CN106754481B - 从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法及相关培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法，包括以下步骤：(1)、制备细菌斜面固体培养基；(2)、制备冰菜植物样品；(3)、菌株平板涂布培养；(4)、菌株斜面培养；(5)、菌株分离；(6)、菌株稳定生长。此外，还涉及菌株培养中所需要的细菌斜面固体培养基及菌株生长中所需要的生长固氮培养基。本发明能提高耐盐菌株筛选的效率，不仅能够获得数量多且耐高盐的固氮菌株，而且增加了耐盐固氮菌株的种类，为盐渍化的土壤治理提供了良好的固定氮元素的生物菌株资源。

Description

从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法及相关培养基
技术领域
本发明属于筛选生物菌株用于改良盐渍化土壤的技术领域，尤其涉及一种耐高盐固氮菌株筛选的方法以及相关培养基。
背景技术
我国设施栽培的蔬菜主要密集于经济效益相对较高的果菜类作物。果菜类生产要求较高的水肥投入，随着栽培年限的增加，会导致土壤次生盐渍化、微生物区系失衡等问题。其中土壤盐渍化盐碱是制约农作物产量、品质和可持续发展的重要影响因素之一。盐渍化土壤在全世界广为分布，全世界盐碱地面积约9.5亿hm2，约占陆地总面积的7.6％。中国盐碱地面积约占全国耕地面积的20％。近年来，土壤盐渍化的问题日趋严峻。
利用生物学技术，如应用耐盐生物菌株改善盐渍化土壤的质量是目前亟待解决的热点问题。土壤微生物具有较强的恢复性，并且恢复盐渍化土壤中的微生物多样性是发挥和改良土壤功能的保证。因而获得良好的且能够适应于、存活于盐渍化土壤中的生物菌株则显得十分必要。但是，目前的耐盐菌株筛选方法的筛选效率低、筛选的菌株耐盐度低、且种类有限，难以满足盐渍化土壤治理需求。
鉴于现有技术的上述技术缺陷，迫切需要研制一种筛选用于改良盐渍化土壤的生物菌株的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种从冰菜(Mesembryanthemum crystallinum L.)中筛选耐高盐固氮菌株的方法及其相关培养基，其能提高耐盐菌株筛选的效率，不仅能够获得数量多且耐高盐的固氮菌株，而且增加了耐盐固氮菌株的种类，为盐渍化的土壤治理提供了良好的固定氮元素的生物菌株资源。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备细菌斜面固体培养基
按以下配方配制固氮培养基，并将配制的固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的固氮培养基灭菌25分钟，得到细菌斜面固体培养基，所述固氮培养基的成分为：葡萄糖10.0g、甘露醇3.0g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.01g、混合溶液10mL、氯化钠10.0g、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL；
(2)制备冰菜植物样品
a)取新鲜的冰菜样品，进行表面消毒，具体步骤如下：采用75％乙醇处理3～5min，之后用无菌水清洗3～5次，再用0.5％次氯酸钠处理5min，再使用无菌水清洗3～5次；
b)称取5g表面消毒后的冰菜样品，加入灭菌研钵中，并加入10mL无菌生理盐水，研磨成匀浆溶液A；
c)吸取所述匀浆溶液A1mL，加入9mL无菌生理盐水，振荡1分钟，得到10-1的稀释匀浆溶液B；
d)吸取所述稀释匀浆溶液B1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-2的稀释匀浆溶液C；
e)吸取所述稀释匀浆溶液C1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-3的稀释匀浆溶液D；
f)吸取所述稀释匀浆溶液D1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-4的稀释匀浆溶液E；
g)吸取所述稀释匀浆溶液E1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-5的稀释匀浆溶液F；
(3)分别吸取所述稀释匀浆溶液D、稀释匀浆溶液E和稀释匀浆溶液F各0.2mL，加入到所述细菌斜面固体培养基中进行平板涂布培养，并在25～28℃下培养4～5天；
(4)从步骤(3)的培养结果中挑取菌落，选择20～200菌落数的培养皿在所述细菌斜面固体培养基中进行斜面培养，并在25～28℃下培养4～5天；
(5)对步骤(4)的培养结果进行分离，得到耐高盐固氮菌株。
进一步地，其中，所述从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法进一步包括：
(6)、耐高盐固氮菌株的稳定生长
a)制备生长固氮培养基：按以下配方配制生长固氮培养基，并将配制的生长固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的生长固氮培养基灭菌25分钟，所述生长固氮培养基成分为：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠、混合溶液10mL、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL，并且，依据所述氯化钠的含量分别为10g、12g、15g、18g和21g而配制成多种不同的生长固氮培养基；
b)将所述步骤(5)得到的耐高盐固氮菌株依次在含有10g、12g、15g、18g和21g氯化钠的不同生长固氮培养基中进行培养，在每种生长固氮培养基中在25～28℃条件下培养4～5天，最终纯化获得的菌株即为耐高盐固氮菌株。
更进一步地，其中，所述固氮培养基和所述生长固氮培养基中的混合溶液的组分都为：硫酸亚铁0.001g、钼酸钠0.025g、三氯化铁0.05g、生物素0.05g，硫酸锰0.02g、硫酸铜0.008g，用蒸馏水定容至100mL，并且，定容后要用0.22μm滤膜过滤除菌才得所述混合溶液。
此外，本发明还提供一种培养耐高盐固氮菌株的细菌斜面固体培养基，其特征在于，按以下配方配制固氮培养基，并将配制的固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的固氮培养基灭菌25分钟，得到细菌斜面固体培养基，所述固氮培养基的成分为：葡萄糖10.0g、甘露醇3.0g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.01g、混合溶液10mL、氯化钠10.0g、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL；其中，所述混合溶液的组分为：硫酸亚铁0.001g、钼酸钠0.025g、三氯化铁0.05g、生物素0.05g，硫酸锰0.02g、硫酸铜0.008g，用蒸馏水定容至100mL，并且，定容后要用0.22μm滤膜过滤除菌才得所述混合溶液。
再次，本发明还提供一种耐高盐固氮菌株稳定生长用生长固氮培养基，其特征在于，按以下配方配制生长固氮培养基，并将配制的生长固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的生长固氮培养基灭菌25分钟，所述生长固氮培养基成分为：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠10～21g、混合溶液10mL、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL，其中，所述混合溶液的组分为：硫酸亚铁0.001g、钼酸钠0.025g、三氯化铁0.05g、生物素0.05g，硫酸锰0.02g、硫酸铜0.008g，用蒸馏水定容至100mL，并且，定容后要用0.22μm滤膜过滤除菌才得所述混合溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：
一、针对我国设施蔬菜栽培土壤次生盐渍化问题，筛选出了适合于盐渍化土壤施用的菌株。
二、通过本发明的培养基能够提高耐盐菌株的获得率，且通过本发明可显著提高菌株的耐盐能力，具体地：通过本发明，可分离获得的菌株最高耐盐浓度达到18～21％，筛选的菌株数量占可培养菌落的30～35％，经鉴别显示细菌的种类保持在5～6类。
三、本发明为盐渍化土壤质量的治理提供了良好的生物菌株资源。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，实施例的内容不作为对本发明的保护范围的限制。
本发明涉及从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法，其包括以下步骤：
首先，制备细菌斜面固体培养基。具体方法如下：
按以下配方配制固氮培养基，并将配制的固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的固氮培养基灭菌25分钟，得到细菌斜面固体培养基。其中，所述固氮培养基的成分为：葡萄糖10.0g、甘露醇3.0g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.01g、混合溶液10mL、氯化钠10.0g、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL。
优选地，所述混合溶液的组分为：硫酸亚铁0.001g、钼酸钠0.025g、三氯化铁0.05g、生物素0.05g，硫酸锰0.02g、硫酸铜0.008g，用蒸馏水定容至100mL，并且，定容后要用0.22μm滤膜过滤除菌才得所述混合溶液。
其次、制备冰菜植物样品。具体方法如下：
a)取新鲜的冰菜样品，进行表面消毒。具体步骤如下：采用75％乙醇处理3～5min，之后用无菌水清洗3～5次，再用0.5％次氯酸钠处理5min，再使用无菌水清洗3～5次。
其中，所述冰菜样品可以为从安徽合肥、阜南等不同地区采集的冰菜样品。为了更好地证明本发明的效果，优选地，可以从上述不同地区采集10种不同的冰菜样品，分别采用本发明的方法进行试验。
b)称取5g表面消毒后的冰菜样品，加入灭菌研钵中，并加入10mL无菌生理盐水，研磨成匀浆溶液A。
c)吸取所述匀浆溶液A1mL，加入9mL无菌生理盐水，振荡1分钟，得到10-1的稀释匀浆溶液B。
d)吸取所述稀释匀浆溶液B1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-2的稀释匀浆溶液C。
e)吸取所述稀释匀浆溶液C1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-3的稀释匀浆溶液D。
f)吸取所述稀释匀浆溶液D1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-4的稀释匀浆溶液E。
g)吸取所述稀释匀浆溶液E1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-5的稀释匀浆溶液F。
再次、进行菌株平板涂布培养。具体方法如下：
分别吸取所述稀释匀浆溶液D、稀释匀浆溶液E和稀释匀浆溶液F各0.2mL，加入到所述细菌斜面固体培养基中进行平板涂布培养，并在25～28℃下培养4～5天。
然后、进行菌株斜面培养。具体方法如下：
从上述的培养结果中挑取菌落，选择20～200菌落数的培养皿在所述细菌斜面固体培养基中进行斜面培养，并在25～28℃下培养4～5天。
之后，进行菌株分离。具体地，对上述的培养结果进行分离，得到耐高盐固氮菌株。
此外，为了提高菌株的质量，所述从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法可以进行包括耐高盐固氮菌株的稳定生长。其具体方法如下：
a)制备生长固氮培养基。具体方法如下：
按以下配方配制生长固氮培养基，并将配制的生长固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的生长固氮培养基灭菌25分钟。所述生长固氮培养基成分为：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠、混合溶液10mL、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL。并且，依据所述氯化钠的含量分别为10g、12g、15g、18g和21g而配制成多种不同的生长固氮培养基。
优选地，所述混合溶液的组分为：、硫酸亚铁0.001g、钼酸钠0.025g、三氯化铁0.05g、生物素0.05g，硫酸锰0.02g、硫酸铜0.008g，用蒸馏水定容至100mL，并且，定容后要用0.22μm滤膜过滤除菌才得所述混合溶液。
b)将上面得到的耐高盐固氮菌株依次在含有10g、12g、15g、18g和21g氯化钠的不同生长固氮培养基中进行培养，在每种生长固氮培养基中在25～28℃条件下培养4～5天，最终纯化获得的菌株即为耐高盐固氮菌株。
为了鉴定所培养的耐高盐固氮菌株的性质，需要对耐高盐固氮菌株进行鉴定。在本发明中，进行如下两种鉴定：
(1)、生理生化鉴定：将培养的菌株依次进行革兰氏染色等指标检测，其包括以下步骤(具体方法参见伯杰氏鉴定手册细菌部分Holt,J.G.,Kreig,N.R.,Sneath,P.H.A.,Staley,J.T.,Williams,S.T.,1994,Bergey's manu al of systematicbacteriology.Vol.1,9th Edn(Baltimore,MD:Williams&Wilkins),1935-2045)：
在无菌操作台内，挑取生长的菌落，涂片固定。草酸铵结晶紫染溶液染色1分钟，洗瓶水洗；加碘液覆盖涂面染约1分钟，水洗，用吸水纸吸去水分；加95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分；蕃红染色液染1分钟后，洗瓶水洗。自然干燥，显微镜下镜检，记录结果。结果显示，筛选获得的耐盐菌株均为革兰氏阳性菌。
(2)、耐高盐菌株的固氮基因的PCR扩增，其包括以下步骤(具体方法参见Mirza,B.,Welsh,A.,Rasul,G.,Rieder,J.,Paschke,M.,Hahn,D.,2009,Variation in Frank iaPopulations of the Elaeagnus Host Infection Group in Nodules of Six HostPlant Species after Inoculation with Soil.Microb Ecol 58,384-393和Tan,J.W.,Thong,K.L.,Arumugam,N.D.,Cheah,W.L.,Lai,Y.W.,Chua,K.H.,Rahim,R.A.,Vikineswary,S.,2009,Development of a PCR assay forthe detection of nifH andnifD genes in indigenous photosynthetic bacteria.Int.J.Hydrogen Energy 34,7538-7541。
a、液体培养基制备
按以下配方配制液体培养基，并将配制的液体培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的生长培养基灭菌25分钟。所述液体培养基成分为：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠10～21g、混合溶液10mL和蒸馏水1000mL。
优选地，所述混合溶液的组分为：、硫酸亚铁0.001g、钼酸钠0.025g、三氯化铁0.05g、生物素0.05g，硫酸锰0.02g、硫酸铜0.008g，用蒸馏水定容至100mL。
将制备好的液体培养基按照30mL体积，分装于250mL的三角瓶中，灭菌备用。
b、菌株培养
将活化的耐盐菌在操净台中，接入液体培养基中进行摇瓶培养，培养条件为：25～28℃、200转/分、培养2～3天，备用。
c、细菌DNA提取
采用SDS-蛋白酶K法，提取DNA，具体步骤如下：3500r/min离心10min，收集菌体，加入100μL溶菌酶悬浮细胞，室温30min；加入10％SDS 150μL，蛋白酶K10μL，37℃水浴30min，加入300ul 5mol/L醋酸钠混匀，冰浴5min；10000r/min离心10min，取上清，加入双倍体积预冷无水乙醇，离心，干燥沉淀，溶于100μL TE缓冲液，备用或-20℃保存。
d、固氮基因扩增
取上述细菌DNA，作为PCR模板。具体方法参见：((Mirza,B.,Welsh,A.,Rasul,G.,Rieder,J.,Paschke,M.,Hahn,D.,2009,Variation in Fra nkia Populations of theElaeagnus Host Infection Group in Nodules of Six Host Pla nt Species afterInoculation with Soil.Microb Ecol 58,384-393和Tan,J.W.,Thong,K.L.,Arumugam,N.D.,Cheah,W.L.,Lai,Y.W.,Chua,K.H.,Rahim,R.A.,Vikineswary,S.,2009,Developmentof a PCR assay forthe detection of nifH and nifD genes in indigenousphotosynthetic bacteria.Int.J.Hydrogen Energy 34,7538-7541)等报道的方法。PCR产物进行琼脂糖电泳，检测PCR产物。结果显示，筛选获得菌株具有固氮酶基因，说明筛选的菌株具有固氮能力。
本发明针对我国设施蔬菜栽培土壤次生盐渍化问题，筛选适合于盐渍化土壤施用的菌株。通过使用本发明的方法，可分离获得的菌株最高耐盐浓度达到18～21％，筛选的菌株数量占可培养固氮菌落的30～35％，经鉴别显示细菌的种类保持在5～6类。本发明的方法提高了目前对于耐盐菌株筛选的效率，不仅能够获得数量多且耐高盐的固氮菌株，而且增加了耐盐固氮菌株的种类，为盐渍化的土壤治理提供了良好的固定氮元素的生物菌株资源。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (2)

1.一种从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备细菌斜面固体培养基
按以下配方配制固氮培养基，并将配制的固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的固氮培养基灭菌25分钟，得到细菌斜面固体培养基，所述固氮培养基的成分为：葡萄糖10.0g、甘露醇3.0g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.01g、混合溶液10mL、氯化钠10.0g、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL；
(2)制备冰菜植物样品
a)取新鲜的冰菜样品，进行表面消毒，具体步骤如下：采用75％乙醇处理3～5min，之后用无菌水清洗3～5次，再用0.5％次氯酸钠处理5min，再使用无菌水清洗3～5次；
b)称取5g表面消毒后的冰菜样品，加入灭菌研钵中，并加入10mL无菌生理盐水，研磨成匀浆溶液A；
c)吸取所述匀浆溶液A 1mL，加入9mL无菌生理盐水，振荡1分钟，得到10-1的稀释匀浆溶液B；
d)吸取所述稀释匀浆溶液B 1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-2的稀释匀浆溶液C；
e)吸取所述稀释匀浆溶液C 1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-3的稀释匀浆溶液D；
f)吸取所述稀释匀浆溶液D 1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-4的稀释匀浆溶液E；
g)吸取所述稀释匀浆溶液E 1mL，加入9mL无菌生理盐水，得到10-5的稀释匀浆溶液F；
(3)分别吸取所述稀释匀浆溶液D、稀释匀浆溶液E和稀释匀浆溶液F各0.2mL，加入到所述细菌斜面固体培养基中进行平板涂布培养，并在25～28℃下培养4～5天；
(4)从步骤(3)的培养结果中挑取菌落，选择20～200菌落数的培养皿在所述细菌斜面固体培养基中进行斜面培养，并在25～28℃下培养4～5天；
(5) 对步骤(4) 的培养结果进行分离，得到耐高盐固氮菌株；
所述固氮培养基中的混合溶液的组分为：钼酸钠 0.025g 、硫酸亚铁 0.001g 、三氯化铁 0.05g 、生物素 0.05g ，硫酸锰 0.02g 、硫酸铜 0.008g ，用蒸馏水定容至 100mL ，并且，定容后要用0.22 μ m 滤膜过滤除菌才得所述混合溶液。
2.根据权利要求1所述的从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法，其特征在于，进一步包括：
(6)耐高盐固氮菌株的稳定生长
a)制备生长固氮培养基：按以下配方配制生长固氮培养基，并将配制的生长固氮培养基的pH值调整为7.0～7.2，之后，在压力为0.3Mpa、温度为115.0℃下对配制的生长固氮培养基灭菌25分钟，所述生长固氮培养基成分为：酵母浸提物0.1g、甘露醇15.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钾0.6g、硫酸钙0.2g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠、混合溶液10mL、琼脂15.0～20.0g和蒸馏水1000mL，并且，依据所述氯化钠的含量分别为10g、12g、15g、18g和21g而配制成多种不同的生长固氮培养基；
b)将所述步骤(5)得到的耐高盐固氮菌株依次在含有10g、12g、15g、18g和21g氯化钠的不同生长固氮培养基中进行培养，在每种生长固氮培养基中在25～28℃条件下培养4～5天，最终纯化获得的菌株即为耐高盐固氮菌株；
所述生长固氮培养基中的混合溶液的组分为：钼酸钠0.025g、硫酸亚铁0.001g、三氯化铁0.05g、生物素0.05g，硫酸锰0.02g、硫酸铜0.008g，用蒸馏水定容至100mL，并且，定容后要用0.22μm滤膜过滤除菌才得所述混合溶液。
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