疣。分生孢子头辐射状到柱头，灰绿色，直径一般为25-160μm，壁光滑；顶囊近球形或烧瓶形，直径一般为10-45μm，瓶梗3.8-9.06×4.0μm；分生孢子椭圆形，少数近球形，壁粗糙具小刺，大小为3.0-6.0×2.5-5.8μm。

冠突散囊菌ITS4-5.8S-ITS5的碱基序列

ATAGAGCTACTGATCGAGGTCACCTGGTTAAAAAGATTGGTTGCGAGGCTAGCTGCCAGCTGGACCTACGGGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCAGACATGGTGCCGCCACTGCCTTTTGGGCCCGTCCCCGTTGCCAGGGACGGAAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAATTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACGATTGTTTAACTAAAAACTCAGACTGCAAACTTCAGACAGCGTTCAAATGTTAGTCTCCGGCGGGCCGTGGCCACGCCGAAGCAACAGGGTACAGATAGACACGGATGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGCTTTTTTACCTTCCAGGTTACCAACTGAAATTAAGCAAAAAATTTGCACGTTAAAAAAACCACCCAAGGGTCTC

在3个温度和3个孢子浓度的冠突散囊菌孢子对烟叶进行发酵，实施结果如下：

冠突散囊菌10⁶个/mL孢子浓度处理，烟叶在25℃、30℃两个温度下，冠突散囊菌对还原糖，水溶性总糖含量提高显著，有效降低烟碱和蛋白含量，见表1，原因在于在此温度下该菌分泌的降解酶类将烟叶中的碳水化合物和含氮化合物进行了降解。该菌处理后烟叶经评吸测试后，能够提高香气质和香气量，改进吃味，减少刺激性和杂气，增加烟叶甜感和细腻度。但在35℃的发酵条件下，化学指标检测结果不如25℃和30℃，原因在于，35℃接近该菌的最高耐受温度，导致对烟叶处理效果不够理想，见表1和表2。其中在孢子浓度10⁶个/mL，发酵温度30℃，处理效果最好。

表1 浓度为10⁶个/mL的孢子悬液对烟叶发酵后化学分析检测结果（%） 

                                                    

表2 接种浓度为10⁶个/mL的孢子悬液发酵后烟叶评吸分情况

冠突散囊菌10⁷个/mL孢子浓度处理：烟叶在25℃下，冠突散囊菌对还原糖，水溶性总糖含量提高显著，有效降低烟碱和蛋白含量，该处理烟叶经评吸测试后，能够提高香气质和香气量，改进吃味，减少刺激性和杂气，增加烟叶甜感。表3和表4中效果最好的处理是10⁷个/mL，发酵温度30℃。

表3 浓度为10⁷个/mL的孢子悬液对烟叶发酵后化学分析检测结果（%） 

表4 接种浓度为10⁷个/mL的孢子悬液发酵后烟叶评吸分情况

冠突散囊菌10⁸个/mL孢子浓度处理：该处理下数据不成明显的规律性波动性较大。化学分析结果较好的是浓度为10⁸个/mL，发酵温度30℃。评吸效果最好的是在25℃的条件下。

表5 浓度为10⁸个/mL的孢子悬液对烟叶发酵后化学分析检测结果（%） 

表6 接种浓度为10⁸个/mL的孢子悬液发酵后烟叶评吸分情况

Claims (3)

1.利用冠突散囊菌改善初烤烟叶质量的方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）冠突散囊菌菌株的活化培养  

将冰箱保存的斜面菌株置于30℃的培养箱中48小时，用接种针将其接种于新配制的PDA斜面培养基上，30℃培养待其菌落长满斜面后备用； 

（2）产分生孢子菌落的培养

制作分生孢子培养基，并将分生孢子培养基制平板，将步骤（1）中菌株斜面的菌落点种于平板上，倒置培养；待菌落长满平板；

（3）孢子悬液的制备及接种  

将步骤（2）的制备的分生孢子，用无菌水洗下并制成孢子悬液；将孢子悬液作为接种体，均匀喷施于初烤烟叶。

2.根据权利要求1所述的利用冠突散囊菌改善初烤烟叶质量的方法，其特征在于：分生孢子培养基：蔗糖400g，麦芽20g，酵母膏5 g ，琼脂20g，水1000mL，121℃灭菌30min。

3.根据权利要求1所述的利用冠突散囊菌改善初烤烟叶质量的方法，其特征在于：步骤（3）中发酵的最优条件为：温度30℃、湿度70%±2%的条件下接种孢子浓度为10⁶个/mL或10⁷个/mL并发酵50天。