CN106167777A - 一种产抑菌活性物质的解淀粉芽孢杆菌的培养方法 - Google Patents

一种产抑菌活性物质的解淀粉芽孢杆菌的培养方法 Download PDF

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张志清
黎杉珊
罗擎英
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林德荣
罗松明
程璐
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Abstract

本发明提供了一种产抑菌活性物质的解淀粉芽孢杆菌的培养方法，该方法包括如下步骤：(1)制备解淀粉芽孢杆菌种子液；(2)将种子液接种于马铃薯淀粉废水培养基中进行发酵培养；所述马铃薯淀粉废水培养基由如下组分组成：蔗糖25‑35g、谷氨酸钠2‑6g、硫酸铵2‑6g、马铃薯淀粉废水1L。本发明的培养方法能使得解淀粉芽孢杆菌分泌抑菌物质；本发明的培养方法所有的培养基成分简单、廉价易得，培养方法简单易行，适于规模应用。

Description

一种产抑菌活性物质的解淀粉芽孢杆菌的培养方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产抑菌活性物质的解淀粉芽孢杆菌的培养方法。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物。
自Johnson等报道枯草芽孢杆菌可以产生抑菌物质以来，国内外学者先后从不同芽孢杆菌中分离得到多种抑菌物质，包括多肽类、脂肽类及抑菌蛋白类等。解淀粉芽孢杆菌作为一种益生菌，在其生长过程中可产生多种抑菌物质，为其在动植物生产中广泛应用提供了可能。
然而，目前在培养解淀粉芽孢杆菌分泌抑菌物质方面，所用的培养基成分复杂，成本较高，培养方法也有较多限制因素，这极大限制了解淀粉芽孢杆菌的研究和实际应用。
目前，我国马铃薯淀粉加工生产过程会产生大量的废水，每生产1吨淀粉约产生7吨左右的废水。废水直接排放会导致水体富营养化等环境问题，必须经处理达到国家标准后才能排放入水体等环境中。如何处理马铃薯淀粉加工废水是本领域的重要课题。
在通用培养基中，虽然马铃薯葡萄糖培养基利用了马铃薯作为原 料，但并不能解决马铃薯淀粉加工废液的处理问题。
因此，本领域亟待寻求一种成本低廉、能利用马铃薯淀粉加工废水作为原料且能促进解淀粉芽孢杆菌分泌抑菌物质的培养方法。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种产抑菌活性物质的解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备解淀粉芽孢杆菌种子液；
(2)将种子液接种于马铃薯淀粉废水培养基中进行发酵培养；
所述马铃薯淀粉废水培养基由如下组分组成：
如本发明的实验例所示，按照本发明的培养方法，可使得解淀粉芽孢杆菌分泌抑菌物质，对实验指示菌金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌效果。
虽然“Bioconversion of potato starch wastewater into biofertilizer byBacillus amyloliquefaciens for improving tea yield”和《柠檬酸废水和马铃薯淀粉废水资源化培养解淀粉芽孢杆菌及其应用》记载的培养方法能利用马铃薯淀粉废水对解淀粉芽孢杆菌进行培养，但却无法使得解淀粉芽孢杆菌分泌抗菌物质。
优选的，步骤(1)中种子液的制备方法为：挑取解淀粉芽孢杆菌斜面接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，于37℃、160r/min条件下，培养24h。
所述马铃薯葡萄糖液体培养基的制作方法为：取已去皮切块的马铃薯200g，加水煮沸30min，纱布过滤，加入20g/L葡萄糖，补水至1L，调节pH＝7.0±0.2；所述马铃薯废水的制作方法为：马铃薯削皮切块后，按质量比1:4加水打汁，过滤后离心，取上清液，即得；优选的，所述马铃薯废水的制作方法为：马铃薯削皮切块后，按质量比1:4加水绞碎打汁，静置15min，用四层纱布过滤，滤液静置2h后，在8000r/min转速下离心15min，取上清液，即得。
优选的，在步骤(2)中，种子液的接种量为6％。
优选的，在步骤(2)中，发酵初始pH为7.0。
优选的，在步骤(2)中，发酵温度为28-37℃，更优选为30℃。
优选的，在步骤(2)中，发酵时间为24-36小时，更优选为24小时。
优选的，在步骤(2)中，发酵时，摇床转速为160-220r/min，更优选为200r/min。
优选的，在步骤(2)中，发酵瓶中的装液量为30mL/250mL。
优选的，所述马铃薯淀粉废水培养基由如下组分组成：
更优选的，所述马铃薯淀粉废水培养基由如下组分组成：
本发明的有益效果：
1、本发明的培养方法能使得解淀粉芽孢杆菌分泌抑菌物质；
2、本发明的培养方法所有的培养基成分简单、廉价易得，培养方法简单易行，适于规模应用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中，马铃薯废水的制作方法为：马铃薯削皮切块后，按质量比1:4加水绞碎打汁，静置15min，用四层纱布过滤，滤液静置2h后，在8000r/min转速下离心15min，取上清液，即得。
实施例1
培养基：
种子液制备：挑取解淀粉芽孢杆菌新鲜斜面接种于PDA液体培养基(摇瓶，装液量100mL/250mL)，37℃、160r/min摇床培养24h作为种子液。
培养基115℃灭菌20min，培养基装液量30mL/250mL，30～50冷却后，按6％接种量接种解淀粉芽孢杆菌种子液，28℃，220r/min摇床振荡培养36h。
实施例2
培养基：
种子液制备：挑取解淀粉芽孢杆菌新鲜斜面接种于PDA液体培养基(摇瓶，装液量100mL/250mL)，37℃、160r/min摇床培养24h作为种子液。
培养基115℃灭菌20min，培养基装液量30mL/250mL，30～50冷却后，按6％接种量接种解淀粉芽孢杆菌种子液，37℃，160r/min摇床振荡培养24。
实施例3
培养基：
种子液制备：挑取解淀粉芽孢杆菌新鲜斜面接种于PDA液体培养基(摇瓶，装液量100mL/250mL)，37℃、160r/min摇床培养24h作为种子液。
培养基115℃灭菌20min，培养基装液量30mL/250mL，30～50冷却后，按6％接种量接种解淀粉芽孢杆菌种子液，30℃，200r/min摇床振荡培养24h。
实施例4
培养基：
种子液制备：挑取解淀粉芽孢杆菌新鲜斜面接种于PDA液体培养基(摇瓶，装液量100mL/250mL)，37℃、160r/min摇床培养24h作为种子液。
培养基115℃灭菌20min，培养基装液量30mL/250mL，30～50冷却后，按6％接种量接种解淀粉芽孢杆菌种子液，30℃，200r/min摇床振荡培养24h。
对比实施例1
按“Bioconversion of potato starch wastewater into biofertilizer byBacillus amyloliquefaciens for improving tea yield”的记载，对解淀粉芽孢杆菌进行培养。
对比实施例2
按《柠檬酸废水和马铃薯淀粉废水资源化培养解淀粉芽孢杆菌及其应用》中第3.1.1部分的记载，对解淀粉芽孢杆菌进行培养。
实验例
抑菌实验
1.1供试菌株
解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens PC2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2015435(已公开菌株)；金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus ATCC25923(已公开菌株)。1.2培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基(g/L)：牛肉浸膏5.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、葡萄糖10.0、琼脂10.0，pH 7.0±0.2。用于抑菌活性检测。
马铃薯葡萄糖液体培养基：取已去皮切块的马铃薯200g，加水煮沸30min，纱布过滤，20g/L葡萄糖，补水至1L，调节pH 7.0±0.2。用于解淀粉芽孢杆菌培养与活化。
1.3马铃薯淀粉废水制备
实验室模拟制备马铃薯淀粉废水：马铃薯削皮切块后，按质量比1:4加水绞碎打汁，静置15min，用四层纱布过滤，滤液静置2h后， 在8000r/min转速下离心15min，取上清液作为实验废水，调整pH到7.0±0.2。
1.4发酵液抑菌肽的制备
挑取解淀粉芽孢杆菌新鲜斜面接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(250mL摇瓶，装液量100mL)，37℃、160r/min摇床培养24h作为种子液。取解淀粉芽孢杆菌种子液接种于淀粉废水发酵培养基发酵培养。取发酵液于4℃、10000r/min离心10min，上清液用孔径0.45μm滤膜过滤获得去细胞发酵液。取10mL无菌发酵液，缓慢加入硫酸铵调节饱和度至60％，4℃静置12h，10000r/min、4℃离心20min，收集沉淀，加入0.02mol/LpH 7.0磷酸盐缓冲液5mL溶解，透析12h除盐，获得抑菌肽溶液。
1.5抑菌活性检测
挑取金黄色葡萄球菌新鲜斜面接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基250mL摇瓶，装液量100mL，37℃、160r/min摇床培养24h，获得指示菌菌悬液。采用改良双层平板法检测抑菌活性：在直径9cm的无菌培养皿中加入10mL牛肉膏蛋白胨固体培养基，冷却凝固作为底层平板。将无菌牛津杯(外径8mm)均匀置于底层平板表面，再加入20mL冷却至约50℃的牛肉膏蛋白胨固体培养基，冷却凝固后取出牛津杯，作为抑菌活性检测指示平板。在此平板上加200μL指示菌菌悬液，涂布均匀，然后在牛津杯孔中加入解淀粉芽孢杆菌抑菌肽溶液100μL，37℃培养12h，用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈的直径，以抑菌圈直径(mm)表示抑菌活性大小。
1.6发酵条件正交旋转优化
采取配方：蔗糖30.2g/L、谷氨酸钠3.96g/L、(NH4)2SO46.0g/L，马铃薯淀粉废水1000mL，作为培养基，采用单因素试验对发酵液初始pH、装液量、接种量、摇床转速、发酵温度、发酵时间对发酵液抑菌活性的影响进行考察。各单因素最佳条件参数分别为：pH值7.0、装液量20mL/250mL、接种量6％、摇床转速200r/min、发酵温度30℃、发酵时间24h。选取对抑菌效果影响比较显著的3个因素：装液量，摇床转速，发酵温度作为自变量，设计3因素共20个实验点的正交旋转试验，进一步优化发酵条件。通过回归拟合获得最佳发酵条件：装液量为30mL/250mL，摇床转速为200r/min，发酵温度为30℃。此时预测最大抑菌圈直径大小为28.87mm。验证试验测得抑菌圈直径大小为28.26mm，与理论预测值相差很小，说明采用正交旋转法优化得到的条件可靠。
表2发酵条件正交旋转试验设计及测得值
表2对比实施例抑菌实验结果

Claims (10)

1.一种产抑菌活性物质的解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备解淀粉芽孢杆菌种子液；
(2)将种子液接种于马铃薯淀粉废水培养基中进行发酵培养；
所述马铃薯淀粉废水培养基由如下组分组成：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中种子液的制备方法为：挑取解淀粉芽孢杆菌斜面接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，于37℃、160r/min条件下，培养24h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述马铃薯葡萄糖液体培养基的制作方法为：取已去皮切块的马铃薯200g，加水煮沸30min，纱布过滤，加入20g/L葡萄糖，补水至1L，调节pH＝7.0±0.2；所述马铃薯废水的制作方法为：马铃薯削皮切块后，按质量比1:4加水打汁，过滤后离心，取上清液，即得；优选的，所述马铃薯废水的制作方法为：马铃薯削皮切块后，按质量比1:4加水绞碎打汁，静置15min，用四层纱布过滤，滤液静置2h后，在8000r/min转速下离心15min，取上清液，即得。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，种子液的接种量为6％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，发酵初始pH为7.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，发酵温度为28-37℃，优选为30℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，发酵时间为24-36小时，优选为24小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，发酵时，摇床转速为160-220r/min，优选为200r/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，发酵瓶中的装液量为30mL/250mL。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述马铃薯淀粉废水培养基由如下组分组成：
优选的，所述马铃薯淀粉废水培养基由如下组分组成：
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