CN117165478B

CN117165478B - 一株贝莱斯芽孢杆菌sl-k2、其生防制剂、姜酮醇类提取物的制备方法及应用

Info

Publication number: CN117165478B
Application number: CN202311133668.9A
Authority: CN
Inventors: 毛丽强
Original assignee: Qingdao Rishengyuan Crop Nutrition Co ltd
Current assignee: Qingdao Rishengyuan Crop Nutrition Co ltd
Priority date: 2023-08-25
Filing date: 2023-09-04
Publication date: 2024-05-31
Anticipated expiration: 2043-09-04
Also published as: CN117165478A

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌SL‑K2、其生防制剂、姜酮醇类提取物的制备方法及应用，该贝莱斯芽孢杆菌SL‑K2的保藏号为CGMCC 28155。该菌及其提取物对海棠枯萎病镰刀菌具有高抑制率，作为生防制剂具有很好的应用潜力。所述生防制剂，其活性成分包括前述贝莱斯芽孢杆菌SL‑K2的菌体、菌液、发酵滤液或其活性提取物。本申请还提供一种从贝莱斯芽孢杆菌SL‑K2中提取姜酮醇类提取物的制备方法，所述姜酮醇类提取物不仅具有对在马铃薯萎蔫病的新型病原菌—海棠枯萎病镰刀菌(Fusarium foetens)具有优良的抑菌功效，且对环境无污染，可被应用于制备微生物农药，用于防治海棠枯萎病镰刀菌引起的多种农作物的病害，具有很好的应用前景。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌SL-K2、其生防制剂、姜酮醇类提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物提取物技术领域，尤其涉及一株贝莱斯芽孢杆菌SL-K2、其生防制剂、姜酮醇类提取物的制备方法及应用。

背景技术

马铃薯是仅次于水稻、玉米和小麦的第四大作物。作为一种供人类食用的非谷物食品作物，马铃薯排名第一，为确保发展中国家的粮食安全起重大作用。在中国和印度约13亿人口以新鲜土豆为主食，真菌引起的病害一直是马铃薯种植中的一个严重问题。镰刀菌是马铃薯生产过程中造成产量和商业损失的最常见的土传病原体。马铃薯镰刀菌病害的防治策略，主要集中在化学杀菌剂、轮作和抗性品种的选育上。然而，由于病原菌致病性的快速分化、抗药性病原菌的增多，同时缺乏高抗性的优良品种，导致镰刀菌病害难以控制。近年来，使用细菌拮抗剂控制镰刀菌引起的植物萎蔫病起到了较好的效果，如枯草芽孢杆菌。

目前，山东及其他地区引起马铃薯镰刀菌病害的主要病原菌为海棠枯萎病镰刀菌(学名为：Fusarium foetens)，关于该新型病原菌的报道于2023年4月公开发表于国际期刊Journal of Fungi上文章名：《Mechanisms of Surfactin from Bacillus subtilis SF1against Fusarium foetens:ANovel Pathogen Inducing Potato Wilt》。这种目前广泛分布的病原菌对马铃薯的种植造成严重的减产，是需要主要进行防治的对象，但是目前市面上的绿色安全的细菌拮抗剂对该病原菌的防治效果不佳。

因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种新型贝莱斯芽孢杆菌SL-K2及其提取物的制备，该菌及其姜酮醇类提取物对海棠枯萎病镰刀菌具有高抑制率，作为生防制剂具有很好的应用潜力，可用于高效防治马铃薯镰刀菌病害。

为解决上述问题，本申请提供以下技术方案：

第一方面，本申请提供一株贝莱斯芽孢杆菌SL-K2，其保藏号为CGMCC 28155。

该贝莱斯芽孢杆菌是申请人在海阳市城市湿地公园近海河口处的淤泥中被分离纯化，并将其命名为贝莱斯芽孢杆菌SL-K2菌株，并于2023年8月11日在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行了保藏，保藏编号为CGMCC 28155。

该菌株为兼性好氧菌，革兰氏阳性，芽孢呈位于菌体的中间或偏端，产生芽孢时，菌体不膨大，菌体呈杆状。通过对该菌株的16S rDNA基因测序及分析，鉴定该菌株为一株新的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

第二方面，本申请还提供一种生防制剂，其活性成分包括前述贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的菌体、菌液、发酵滤液或其活性提取物。

可通过将贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的菌体、菌液、发酵滤液或其活性提取物直接或者与其他助剂、吸附物进行混合制备成液态或固态生防制剂，用于防治马铃薯镰刀菌病害。

优选地，所述生防制剂，还包括其他与贝莱斯芽孢杆菌SL-K2发挥互补或协同作用的其他生防菌，进一步扩大该生防制剂的抑菌范围。或者，还可加入杀虫剂，制成具有杀虫杀菌性能的综合型生防制剂。

第三方面，本申请还提供前述的贝莱斯芽孢杆菌或前述的生防制剂在防治马铃薯镰刀菌病害中的应用。

第四方面，本申请还提供一种贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的姜酮醇类提取物的制备方法，这是目前首次从贝莱斯芽孢杆菌中成功提取到姜酮醇类提取物，且申请人经过大量实验发现，该姜酮醇类提取物是贝莱斯芽孢杆菌SL-K2特异性表达。

在此之前，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，因在农业生产上有促进植物生长和抵御病原微生物的作用，具有广谱抗菌活性，是开发生物农药潜力较大的微生物之一。而其抑菌的研究集中于：抗菌蛋白、脂肽类抗生素和聚酮类抗生素聚酮类化合物等大分子物质，对其他500D以下除了氨基酸类之外小分子抑菌物质的研究几乎为空白。本申请首次发现贝莱斯芽孢杆菌除了产生大分子抑菌物质之外，还存在姜酮醇类小分子的抑菌物质。

具体地，上述姜酮醇类提取物的制备方法包括以下步骤：

S1、将前述贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的种子液接种至液体培养基中，震荡培养40～55h，摇床转速为120～200rpm/min，得到培养液；

优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌种子液的制备方法为：将贝莱斯芽孢杆菌的菌体接种于液体培养基中，于34～39℃震荡培养40～55h，得到种子液。

S2、将培养液离心后，去除菌体，保留发酵液上清；

S3、将发酵液上清进行烘干并研磨成粉，得到发酵液混合物干粉；

S4、采用索式萃取法，以乙醇作为溶剂对发酵液混合物干粉进行溶解和萃取，浸泡3～5h，回流6-8h后，得到初级提取液；

S5、对过滤后的初级提取液进行透析处理，去除500Da以上的大分子后，得到次级提取液；

S6、对次级提取液分别进行HPLC色谱纯化，分离得到1个精提物，该精提物即姜酮醇类提取物。

优选地，所述步骤S1中，采用的液体培养基包括以下质量百分比的各组分：

1～10％的浓度为10^3～10⁵/ml的海棠枯萎病镰刀菌小孢子灭活液、0.05～0.5％牛肉膏、0.1～1％蛋白胨、0.1～1％豆饼粉；0.5～3％玉米粉、0.05～0.3％CaCO₃；0.01～0.05％的MgSO₄，其余为水。优选地，所述海棠枯萎病镰刀菌小孢子灭活液的浓度为10^3～10⁵/ml。

进一步优选地，所述液体培养基包括以下质量百分比的各组分：采用的液体培养基包括以下质量百分比的各组分：5％的10⁴/ml的海棠枯萎病镰刀菌小孢子灭活液、牛肉膏0.1％、0.5％蛋白胨、豆饼粉0.5％；玉米浆1.0％；CaCO₃0.1％；MgSO₄ 0.03％其余为水。

可选地，所述制备方法中，海棠枯萎病镰刀菌小孢子灭活液的制备方法为：将海棠枯萎病镰刀菌的小孢子悬浮液在55～65℃处理20～40min，使孢子细胞形态保持完整，但失去萌发活性，从而制备得到灭活孢子液。

优选地，所述S6步骤中，采用的色谱柱为Hypersil GOLD C18柱，柱温为28-32℃。

优选地，所述的制备方法中，S6步骤中，采用乙腈-乙酸洗脱体系，洗脱剂中乙腈和酸的体积比依次为：0:3，1:9，14:90，13:5和19:5，次级提取液的流速为0.2ml/min。

此前姜酮醇类化合物主要采用化学合成法有：逆羟醛缩合法、仿生合成法、以噁唑衍生物为前体合成法。天然提取法有：聚酰胺法、超临界二氧化碳萃取分子精馏法等，周期长，成本高，价格昂贵，限制该类物质在农业生产中的应用。

本申请提供的上述制备方法是针对小分子非糖类提取物的性质所设计，不同于现有的贝莱斯芽孢杆菌提取物的繁琐提取方法，其操作简单易行，采用的萃取溶剂类型少，萃取剂采用乙醇，无毒，萃取步骤耗时短，提取效果好。

通过上述制备方法得到的小分子活性物质其分子量小于500，不仅具有很高的代谢稳定性，并且与多数药物兼容性好。一方面，由于分子量小，其绝大部分可由植物体直接吸收，吸收效率高，抑菌功能也可以快速起效；另一方面，相比于酯肽和多数抗生素类物质，上述分子量的小分子活性物质稳定性更高，具有优异的耐高温性能，持效期长。实际应用中，在大棚蔬菜生产过程中为了减少病虫害，加快植株残体分解，夏季农民经常采用高温闷棚的方式进行消毒，而大分子的活性物质和其他菌剂容易在高温闷棚后会失去活性而导致难以应用此环境，但是贝莱斯芽孢杆菌的芽孢耐高温，小分子提取物质不会失活，待温度下降后，芽孢会再次萌发出营养细胞恢复繁殖，延长菌剂的抑菌持效期。因此，上述提取的小分子活性物质相对现有的大分子抑菌剂具有更好的稳定性和活性及更长的持效期。

第五方面，本申请还提供上述贝莱斯芽孢杆菌在制备姜酮醇衍生物中的应用。可通过前述的制备方法利用贝莱斯芽孢杆菌SL-K2发酵液提取纯化得到姜酮醇衍生物提取物，该提取物是一种活性较高的提取物，相较于化工合成，具有绿色安全、无有机溶剂杂质的优点。

第六方面，本申请提供一种姜酮醇类提取物，其采用前述的制备方法制备得到。

经质谱检测发现，从贝莱斯芽孢杆菌SL-K2提取到的非糖类提取物的主要成分为姜酮醇类的衍生物，这是本领域首次从微生物体(贝莱斯芽孢杆菌)中提取到姜酮醇类衍生物，并发现姜酮醇类的衍生物类提取物具有优异的抑菌效果，其对导致马铃薯茎基腐烂病的新型病原菌--海棠枯萎病镰刀菌具有良好的抑菌功效，同时对导致冬小麦茎基腐病的病原菌—假禾谷镰刀菌也有良好的抑菌功效，可被应用于制备农用杀菌剂、抑菌药物。

第七方面，本申请还提供一种姜酮醇类提取物在防治土传植物病原菌病害中的应用。

该应用包括直接将上述姜酮醇类提取物作为主要活性成分制备成农用杀菌剂或抑菌药物，以及将其与其他杀菌杀虫活性成分复配形成复合农药制剂。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一株申请人自行筛选到的贝莱斯芽孢杆菌SL-K2，该菌及其提取物对山东省内导致马铃薯茎基腐烂病的新型病原菌-海棠枯萎病镰刀菌具有优异的抑菌功效，同时对导致冬小麦茎基腐病的病原菌—假禾谷镰刀菌也有良好的抑菌功效，可用于制备农用杀菌剂、抑菌药物等药剂，对防治马铃薯和冬小麦的茎基病具有很好的应用前景，为确保粮食生产安全具有重要的应用价值。

2、本申请首次提供一种从微生物(贝莱斯芽孢杆菌)提取姜酮醇类提取物的方法，该方法不仅操作简单易行，周期短，采用的萃取溶剂类型少，萃取剂采用乙醇，无毒，萃取步骤耗时短，提取效果好。此外，姜酮醇类提取物属于生物制剂对环境无污染，可被应用于制备微生物农药，用于防治海棠枯萎病镰刀菌引起的多种农作物的病害，具有很好的应用前景，并且充分开发了贝莱斯芽孢杆菌的应用价值，提高了贝莱斯芽孢杆菌的利用率。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌SL-K2对海棠枯萎病镰刀菌的抑菌结果；

图2为贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的菌落形态；

图3为贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的营养细胞电镜图；

图4为贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的芽孢形态电镜图；

图5为贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的无菌发酵液抑菌效果图；其中，左图为对照组，右图为实验组；

图6为采用病原菌孢子诱导后的SL-K2无菌发酵液抑菌效果图；其中，左图为对照组，右图为实验组；

图7为姜酮醇衍生物的色谱图；

图8为姜酮醇衍生物的正离子质谱图；其中，正离子M/Z为351.2521软件给出M+H的分子式为C₂₁H₃₅O₄；需要减H后为C₂₁H₃₄O₄；

图9为姜酮醇衍生物的负离子质谱图，其中，正离子M/Z为349.2040；软件给出M-H的分子式为C₂₁H₃₃O₄；需要加H后为C₂₁H₃₄O₄。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的分离及鉴定

一、菌株的分离与筛选

1.1实验方法：

采集海阳市城市湿地公园近海河口处的淤泥，放入无菌塑料袋，送进实验室进行实验，称取10g土壤(事先混合均匀处理)，加入90ml无菌水，在摇床上190r/min振荡15min，制成10^-1菌悬液，准备9支试管装入9ml无菌水，用微量记样器吸取10^-1菌悬液1ml注入第一支试管，此试管标注为10^-2，充分摇晃制成10^-2菌悬液，系列稀释为10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10菌悬液。分别从10^-2，10^-4，10^-6，10^-8，10^-10菌悬液吸取100μm，注入事先准备好的LB固体培养基中，用涂布棒涂抹均匀，放入37℃培养箱中培养1-2d。挑取培养特征相异的单个菌落，通过平板划线分离法进行纯化，将纯化后的菌株分别与海棠枯萎病镰刀菌进行拮抗实验。采用平板对峙法对拮抗菌进行筛选，最终观察两菌落之间是否出现抑菌带。

1.2结果与分析

如图1所示，分离出一株细菌对海棠枯萎病镰刀菌有很好的抑菌效果，对峙培养时，很好的阻止了海棠枯萎病镰刀菌的扩展，将该菌株命名为：SL-K2菌株。

二、SL-K2菌株形态拮抗菌菌体形态特征观察

2.1实验方法

(1)菌落外观的观察：将筛选得到的拮抗菌通过平板划线，在37℃恒温培养箱中培养24h，观察菌落形态特征参照《常见细菌系统鉴定手册》，革兰氏染色和生理生化特性分析参照《微生物学实验》。

(2)芽孢染色：挑取培养48h拮抗菌涂片，用饱和的孔雀绿水溶液染色10min，用自来水冲洗，然后再用番红染色液染色1min，水洗，用吸水纸吸干之后镜检。

2.2结果及分析

该菌株为兼性好氧菌，革兰氏阳性，芽孢呈位于菌体的中间或偏端，产生芽孢时，菌体不膨大，菌体呈杆状。从图2观察到，该菌株的菌落表面不透明，污白色或微黄色。在电镜下观察到，单个细胞长1.3～2.7微米，无荚膜(如图3)。芽孢长0.8～1.5微米，椭圆形，位于菌体中央或稍偏(图4)。

三、SL-K2菌株的分子生物学鉴定

3.1实验方法

将SL-K2菌株送往擎科生物公司进行测序，将得到的16SrDNA基因的测序序列在NCBI网站进行BLAST比对，菌种鉴定分析过程如下：

(1)DNA提取：使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)(货号：TSP101)对SL-K2菌株的基因组进行提取。

(2)PCR扩增：用菌种鉴定通用引物对上一步获得的基因组进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物条带是否与目的大小相符，是否单一，有无拖带。

(3)PCR产物测序：PCR产物检测合格后，切割目的条带进行纯化回收，用回收后的产物进行Sanger测序。

(4)测序结果比对分析：将Sanger测序结果用软件ContigExpress进行拼接，并去除两端不准的部分；将批量对拼接序列在核酸数据库找那个进行比对分析。其中，核酸数据库选择最新版本的nt库，通过与nt库进行blastn比对，即可得到同源序列的AccessionNumber号及物种鉴定和注释。

3.2实验结果及分析

根据SL-K2菌株的16SrDNA基因序列(见序列表中SEQ ID NO:1)的分析及比对结果鉴定可知，SL-K2菌株是一株新的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

实施例2SL-K2菌株对海棠枯萎病镰刀菌的抑菌效果

1、无菌滤液的抑菌活性

(1)实验方法：

①菌株无菌滤液的制备：

将SL-K2菌株转接到装有5ml液体LB的试管中，在28℃、130r/min条件下培养24h，吸取1ml菌液移入装有100ml LB培养液的250ml三角瓶中，37℃、130r/min条件下培养72h，然后将上述发酵液在10000r/min的离心机上离心15min，取离心后的上清液，用孔径0.22μm滤膜过滤，得到无菌滤液。

②无菌滤液抑菌效果的测定：

吸取0.1ml无菌滤液均匀涂布在PDA平板上，然后在平板中心放置直径为6mm的致病菌-海棠枯萎病镰刀菌菌饼，对照组涂布等体积的无菌水后放置相同直径的致病菌菌饼；同时用农业生产中防治镰刀菌病害，常用的化学复配农药甲.嘧.甲霜灵(世科姆公司提供)-300倍液0.1ml涂布于PDA平板上作为抑菌效果过的对比，在25℃培养箱中培养7天，观察并记录对照组和实验组致病菌菌饼的直径大小。对照及处理都重复三次；抑菌率的计算方法：抑制率％＝((D1-D2)/D1)×100％，其中，D1：对照组，D2：各实验组。

(2)实验结果及分析

表1平板上病原菌菌落直径(cm)

从表1和图5的结果可知，可以看出SL-K2菌株无菌发酵液的抑菌效果5不理想，比目前农业常用的化学药剂甲.嘧.甲霜灵的防治效果差。分析SL-K2菌株无菌发酵液的抑菌效果不理想的原因可能在于：微生物在培养条件良好时，药用产物基因常会沉默不表达。

2、SL-K2菌株的优化处理后的发酵液对海棠枯萎病镰刀菌的抑菌效果

为了增加SL-K2菌株对抗海棠枯萎病镰刀菌的抑菌产物的表达，申请人通过对SL-K2菌株的发酵培养基成分进行了大量实验和长时间的优化后发现，将灭活孢子液加入培养基中诱导SL-K2菌株抗菌代谢产物的产量提升是较为有效的方法。用病原菌的孢子灭活液(如采用巴斯德消毒法)不仅保持其孢子形态的完整性，有效诱导该菌株SL-K2抑菌代谢产物基因的表达量的显著提升，并且避免该病原菌的传播。

本实验采用上述方法对SL-K2菌株进行诱导后制备发酵液再进行海棠枯萎病镰刀菌的抑菌效果的测试。

(1)实验方法

①SL-K2菌株优化发酵液的制备

A、优化后的培养基的制备：

培养基配方为：牛肉膏0.1％、0.5％蛋白胨、豆饼粉0.5％；玉米浆1.0％；CaCO₃0.1％；MgSO₄ 0.03％其余为水。

B、海棠枯萎病镰刀菌小孢子灭活液的制备：

将棠枯萎病镰刀菌的小孢子用无菌水从菌丝表面洗下，在60℃条件下处理30min，使孢子失去活性，制备灭活孢子液，用血球计数板计数将孢子悬浮液浓度调整到10⁴/ml。

C、将上述配置好的培养基进行灭菌后，待其冷却至60℃以下，将上述孢子灭活液(在培养基中的质量百分浓度为5％，孢子浓度为10⁴/ml)加入到该培养基中混匀，并将SL-K2菌液接种至混合后培养基中。

②指示菌的培养：

将海棠枯萎病镰刀菌和假禾谷镰刀菌接种于PDA固体培养基后，于28℃培养7天备用。

③样品组的设置：

按照以下方法分别设置实验组和对照组，每组设置至少3个重复：

实验组1：将经过病原菌--镰刀菌孢子诱导处理的SL-K2菌株的发酵液作为样品；

实验组2：与实验组1方法基本相同，仅省去镰刀菌孢子诱导处理步骤。

对照组：进在PDA中加等量无菌蒸馏水。

将各实验组的样品分别加入无菌蒸馏水溶解，配置成10mg/ml的溶液，经0.22μm无菌滤膜过滤。

④抑菌活性测定

将海棠枯萎病镰刀菌和假禾谷镰刀菌接种于PDA固体培养基，在25℃恒温培养箱中培养7天。7天后用打孔器达成0.5cm的菌饼备用，两个病原菌抑菌实验中，2种病原菌菌饼分别放入涂布有100uL各种样品和对照物质溶液的PDA固体平板上；各组重复三次，置于恒温培养箱中倒置培养5天后取出平板。对实验组和对照组的平板，分别采用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，取数值平均值，抑菌率的计算方法：抑制率％＝((D1-D2)/D1)×100％，其中D1：对照(只加入等量无菌水)，D2：上述实验组1或实验组2。

(2)实验结果及分析

表2抑菌率测试结果

从表2的上述抑菌测试结果可知，未经过病原菌孢子诱导的实验组2，其抑菌测试结果远不如实验组1。SL-K2菌株的很多抑菌活性成分是在病原菌诱导条件下才能表达，没有病原菌的诱导不表达或表达量低。因此，在培养基中加入的灭活的病原菌孢子液可有效诱导SL-K2菌株抗菌代谢产物的产量提升，是影响该菌发酵液的抑菌活性的重要因素。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌的非糖类提取物的制备

本实施例分别设置实验组和对照组，实验组按照以下步骤进行操作，而对照组采用的提取材料和步骤与实验组都相同，不同之处仅在于省去海棠枯萎病镰刀菌孢子诱导处理步骤。

1、实验方法

(1)培养基配置

液体培养基配方：5％的10⁴/ml的海棠枯萎病镰刀菌小孢子灭活液、牛肉膏0.1％、0.5％蛋白胨、豆饼粉0.5％；玉米浆1.0％；CaCO₃ 0.1％；MgSO₄ 0.03％其余为水。

海棠枯萎病镰刀菌小孢子灭活液的制备方法：将棠枯萎病镰刀菌的小孢子60℃处理30min，使孢子细胞形态保持完整，但失去萌发活性，制备灭活孢子液。该灭活液中的孢子失去萌发活性，不会产生毒素，但是能诱导贝莱斯芽孢杆菌产生抗菌物质。

(2)贝莱斯芽孢杆菌的培养和发酵

将贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的菌丝体接种于50ml上述液体培养基中，于37℃下以150rpm/min摇床培养48h后得到种子液，将种子液按照8％的接种量接种于300ml的上述液体培养基中，于37℃下以150rpm/min摇床培养48h，得到发酵液。

上述培养过程中，镰刀菌灭活孢子的加入诱导起到诱导贝莱斯芽孢杆菌表达抑菌物质(目标产物)的作用。

(3)发酵液干粉的制备

将病原菌孢子诱导培养后的发酵液进行离心，将菌体和发酵液分开后除去菌体，将发酵液上清在干燥箱中进行50℃通风干燥，将干燥后的混合物研磨成粉，从而得到发酵液的干粉。其他实施例中，也可采用冻干工艺得到发酵液冻干粉，效果相当，而烘干工艺的加工效率更高，更适用于大规模生产。

(4)活性成分的提取

利用索式萃取法，以色谱级乙醇作为溶剂对上述干粉进行溶解和萃取，浸泡4h，回流6h后，得到初级提取液，再使用滤纸进行过滤，去除沉淀。

(5)对初级提取液的透析处理

取一段透析袋，截留分子量为500Da，将一端用棉绳扎死，从另一端加入5ml初级提取液，并进行封口，使透析袋悬于盛有蒸馏水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌促进溶液交换，直至透析平衡为止。经过上述透析处理后，将初级提取液中的多糖分子进行去除，得到次级提取液。

(6)色谱纯化处理

对次级提取液进行高效液相色谱纯化处理，使用的是Hypersil GOLD C18柱(2.1×100mm,5μm；Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)，柱温为30℃，次级提取液以0:3，1:9，14:90，13:5和19:5，以0.2ml/min的流速在两维的纳米液相系统进行。洗脱过程中，洗脱液A采用乙酸，洗脱剂B为乙腈洗脱体系，色谱保留时间9.6-9.8min，最终纯化得到贝莱斯芽孢杆菌乙醇精提物。

(7)质谱分析

对上述贝莱斯芽孢杆菌乙醇精提物进行质谱分析，电喷雾质谱分析在50-1500m/z的核质比范围内进行正离子和负离子全扫描，氮气作为雾化气体，流速为6L/min；温度为180℃；压力为1.0Bar，数据采集和处理使用随仪器提供的LC/MS数据分析软件(版本4.1)。对应于特定的元素组成的核质比数据使用随仪器提供的公式预测软件来计算。要求测量出的核质比与物质的标准核质比之间的误差不超过5ppm。

2、实验结果及分析

贝莱斯芽孢杆菌乙醇精提物的色谱图结果见图7，其正离子质谱图谱和负离子谱图谱分别见图8和图9。

其中，通过对正离子质谱图谱的分析，得知最大峰为分子离子峰，其M/Z值为351.2521，核质比与物质的标准核质比之间的误差为2.4ppm，仪器提供的LC/MS数据分析软件(版本4.1)给出唯一的分子式为C₂₁H₃₄O₄(正离子减氢即C₂₁H₃₅O₄减H后为C₂₁H₃₄O₄)。

同时负离子谱图谱的分析给出分子式也是C₂₁H₃₄O₄(负离子加氢即C₂₁H₃₃O₄加H后为C₂₁H₃₄O₄)。而且正负离子的的物质信号的保留时间都在9.5-9.8min内，结合分析其他碎片离子峰，最终得到：该化合物C₂₁H₃₅O₄，包含：一个苯环、2个羟基，一个甲氧苯基，一个十四烷-酮链，结合与10-姜酮醇标的准品比对，可推知该化合物为10-姜酮醇衍生物。

从上述质谱图谱分析结果可知，贝莱斯芽孢杆菌乙醇精提物的主要成分为10-姜酮醇衍生物，分子式为C₂₁H₃₄O₄，这是首次从贝莱斯芽孢杆菌中分离得到一种姜酮醇衍生物。

而对照组的精提物中未发现化合物C₂₁H₃₅O₄，这说明：不经过病原菌-海棠枯萎病孢子的诱导处理，该贝莱斯芽孢杆菌SL-K2未表达上述化合物。

实施例4贝莱斯芽孢杆菌非糖类提取物的抑菌实验

1、实验方法

(1)指示菌的培养：

将海棠枯萎病镰刀菌和假禾谷镰刀菌接种于PDA固体培养基后，于28℃培养7天后将孢子用无菌生理盐水从菌丝表面冲洗下来制成孢子悬液，用血细胞计数板计数调整浓度至106/ml，备用。

(2)样品组的设置：

①实验组1：按照实施例3的完整实验步骤制备出前述的贝莱斯芽孢杆菌乙醇精提物，将其作为样品；

②实验组2：将经过发酵、病原菌--镰刀菌孢子诱导处理的发酵液离心去除菌体，过分子筛除去500D以上(与精提物的前处理步骤)的物质作为样品(具体操作方法参照实施例3的对应步骤)；

③实验组3：与实验组2方法基本相同，仅省去SL-K2培养过程中镰刀菌孢子诱导处理步骤，离心去除菌体，过分子筛除去500D以上的物质(与精提物前处理过程相同)作为试验样品(具体操作方法参照实施例3的对应步骤)。

④对照组：仅在PDA中加等量无菌蒸馏水。

(3)抑菌活性测定方法

将海棠枯萎病镰刀菌和假禾谷镰刀菌分别接种于PDA固体培养基中培养7天后，用打孔器达成0.5cm的菌饼备用，两个病原菌抑菌实验中，2种病原菌菌饼分别放入涂布有前述各实验组的100uL各样品或对照物质溶液的PDA固体平板上。各组重复三次，置于恒温培养箱中倒置培养5天后取出平板。对实验组和对照组的平板，分别采用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，取数值平均值。

抑菌率的计算方法：抑制率％＝((D1-D2)/D1)×100％，其中，D1：对照组，D2：各实验组。

2、实验结果及分析

表3各实验组的抑菌率测试结果

(1)从上述表3的抑菌测试结果可知，实验组1的贝莱斯芽孢杆菌乙醇精提物对海棠枯萎病镰刀菌和假禾谷镰刀菌均具有优异的抑菌活性。

(2)未经过病原菌孢子诱导的实验组3的抑菌测试结果远不如实验组1和2，这说明乙醇精提物抑菌活性成分是在病原菌孢子诱导条件下表达，没有病原菌的诱导，该基因不表达，灭活的病原菌孢子也就有诱导该基因表达的功能，是重要的实验步骤。

(3)实验组2的抑菌率高于实验组1，说明本发明的乙醇精提物的提取方法的提取效果好，乙醇精提物抑菌成分的提取率高，其抑菌活性高。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SL-K2，其特征在于，其保藏号为CGMCC28155。

2.一种生防制剂，其特征在于，活性成分包括如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的发酵液。

3.如权利要求2所述的生防制剂在抑制海棠枯萎病镰刀菌和假禾谷镰刀菌中的应用。

4.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌SL-K2在制备姜酮醇衍生物中的应用，所述姜酮醇衍生物为10-姜酮醇。

5.一种贝莱斯芽孢杆菌的姜酮醇类提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌SL-K2的种子液接种至液体培养基中，震荡培养40~55h，摇床转速为120~200rpm/min，得到培养液；

S2、将培养液离心后，去除菌体，保留发酵液上清；

S4、采用索式萃取法，以乙醇作为溶剂对发酵液混合物干粉进行溶解和萃取，浸泡3~5h，回流6-8h后，得到初级提取液；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，液体培养基包括以下质量百分比的各组分：

1~10%的浓度为10⁴/ml的海棠枯萎病镰刀菌小孢子灭活液、0.05~0.5%牛肉膏、0.1~1%蛋白胨、0.1~1%豆饼粉；0.5~3%玉米浆；0.05~0.3%CaCO₃；0.01~0.05%的MgSO₄，其余为水。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，海棠枯萎病镰刀菌小孢子灭活液的制备方法为：将海棠枯萎病镰刀菌的小孢子悬浮液在55~65℃处理20~40min，使孢子细胞形态保持完整，但失去萌发活性，从而制备得到灭活孢子液。