CN102286378B

CN102286378B - 一种抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素的复合益生菌及其应用

Info

Publication number: CN102286378B
Application number: CN2011101902875A
Authority: CN
Inventors: 尹清强; 左瑞雨; 刘俊熙; 王潇; 常娟; 郑秋红
Original assignee: HENAN PUAI FEED GROUP CO Ltd; Henan Agricultural University
Current assignee: HENAN PUAI FEED GROUP CO Ltd; Henan Agricultural University
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2031-07-08
Also published as: CN102286378A

Abstract

本发明属于微生态制剂领域，具体涉及了一种抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素的复合益生菌及其应用。由乳酪杆菌培养液：枯草芽孢杆菌培养液：异常汉逊酵母培养液以1~3：1~3：1~3的体积比混合组成。本发明复合益生菌对黄曲霉的生长有抑制作用，并且具有降解黄曲霉毒素的作用，尤其以乳酪杆菌培养液：枯草芽孢杆菌培养液：异常汉逊酵母培养液=2：1：2的体积比时最佳，按此益生菌配比，可使黄曲霉毒素的降解率达到82.71%(P<0.05)。

Description

一种抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素的复合益生菌及其应用

技术领域

本发明属于微生态制剂领域，具体涉及了一种抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素的复合益生菌及其应用。

背景技术

黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillums parasiticus）、模式曲霉（Aspersillus nomius）等广泛存在于花生、玉米、麦类、谷物类等粮食作物的籽粒及核桃、杏仁等干果中，所产生的次级代谢产物霉菌毒素具有很强的致癌、致畸和致突变性。全世界每年约有25%的粮油作物由于霉菌毒素的污染而不能食用，据联合国粮农组织估算，每年全世界因霉菌毒素污染带来的损失达数千亿美元。为了减少损失、扩大饲料资源，需要对被霉菌毒素污染的原料进行脱毒处理，而如果能采取措施抑制原料储藏过程中霉菌的生长，则可从源头上减少霉菌毒素产生。据报道，一些微生物对霉菌的生长具有抑制作用，可以考虑利用微生物之问的竞争抑制作用，将具有抑制霉菌生长的微生物按比例添加到饲料原料中抑制霉菌的生长，进而抑制毒素的产生，从而达到预防畜禽霉菌毒素的中毒的目的，为畜禽健康生长、畜产品安全及人类健康提供保障。因此筛选出能够抑制黄曲霉毒素产生菌生长的微生物具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素的复合益生菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一种抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素的复合益生菌，由乳酪杆菌培养液：枯草芽孢杆菌培养液：异常汉逊酵母培养液以1~3：1~3：1~3的体积比混合组成。

较好地，所述复合益生菌优选由乳酪杆菌培养液：枯草芽孢杆菌培养液：异常汉逊酵母培养液以2：1：2的体积比混合组成。

进一步，乳酪杆菌培养液由乳酪杆菌在MRS培养基中培养收获；枯草芽孢杆菌培养液、异常汉逊酵母培养液分别由枯草芽孢杆菌、异常汉逊酵母在LB培养基中单独培养收获。

较好地，MRS培养基中按1~5%的接种量接种乳酪杆菌，乳酪杆菌培养液在pH为3.3~3.5时收获；LB培养基中按1~5%的接种量接种枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌培养液在培养40~48 h时收获；LB培养基中按1~5%的接种量接种异常汉逊酵母，异常汉逊酵母培养液在培养40~48 h时收获；所述接种量以体积百分比计。

复合益生菌在抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素中的应用。

本发明复合益生菌对黄曲霉的生长有抑制作用，并且具有降解黄曲霉毒素的作用，尤其以乳酪杆菌培养液：枯草芽孢杆菌培养液：异常汉逊酵母培养液=2：1：2的体积比时最佳，按此益生菌配比，可使黄曲霉毒素的降解率达到82.71% (P<0.05)。

附图说明

图1为乳酪杆菌培养液及其上清液对黄曲霉菌丝重量的影响；图中所标的字母“A、B”指的是统计学上的差异显著性，字母不同表示差异显著（P<0.05），相同表示差异不显著（P>0.05），下同；

图2为乳酪杆菌培养液及其上清液对培养液pH的影响;

图3为枯草芽孢杆菌对黄曲霉菌丝重量的影响；

图4为枯草芽孢杆菌培养液上清液对黄曲霉菌丝重量的影响；

图5为枯草芽孢杆菌对培养液pH的影响；

图6为枯草芽孢杆菌培养液上清液对培养液pH的影响；

图7为异常汉逊酵母培养液及其上清液对黄曲霉菌丝重量的影响；

图8为异常汉逊酵母培养液及其上清液对培养液pH的影响；

图9为复合益生菌对黄曲霉毒素B1的降解作用。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

乳酪杆菌（Lactobacillus casei）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、异常汉逊酵母（Hansenula anomala）和黄曲霉毒素产生菌 (Aspergillus flavus）均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，并由河南农业大学生物技术与动物营养研究室保存。

实施例1

乳酪杆菌培养液的制备：按1%（v/v）的接种量在MRS培养基中接种乳酪杆菌，置于37℃恒温静止培养，待培养液的pH降低至3.3~3.5时收获。

枯草芽孢杆菌培养液的制备：按1%（v/v）的接种量在LB培养基中接种枯草芽孢杆菌，置于37℃恒温振荡培养(150转/分)，待培养40 h时收获。

异常汉逊酵母培养液的制备：按1%（v/v）的接种量在LB培养基中接种异常汉逊酵母，置于30℃恒温振荡培养(150转/分)培养，待培养40 h时收获。

其中，MRS培养基的组成：胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母5 g、葡萄糖20 g、K₂HPO₄ 2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸铵2 g、MgSO₄ 0.2 g、MnSO₄ 0.05 g，用800 mL蒸馏水溶解后加入1 mL Tween 80，调pH为6.2~6.6，之后定容至1000 mL，在121℃、1.034×10⁵ Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min；

LB培养基的组成：胰蛋白胨10 g, 酵母5 g，NaCl 10 g，用800 mL蒸馏水溶解后调pH为7.0，之后定容至1000 mL，在121℃、1.034×10⁵ Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min。

取上述制备的乳酪杆菌培养液 20ml、枯草芽孢杆菌培养液 10ml、异常汉逊酵母培养液 20ml，混合均匀即组成复合益生菌。

实施例2

乳酪杆菌培养液、枯草芽孢杆菌培养液、异常汉逊酵母培养液的接种量为2%（v/v），枯草芽孢杆菌培养液在培养43 h时收获，异常汉逊酵母培养液在培养43 h时收获，制备同实施例1。

取上述制备的乳酪杆菌培养液 10ml、枯草芽孢杆菌培养液 10ml、异常汉逊酵母培养液 10ml，混合均匀即组成复合益生菌。

实施例3

乳酪杆菌培养液、枯草芽孢杆菌培养液、异常汉逊酵母培养液的接种量为3%（v/v），枯草芽孢杆菌培养液在培养46 h时收获，异常汉逊酵母培养液在培养46 h时收获，制备同实施例1。

取上述制备的乳酪杆菌培养液 20ml、枯草芽孢杆菌培养液 20ml、异常汉逊酵母培养液 30ml，混合均匀即组成复合益生菌。

实施例4

乳酪杆菌培养液、枯草芽孢杆菌培养液、异常汉逊酵母培养液的接种量为5%（v/v），枯草芽孢杆菌培养液在培养48 h时收获，异常汉逊酵母培养液在培养48 h时收获，制备同实施例1。

取上述制备的乳酪杆菌培养液 30ml、枯草芽孢杆菌培养液 30ml、异常汉逊酵母培养液 20ml，混合均匀即组成复合益生菌。

本发明复合益生菌对黄曲霉毒素产生菌的生长抑制作用

1. 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

实验所用的乳酪杆菌（Lactobacillus casei）三株（编号计为A1、A2、A3）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）四株（编号计为B1、B2、B3、B4）、异常汉逊酵母（Hansenula anomala）和黄曲霉毒素产生菌 (Aspergillus flavus）均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，并由河南农业大学生物技术与动物营养研究室保存。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 黄曲霉毒素产生菌的液体和固体培养基

液体培养基：蔗糖 30.0 g，NaNO₃ 3.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，KCl 0.5 g、FeSO₄·7H₂O 0.01 g，K₂HPO₄ 1.0 g，用800 mL蒸馏水溶解后调pH为6.0~6.5，定容至1000 mL，在121℃、1.034×10⁵ Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min。

若制备黄曲霉毒素产生菌的固体培养基，可在上述没有高压蒸汽灭菌的液体培养基中额外加入20 g琼脂，在电炉上搅拌加热直到琼脂完全溶化，趁热按每个玻璃平皿15~20 mL，倒入平皿中，在121℃、1.034×10⁵ Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.2.2 乳酪杆菌的MRS培养基

胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母5 g、葡萄糖20 g、K₂HPO₄2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸铵2 g、MgSO₄ 0.2 g、MnSO₄ 0.05 g，用800 mL蒸馏水溶解后加入1 mL Tween 80，调pH为6.2~6.6，之后定容至1000 mL，在121℃、1.034×10⁵Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.2.3 枯草芽孢杆菌和异常汉逊酵母的LB培养基

胰蛋白胨10 g, 酵母5 g，NaCl 10 g，用800 mL蒸馏水溶解后调pH为7.0，之后定容至1000 mL，在121℃、1.034×10⁵Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.3 仪器设备

磁力搅拌器、旋涡混合仪、恒温培养箱、气浴振荡器、酸度计、电热恒温干燥箱、超净工作台、高压灭菌器、电子天平等。

1.2 试验方法

1.2.1 黄曲霉孢子悬液的制备

取活化过的黄曲霉毒素产生菌，取0.1~0.2 mL，将其涂布于黄曲霉毒素产生菌固体培养基上，28℃静止培养5天后收获。用5 mL的灭菌生理盐水（含体积分数0.05%的Tween 80）将平皿上的孢子冲下来，制成孢子悬液，然后将黄曲霉孢子悬液用多层纱布过滤以除去菌丝残体，将孢子浓度调整为1×10⁸CFU/mL，待用。

1.2.2 乳酪杆菌培养液及上清液、枯草芽孢杆菌培养液及上清液和异常汉逊酵母培养液及上清液的制备

按1%（v/v）的接种量在MRS培养基中接种乳酪杆菌，置于37℃恒温静止培养，待培养液的pH降低至约3.50时收获。乳酪杆菌培养液在3000转/分条件下离心，之后取上清液用0.20 μm滤膜过滤除菌，将过滤后的上清液置于4℃保存备用。

按1%（v/v）的接种量在LB培养基中接种枯草芽孢杆菌，置于37℃恒温振荡（150转/分）培养，待培养40 h时收获。枯草芽孢杆菌培养液在3000转/分条件下离心，之后取上清液用0.20 μm滤膜过滤除菌，将过滤后的上清液置于4℃保存备用。

按1%（v/v）的接种量在LB培养基中接种异常汉逊酵母，置于37℃恒温振荡（150转/分）培养，待培养40 h时收获。异常汉逊酵母培养液在3000转/分条件下离心，之后取上清液用0.20 μm滤膜过滤除菌，将过滤后的上清液置于4℃保存备用。

1.2.3 微生物培养

首先将黄曲霉毒素产生菌的孢子悬液按1%（v/v）的接种量分别接种在黄曲霉毒素产生菌液体培养基、LB培养基、MRS培养基中，28℃振荡（150转/分）培养5天，观察其在不同培养基中的生长情况及形态。结果表明黄曲霉毒素产生菌在黄曲霉液体培养基、LB培养基、MRS培养基中均能正常生长。

1.2.4 乳酪杆菌培养液及其上清液对黄曲霉毒素产生菌生长的抑制

MRS培养基中乳酪杆菌按1%（V/V）的接种量接种，黄曲霉孢子悬液按0.2% （V/V）的接种量接种，以只接种黄曲霉孢子悬液的MRS培养基为空白对照（每组三个重复），28℃恒温静止培养。

乳酪杆菌培养液上清液中黄曲霉孢子悬液按0.2%（v/v）的接种量接种，以只接种黄曲霉孢子悬液的MRS培养基为空白对照（每组三个重复），28℃恒温振荡（150转/分）培养。

1.2.5 枯草芽孢杆菌培养液及上清液对黄曲霉菌生长的抑制

LB培养基中枯草芽孢杆菌按1%（V/V）的接种量接种，黄曲霉孢子悬液按0.2%（V/V）的接种量接种，以只接种黄曲霉孢子悬液的LB培养基为空白对照（每组三个重复），28℃恒温振荡（150转/分）培养。

枯草芽孢杆菌培养液的上清液中，黄曲霉孢子悬液按0.2%（V/V）的接种量接种，以只接种黄曲霉孢子悬液的LB培养基为空白对照（每组三个重复），28℃恒温振荡（150转/分）培养。

1.2.6 异常汉逊酵母培养液及上清液对黄曲霉菌生长的抑制

LB培养基中异常汉逊酵母按1%（V/V）的接种量接种，黄曲霉孢子悬液按0.2%（V/V）的接种量接种，以只接种黄曲霉孢子悬液的LB培养基为空白对照（每组三个重复），28℃恒温振荡（150转/分）培养。

异常汉逊酵母培养液的上清液中，黄曲霉孢子悬液按0.2%（V/V）的接种量接种，以只接种黄曲霉孢子悬液的LB培养基为空白对照（每组三个重复），28℃恒温振荡（150转/分）培养。

1.2.7 复合益生菌（乳酪杆菌、枯草芽孢杆菌和异常汉逊酵母单独培养后再混合）对黄曲霉毒素产生菌生长的抑制

表1为实验因子、水平设计，A、B、C三种因素为三种益生菌的培养液（乳酪杆菌培养液在pH为3.3~3.5时收获，枯草芽孢杆菌培养液在培养40~48 h时收获，异常汉逊酵母在培养液培养40~48 h时收获）。三个水平为益生菌培养液的添加量（mL）。黄曲霉孢子悬液的接种量为0.2%（孢子浓度为1×10⁸CFU/mL），置于28℃恒温摇床中振荡(150转/分)培养120 h后收获。以菌丝重量为试验分析的指标（每个处理三个重复）。

具体组合（3×3的拉丁方设计）为：

1.3 测定指标

1.3.1培养液pH测定

待微生物培养至120 h时，用酸度计测定培养液的pH值。

1.3.2菌丝重量的测定

微生物培养至120 h时，用Whatman No. 4滤纸（孔径20 μm~25 μm）过滤培养液，过滤完毕后用蒸馏水冲洗菌丝，将过滤得到的菌丝连同滤纸放入玻璃平皿中置于65℃干燥箱中烘烤24 h（滤纸和平皿提前烘干恒重），之后将菌丝放入干燥器中恒重，将此作为黄曲霉菌丝重量。

1.4．数据处理

试验数据采用SAS 6.12软件进行统计分析，借助最小显著极差法对数据进行差异显著性检验。

2. 结果与分析

2.1 乳酪杆菌对黄曲霉菌生长的抑制研究

2.1.1 乳酪杆菌培养液及上清液对黄曲霉菌丝重量的影响

图1为乳酪杆菌培养液及其上清液对黄曲霉菌丝重量的影响（图中的全菌液即为培养液，下同），可以看出，三株乳酪杆菌培养液上清液的黄曲霉菌丝重量分别为0.1227 g、0.1196 g、0.1212 g，皆明显低于对照组的0.2283 g（P<0.05），菌丝重量分别降低了46.26%、48.05%、46.91%，且乳酪杆菌培养液上清液的菌丝重量显著低于相应的乳酪杆菌全菌液（P<0.05）；而乳酪杆菌与黄曲霉孢子悬液同时接种的各组，与仅接种黄曲霉孢子悬液的对照组相比菌丝重量差异均不显著。

2.1.2 乳酪杆菌培养液及上清液对培养液pH的影响

图2为乳酪杆菌培养液及其上清液对培养液pH的影响，可以看出，乳酪杆菌全菌液和培养液上清液的pH显著低于对照组（P<0.05），但乳酪杆菌培养液上清液的pH与乳酪杆菌全菌液的pH相比差异不显著。

2.2 枯草芽孢杆菌培养液及上清液对黄曲霉菌生长的抑制

2.2.1 枯草芽孢杆菌培养液及上清液对黄曲霉菌丝重量的影响

图3为枯草芽孢杆菌对黄曲霉菌丝重量的影响，可知，黄曲霉孢子悬液与枯草芽孢杆菌共同培养的各处理组菌丝的重量分别为0.2514 g、0.2288 g、0.1919 g、0.2059 g，显著低于对照组的0.4861 g（P<0.05），说明这四株枯草芽孢杆菌皆具有抑制黄曲霉生长的作用。四株枯草芽孢杆菌之间抑制作用差异不显著，以B3的抑制效果较好。

图4为枯草芽孢杆菌培养液上清液对黄曲霉菌丝重量的影响，可知，黄曲霉孢子与枯草芽孢杆菌培养液上清液共同培养的各处理组菌丝的质量分别为0.0556 g、0.0902 g、0.1510 g、0.2688 g，显著低于对照组的0.6983 g（P<0.05），说明这四株枯草芽孢杆菌上清液对黄曲霉生长皆有明显抑制作用。四株枯草芽孢杆菌上清液之间抑制作用差异不显著，以B1的抑制效果较好。

2.2.2 枯草芽孢杆菌培养液及上清液对培养液pH的影响

图5为枯草芽孢杆菌对培养液pH的影响，可以看出，与黄曲霉孢子共同培养的四株芽孢杆菌的pH与对照组相比差异不显著。

图6为枯草芽孢杆菌上清液对培养液pH的影响，可以看出，仅有B2培养液上清液的pH与对照组相比差异显著（P<0.05），四株枯草芽孢杆菌培养液上清液之间培养液pH差异不显著（P>0.05）。

2.3 异常汉逊酵母培养液及上清液对黄曲霉菌生长的抑制

2.3.1 异常汉逊酵母培养液及上清液对黄曲霉菌丝质量的影响

图7为异常汉逊酵母培养液及其上清液对黄曲霉菌丝重量的影响，可以看出，异常汉逊酵母培养液上清液的菌丝质量显著低于对照组（P<0.05）；而异常汉逊酵母培养液的菌丝质量则与对照组差异不显著。

2. 3.2 异常汉逊酵母菌培养液及培养液上清液对培养液pH的影响

图8为异常汉逊酵母培养液及其上清液对培养液pH的影响，可以看出，异常汉逊酵母培养液上清液的pH显著低于异常汉逊酵母全菌液的pH（P<0.05），但与对照组相比pH差异不显著，而异常汉逊酵母全菌液的pH与对照组的pH相比差异不显著。

2.3 复合益生菌（乳酪杆菌、枯草芽孢杆菌和异常汉逊酵母单独培养后再混合）对黄曲霉生长的抑制作用

表3为益生菌单独培养再混合对菌丝重量影响的极差分析，表4为益生菌单独培养再混合对菌丝重量影响的方差分析，从表3、表4的极差和方差分析结果可知，乳酪杆菌、枯草芽孢杆菌和异常汉逊酵母对霉菌菌丝重量的影响组间均值差异均不显著；三种益生菌的培养液最佳混合体积比为乳酪杆菌：枯草芽孢杆菌：异常汉逊酵母=2：1：2。

本发明复合益生菌对黄曲霉毒素的生物降解作用

1. 材料与方法

1.1 试验材料

参照“本发明复合益生菌对黄曲霉毒素产生菌的生长抑制作用”的相关内容。

1.2 试验方法

1.2.1 黄曲霉毒素产生菌的培养

黄曲霉孢子悬液制备方法同前述“本发明复合益生菌对黄曲霉毒素产生菌的生长抑制作用”的相关内容。取轻度粉碎玉米80 g (细度为0.5~3.0 mm)，装入250 mL三角瓶中，加水40 mL搅拌均匀，之后在121℃、1.034×10⁵Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min。冷却后接种黄曲霉孢子悬液2 mL，混合均匀后置于28℃培养箱中静止培养7 d后收获，置于65℃烘箱中烘干，之后粉碎过20目筛，避光保存备用。

1.2.2 黄曲霉毒素B1（AFB1）的提取

取本节1.2.1制得的样品40 g置于250 mL三角瓶中，加入5 g NaCl、甲醇：水溶液（V/V=6/4)120 mL，振荡30 min后，用定性滤纸过滤。滤液在250 mL分液漏斗中加入20 mL三氯甲烷振荡3 min后静止分层，放出下层三氯甲烷于蒸发皿中通风挥干。用20%甲醇-PBS溶液（20 mL甲醇与80 mL的PBS溶液混合均匀即可；PBS溶液的组成为：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na₂HPO₄ 1.42 g，KH₂PO₄ 0.27 g, 用900 mL蒸馏水溶解后调pH为7.0~7.4，定容至1000 mL）溶解并洗涤蒸发皿中浅黄色的凝结物，之后用0.20 μm的滤膜过滤除菌，分装于离心管中4℃避光保存备用。

1.2.3 微生物培养

1.2.3.1 乳酪杆菌对黄曲霉毒素B₁的降解

按0.5%（v/v）的接种量在100 mL MRS液体培养基中接种乳酪杆菌，之后加入过滤除菌后的黄曲霉毒素B₁约0.1 mL，使其在培养液中的浓度达到100 ppb，将其置于37℃的恒温培养箱中静止培养（每个处理三个重复）。

1.2.3.2 枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素B₁的降解

按0.5%（v/v）的接种量在100 mL LB液体培养基中接种枯草芽孢杆菌，之后加入过滤除菌后的黄曲霉毒素B₁约0.1 mL，使其在培养液中的浓度达到100 ppb，将其置于37℃的摇床中恒温振荡 (150转/分) 培养（每个处理三个重复）。

1.3 测定指标

1.3.1培养液pH测定

每隔24 h取样2 mL，用酸度计测定培养液的pH值。

1.3.2 培养液吸光度值的测定

每隔24 h取样2 mL，用分光光度计在600 nm波长下测定培养液的吸光度值。

1.3.3 细胞干重的测定

每隔24 h用移液器准确吸取混匀后的培养液1 mL置于烘干恒重的1.5 mL离心管中，之后13000转/分离心2 min，弃去上清液，将沉淀置于65℃烘箱中烘干至恒重。

1.3.4 黄曲霉毒素B₁含量测定

采用德国RIDASCREEN公司Aflatoxin B₁ 30/15酶联免疫测定试剂盒对黄曲霉毒素B₁含量进行测定。

1.4．数据处理

试验数据经Microsoft Excel初步整理后，运用SAS 6.12分析软件进行统计分析。

2. 结果与分析

2.1 不同培养时间对培养液细胞干重的影响

表5为不同培养时间对培养液细胞干重的影响（g/L），可以看出，12 h时，乳酪杆菌A2、枯草芽孢杆菌B1、B2的试验组的细胞干重显著高于其它各菌株（P<0.05），其中尤以乳酪杆菌A2细胞干重最大，说明其在高浓度的黄曲霉毒素中生长良好；枯草芽孢杆菌B3、B4的试验组与各自的对照组相比，细胞干重均显著较低，说明高浓度的黄曲霉毒素对菌株的生长有一定的抑制作用。24 h时，所有益生菌培养液中的细胞干重与不含黄曲霉毒素的对照组指标相似甚至高于对照组（P>0.05），说明这些益生菌在高浓度的黄曲霉毒素中生长良好。培养至72 h时仅有乳酪杆菌A2的试验组的细胞干重与对照组相比差异显著（P<0.05）。从整个培养周期来看，随着培养时间的延长，试验组与对照组细胞干重的差异逐渐变小。

2.2 不同培养时间对培养液吸光度值的影响

表6为不同培养时间对培养液吸光度值的影响，可知，12 h时，枯草芽孢杆菌B2、B3、B4的试验组的吸光度值与对照组相比差异均显著（P<0.05），且试验组的吸光度值均小于对照组；随着培养试验的延长，培养液的吸光度值逐渐开始增加，至96 h时各菌株试验组的吸光度值与对照组相比差异均不显著（P>0.05），说明随着培养时间的延长，高浓度黄曲霉毒素对个菌株的抑制作用逐渐减弱。

2.3 不同培养时间对培养液pH的影响

表7为不同培养时间对培养液pH的影响，可以看出，在12 h时，在培养液中添加黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌B2、B3、B4的试验组与对照组相比，pH差异均显著(P<0.05)，其中枯草芽孢杆菌B2培养液的pH显著低于对照组，且与其它组相比差异显著(P<0.05)。24 h时，几乎所有益生菌培养液中的pH与不含黄曲霉毒素的对照组指标相似（P>0.05），说明这些益生菌在高浓度的黄曲霉毒素中生长良好。随着培养时间的延长，枯草芽孢杆菌的pH逐渐升高，乳酪杆菌的pH逐渐降低，至96 h时，各菌株的试验组与对照组的pH差异均不显著(P>0.05)。

2.4 复合益生菌对黄曲霉毒素B1的降解作用

根据表3的试验结果得出，三种益生菌的培养液最佳混合体积比为乳酪杆菌：枯草芽孢杆菌：异常汉逊酵母=2：1：2。按此配比，加入过滤除菌后的黄曲霉毒素B1约0.1 mL，使其在培养液中的浓度达到51 ppb，将其置于37℃的摇床中恒温振荡 (150转/分) 培养（每个处理三个重复）。以培养0 h 的样品液作为对照组。图9为复合益生菌对黄曲霉毒素B1的降解作用，结果表明，当三种益生菌的培养液在加入黄曲霉毒素后，培养24~48 h时黄曲霉毒素含量最低（P<0.05），其中第48 h培养液中黄曲霉毒素含量为8.89 ppb，而培养0 h 的黄曲霉毒素含量为51.43 ppb，黄曲霉毒素的降解率达到82.71% (P<0.05)。

3. 结论

本试验在益生菌的液体培养基中添加高浓度的黄曲霉毒素(100 ppb)，通过测定培养液中益生菌细胞干重、吸光度值以及pH观察微生物的生长情况，从而初步判断其是否具有黄曲霉毒素降解能力。结果表明，含有高浓度黄曲霉毒素液体培养基，在接种益生菌培养24 h后，几乎所有益生菌培养液中的细胞干重、吸光度值和pH值与不含黄曲霉毒素的对照组指标相似（P>0.05），说明这些益生菌在高浓度的黄曲霉毒素B1中生长良好。通过复合益生菌对黄曲霉生长有抑制作用的研究，发现当乳酪杆菌培养液：枯草芽孢杆菌培养液：异常汉逊酵母培养液的体积比为2：1：2时其抑制作用最佳。按此益生菌配比，可使黄曲霉毒素的降解率达到82.71% (P<0.05)。

Claims

1.一种抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素的复合益生菌，其特征在于所述复合益生菌由乳酪杆菌培养液：枯草芽孢杆菌培养液：异常汉逊酵母培养液以1~3：1~3：1~3的体积比混合组成。

2.如权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于所述复合益生菌由乳酪杆菌培养液：枯草芽孢杆菌培养液：异常汉逊酵母培养液以2：1：2的体积比混合组成。

3.如权利要求1或2所述的复合益生菌，其特征在于：乳酪杆菌培养液由乳酪杆菌在MRS培养基中培养收获；枯草芽孢杆菌培养液、异常汉逊酵母培养液分别由枯草芽孢杆菌、异常汉逊酵母在LB培养基中单独培养收获。

4.如权利要求3所述的复合益生菌，其特征在于：MRS培养基中按1~5%的接种量接种乳酪杆菌，乳酪杆菌培养液在pH为3.3~3.5时收获；LB培养基中按1~5%的接种量接种枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌培养液在培养40~48 h时收获；LB培养基中按1~5%的接种量接种异常汉逊酵母，异常汉逊酵母培养液在培养40~48 h时收获；所述接种量以体积百分比计。

5.如权利要求1或2所述的复合益生菌在抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素中的应用。