CN116004429A - 一种用于防治苹果腐烂病的生防菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明中公开了一种用于防治苹果腐烂病的生防菌株，所述生防菌株为节杆菌HC6‑18，于2022年06月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25052。本发明中的节杆菌HC6‑18能够有效防控苹果腐烂病菌(C.mali QH2)，节杆菌HC6‑18与贝莱斯芽孢杆菌L‑1按等比例复配后制成复合菌株组合物，可以进一步提高对苹果腐烂病的防治效果，其复配后在菌液浓度为OD600＝0.8时，对苹果腐烂病的防效可达到100％，高于1000倍三唑酮药剂处理的效果，显著提高对苹果腐烂病的防治效果。

Description

一种用于防治苹果腐烂病的生防菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种用于防治苹果腐烂病的生防菌株及其应用。

背景技术

苹果树腐烂病(Apple Valsa canker)是由苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabeet Yamada)侵染引起的一种严重苹果树病害，又称臭皮病、烂皮病。目前对苹果树腐烂病的防治方法中一般采用刮除病斑及周围无症状组织中潜伏侵染的病原菌，同时配合戊唑醇、烯唑醇、菌毒清、瑞拉菌素等药剂涂抹或者喷施患病部位。虽然该方法对苹果树腐烂病的防治起到了一定的作用，但是，刮除法费时费力，而且化学药剂具有容易产生抗药性、造成人畜中毒和环境污染的缺点。因此，寻找持效、低毒、环境友好型的防治方法成为苹果树腐烂病防治的发展趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于防治苹果腐烂病的生防菌株及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于防治苹果腐烂病的生防菌株，所述生防菌株为节杆菌HC6-18，于2022年06月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25052。

优选地，所述生防菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。

本发明同时提供上述生防菌株在制备苹果腐烂病的生防制剂中的应用。

本发明还提供一种包含上述生防菌株的菌株组合物。

优选地，所述菌株组合物还包括解淀粉芽孢杆菌L-1。

优选地，所述生防菌株和解淀粉芽孢杆菌L-1复配比例为1:1。

本发明所具有的有益效果：本发明中的生防菌株为节杆菌HC6-18，能够有效防控苹果腐烂病菌(C.mali QH2)，生防菌株与解淀粉芽孢杆菌L-1按等比例复配后制成复合菌株组合物，可以进一步提高对苹果腐烂病的防治效果，其复配后在菌液浓度为OD600＝0.8时，对苹果腐烂病的防效可达到100％，高于1000倍三唑酮药剂处理的效果，显著提高对苹果腐烂病的防治效果。

附图说明

图1为菌株HC6-18的产嗜铁素(A)、解钾(B)和产ACC脱氨酶活性(C)皿内测定结果图；

图2为菌株HC6-18在LB培养基上的形态特性图(左侧图)及扫描电镜观察图(右侧图)；

图3为菌株HC6-18的16S rRNA序列构建进化树图谱；

图4为解淀粉芽孢杆菌L-1、菌株HC6-11及菌株组合物对苹果腐烂病在枝条上的抑制活性图。

本发明中的节杆菌HC6-18保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期为：2022年06月10日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.25052；分类命名为：节杆菌(Arthrobacter sp.)。

本发明中的解淀粉芽孢杆菌L-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期为：2017年06月30日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.14373；分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1菌株分离、筛选及促生活性测定

1.土壤样品采集及菌株分离和筛选

从陕西省韩城市矿场(N°35.48，E°110.44)采集土壤样品。利用逐级稀释法分离土壤中的细菌，将形态差异明显的单个菌落在改良高氏一号培养基上进行纯化和培养。将分离得到的菌株接种于CAS固体培养基(产嗜铁素)、解钾培养基上，在28℃培养3-5天，分离筛选出菌株周围出现黄色或无色透明晕圈的菌株，说明其具有产嗜铁素、解钾能力。量取其菌落直径(d)和透明圈直径(D)，计算D/d。

将分离得到的菌株接种于DF固体培养基上，培养3-4d，选取在DF培养基上可以正常生长的菌株继续转接到ADF培养基上，观察菌株是否生长，每个菌株重复三次，放置在28℃培养箱中培养。在以ACC作为唯一氮源的ADF培养基上，产ACC脱氨酶的菌株可以正常生长，而不合成ACC脱氨酶的菌株则无法生长。最终分离筛选出一株具有促生活性的菌株，命名为HC6-18。结果如附图1所示，菌株HC6-18具有产嗜铁素(A)、解钾能力(B)，其在CAS培养基上的D/d为1.79，解钾培养基上的D/d为2.0，在以ACC为唯一氮源的培养基上能够正常生长(C)，以上试验数据说明菌株HC6-18有产嗜铁素、解钾活性、产ACC脱氨酶活性。

2.菌株鉴定

将步骤1分离得到的菌株HC6-18在LB固体培养基上划线培养，28℃培养24h，观察菌落形状、透明度及菌落颜色等菌落特征。使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒对菌株DNA进行提取。使用通用引物7F和1492R对菌株HC6-18的16S rRNA序列进行PCR扩增，通用引物7F和1492R的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。反应体系如下：2×M5 Hipper超光速Mix 10μL，ddH₂O7μL，DNA模板1μL，上下游引物各1μL；反应条件：94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃90s，30个循环；72℃10min。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(SK8131)回收目的条带，送交上海生工测序。使用Vector NTIAdvance 11软件将测序结果进行校正和拼接，用BLASTn对拼接的序列进行同源序列检索，确定其分类地位。

结果如图2和图3所示，图2为HC6-18在LB培养基上的形态特性(左侧图)及扫描电镜观察图(右侧图)，菌株HC6-18在LB培养基上呈现典型的细菌菌落形态，菌落浅黄色；扫描电镜观察菌体呈不规则杆状，有些杆状从中间断裂为球状或短杆状，大小为0.4～0.48μm×0.79～1.25μm。图3为利用16S rRNA序列构建进化树，菌株HC6-18的16S rRNA序列与节杆菌属Arthrobactersp.的一致性达到99.93％，形态学结合分子序列确定HC6-18为节杆菌。

实施例2复合菌株组合物对苹果腐烂病的活体防效

解淀粉芽孢杆菌L-1分离自兴城果树资源圃的梨树根际土壤中，已于2017年06月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14373。

苹果腐烂病菌(C.mali QH2)分离自内蒙古呼和浩特市谦和果园感染了苹果树腐烂病的‘金红’树，保藏于内蒙古农业大学园艺与植物保护学院果树病害病原生物学及综合防控研究室，保藏编号为QH2。

复合菌株组合物的制备方法如下：将解淀粉芽孢杆菌L-1与HC6-18分别接种于LB液体培养基中，28℃，180r/min摇床上振荡24h。无菌蒸馏水调整OD600为0.8，分别制得解淀粉芽孢杆菌L-1与HC6-18的菌液；将解淀粉芽孢杆菌L-1与菌株HC6-18的菌液等比例混合制成菌株组合物。

分别测定解淀粉芽孢杆菌L-1、菌株HC6-18及复合菌株组合物(解淀粉芽孢杆菌L-1与菌株HC6-18等比例混合菌液)的防效，以三唑酮可湿性粉剂1000倍液为药剂对照，以只接种C.mali QH2的作为阳性对照，以不接种的枝条作为阴性对照。具体测定方法如下：

将健康苹果树枝条切成10cm长，于0.1％次氯酸钠浸泡5min，酒精浸泡3min，用无菌水冲洗3次，风干后，两端用石蜡封紧。用直径6mm的钉帽烫伤树皮后用待测定菌液(解淀粉芽孢杆菌L-1、菌株HC6-18或复合菌株组合物)浸泡枝条30s，将苹果腐烂病病原菌(C.mali QH2)的菌饼(直径6mm)放置在焦痕的上方，并用湿润的无菌吸水棉和保鲜膜包住接种部位，以不接种菌饼的枝条为对照将枝条放入容器中，保持湿度放入25℃的恒温光照培养箱中保湿培养，菌株在恒温培养箱中28℃培养10d后将敷于果枝上方的菌饼去掉观察发病情况，并测量病斑长度。防治效果(％)＝[1–(处理病斑直径/对照病斑直径)]×100％。

结果如图4和表1所示，当接种菌液OD600为0.8时，解淀粉芽孢杆菌L-1对C.maliQH2在枝条上的抑制率为85.75％；菌株HC6-18的抑制率为64.13％；解淀粉芽孢杆菌L-1与菌株HC6-18等比例混合形成的菌株组合物的抑制率达到100％，显著高于药剂防控效果。

表1解淀粉芽孢杆菌L-1、菌株HC6-18及菌株组合物对苹果腐烂病的防治效果

注：*不同字母表示在P＝0.05水平差异显著

综上所述，本发明中解淀粉芽孢杆菌L-1与菌株HC6-18等比例复配后制成的复合菌株组合物，在菌液浓度为OD600＝0.8时对苹果腐烂病的防效可达到100％，高于药剂(三唑酮)1000倍的处理，显著提高对苹果腐烂病的防治效果，可广泛用于制备苹果腐烂病防治的生物制剂，在苹果生产种植中具有广泛的应用前景。

本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于防治苹果腐烂病的生防菌株，其特征在于，所述生防菌株为节杆菌(Arthrobactersp.)HC6-18，于2022年06月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25052。

2.根据权利要求1所述的生防菌株，其特征在于，所述生防菌株的16SrRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1或2所述生防菌株在制备苹果腐烂病的生防制剂中的应用。

4.一种菌株组合物，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的生防菌株。

5.根据权利要求4所述的菌株组合物，其特征在于，所述菌株组合物还包括解淀粉芽孢杆菌L-1。

6.根据权利要求5所述的菌株组合物，其特征在于，所述生防菌株和解淀粉芽孢杆菌L-1复配比例为1:1。

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