CN115029280A - 一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其应用 - Google Patents

一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115029280A
CN115029280A CN202210739622.0A CN202210739622A CN115029280A CN 115029280 A CN115029280 A CN 115029280A CN 202210739622 A CN202210739622 A CN 202210739622A CN 115029280 A CN115029280 A CN 115029280A
Authority
CN
China
Prior art keywords
burkholderia gladioli
strain
fusarium wilt
bacteria
burkholderia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210739622.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115029280B (zh
Inventor
李亚莉
侯栋
岳宏忠
张东琴
沈永强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vegetable Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences
Original Assignee
Vegetable Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vegetable Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences filed Critical Vegetable Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences
Priority to CN202210739622.0A priority Critical patent/CN115029280B/zh
Publication of CN115029280A publication Critical patent/CN115029280A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115029280B publication Critical patent/CN115029280B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P3/00—Fungicides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/20—Fertilizers of biological origin, e.g. guano or fertilizers made from animal corpses

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1‑3，其保藏编号为CCTCC NO:M 2021558。本发明还提供其在防治作物土传病害、促进作物生长中的应用。本发明的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1‑3及其微生物菌肥对连作土壤的修复及土传病害的防治，作物持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。

Description

一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物学和植物病害生防技术领域，具体涉及一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20 L1-3及其应用。
背景技术
黄瓜枯萎病是由尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum Owen)引起的一种土传病害，分布广泛，在我国各种植区均有发生。此菌通过土壤、农事操作等传播，从根茎部或根系侵入，在维管束内寄生的系统性病害。尖孢镰孢菌有很强的隐蔽性，对不良环境有较强的抵抗力，在土壤中可存活5-6年甚至10年以上，在温湿度适宜条件下，能快速繁殖，使病害发生。该病一旦发生，将产生严重的经济损失，因此黄瓜枯萎病的防治一直备受人们的关注。
目前，生产中用嫁接预防黄瓜枯萎病的发生，但成本较高。利用拮抗微生物防治植物病害，对环境和人类的安全性、减缓病原菌抗药性等具有重要意义。1973年澳大利亚植物病理学家Kerr利用放线土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter K84)成功防治了植物根癌病，此后人们对植物病害的生物防治研究陆续深入。利用有益拮抗微生物防治黄瓜枯萎病是一种有效措施，具有对环境无污染、对人畜无害、不影响黄瓜品质等优点，符合现代农业发展趋势。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。本发明从甘肃省武威、靖远、兰州的22个黄瓜试验田采集根际土样，分离得到205株细菌菌株。经筛选得到1株对尖孢镰刀菌黄瓜专化型具有极强拮抗作用的菌株20L1-3。根据其菌落和菌体形态特征及gyrB基因序列分析，鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）。并将其于2021年5月19日保藏至中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为：CCTCC NO:M 2021558。本发明研究了该拮抗菌对黄瓜枯萎病的防治效果及对黄瓜植株的促生作用，为黄瓜枯萎病的生物防治及生防菌剂的进一步开发利用提供科学依据。
本发明提供一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3，其保藏编号为CCTCC NO:M 2021558。
本发明还提供含有上述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20L1-3的微生物菌剂。
本发明还提供唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3的微生物菌剂的制备方法，将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株20L1-3接种于液体LB培养基中，置于恒温摇床28~30 ℃、140~220rpm震荡培养2~3 d。
本发明还提供上述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3菌株或菌剂在制备防治作物土传病害的药物中的应用。
作为优选，所述土传病害的病原菌包括黄瓜枯萎病菌、辣椒腐霉根腐病菌、辣椒灰霉病菌、辣椒立枯病菌、辣椒疫霉根腐病菌、辣椒早疫病菌、甜瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、甘蓝枯萎病菌。
作为优选，所述作物为黄瓜、甜瓜、西瓜、甘蓝或辣椒。
本发明还提供上述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3菌株或菌剂在制备促进作物生长的药物中的应用。
本发明还提供上述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3菌株或菌剂在制备微生物菌肥中的应用。
本发明还提供一种微生物菌肥，将上述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3菌株或菌剂，加入到载体中，制备成微生物菌肥。
作为优选，所述载体包括草炭、木炭和玉米芯。
本发明从22个黄瓜枯萎病发生地块的健康植株根际分离筛选出对黄瓜枯萎病有极强抗性的细菌菌株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌株还对辣椒疫病、辣椒灰霉病、辣椒腐霉根腐病、辣椒立枯病、辣椒早疫病、甜瓜枯萎病、西瓜枯萎病、甘蓝枯萎病有很强的拮抗作用。盆栽试验表明，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3对黄瓜枯萎病有显著的防治作用，防治效果为64.71％；且施用唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3发酵液能显著促进黄瓜植株的生长。本发明的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3及其微生物菌肥对连作土壤的修复及土传病害的防治，作物持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明菌株20L1-3对黄瓜枯萎病菌的平板拮抗作用结果；图中A为尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen)，B为菌株20L1-3。
图2为本发明菌株20L1-3的菌落形态。
图3为本发明构建的拮抗菌株20L1-3 gyrB基因序列系统发育树。
图4为本发明实施例3中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3发酵液对黄瓜生长的影响。
图5为本发明实施例4中采用对峙培养法测定唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌株对不同病原菌的拮抗效果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1 黄瓜枯萎病拮抗菌20L1-3的分离和纯化
本申请发明人从甘肃省武威、靖远、兰州的黄瓜枯萎病发病田块中采集健康植株的根际土壤，采集的深度范围为10-20cm，用无菌自封袋封好后带回实验室，暂保存于4℃，用于分离拮抗菌。
供试靶标病原菌为尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum Owen)，由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。细菌培养基为LB，真菌培养基为PDA。
采用土壤稀释法分离细菌，连续划线培养至纯，以体积比1：1混合于40%甘油中，-80℃冰箱保存备用。采用平板对峙法测定细菌对尖孢镰刀菌的拮抗作用。初筛采用抑菌带法，将接种平皿置于25℃恒温培养箱内培养，以只接种病原菌的PDA 平板为对照，待对照长满平皿时，测量抑菌带宽度并筛选出抑菌效果较好的菌株，采用抑菌圈法进行复筛试验。
从22份根际土壤中分离纯化到细菌205种，通过平板对峙法初筛获得抑菌圈直径大于3mm的拮抗菌株107种，占所有菌株的52.2%。其中，抑菌圈直径大于12mm的菌株55株，大于16mm的菌株38种。利用抑菌圈法继续对38株拮抗菌进行复筛，获得抑菌圈直径大于18mm的菌株22种，大于20mm的菌株6种(表1)。
表1 细菌对黄瓜枯萎病菌的抑制作用
Figure 251675DEST_PATH_IMAGE001
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05)，下同。
图1为本发明菌株20L1-3对黄瓜枯萎病菌的平板拮抗作用结果；图中A为尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen)，B为菌株20L1-3。
实施例2 黄瓜枯萎病拮抗菌20L1-3的鉴定
采用菌落形态、革兰氏染色与分子生物学相结合的方法，对筛选到的拮抗菌株黄瓜枯萎病拮抗菌20L1-3进行鉴定。基因的序列分析: 正向引物gyrB－F为 5'－TTGＲCGGHＲGYGGHTATAAAGT－3';反向引物 gyrB－R为 5'－TCCDCCSTCAGAＲTCWCCCTC－3'。PCR 扩增程序：95 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环；最后 72 ℃ 延伸 10 min，4 ℃ 终止反应。PCR 产物于1.5% 琼脂糖凝胶电泳上检测后，送生工生物工程(上海)有限公司进行16S rRNA测序，测序结果如下：
GGGCCATATCTACCGTGGTGACCGTCCTCCTTGCGGTTAGACTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGGACTACGATCGGTTTTCTGGGATTAGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCGACCCTCTGTTCCGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCCTAGAGTGCTCTTGCGTAGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTATCGGTTCTCTTTCGAGCACCCTCGGATCTCTCCAAGGTTCCGACCATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTAAGGAAATGAATCCCCAACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTATTGGCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGCCATACTCTAGCTTGCCAGTCACCAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCGGTCTTAACAAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCCCCGAAGGATATTAGCCCTCAGGATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCCTATAGCGCGAGGCCCGAAGGTCCCCCGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAATCCGGCTTTCGCCGGGCTATCCCCCACTACAGGACATGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGTGCAAGCACTGCGTTCAGCGCATTCATACGTGACAATCGAGGAGAACAGTACGCACCGGCCTA
将所测序列通过 NCBI 数据库进行BLAST比对，利用 Clustalx 和 MEGA 6.0软件对分离的细菌及模式菌进行系统发育分析。
在LB培养基平板上，菌株20 L1-3菌落呈圆形、淡黄色，菌落边缘不整齐、表面有微突起，具有一定的粘附性，直径为2mm左右；菌体杆状，革兰氏染色为阴性（图2）。
图2为本发明菌株20L1-3的菌落形态。
菌株20L1-3测序结果在Ezbiocloud网站比对，与模式菌株Burkholderia gladioliNBRC 13700T相似性最高，达99.50%，鉴定为Burkholderia gladioli 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(系统发育树见图3)。将该菌株于2021年5月19日保藏至中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为：CCTCC NO:M2021558。
图3为本发明构建的拮抗菌株20L1-3 gyrB基因序列系统发育树。
实施例3 黄瓜枯萎病拮抗菌唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3防治黄瓜枯萎病的盆栽试验
供试黄瓜品种为“甘丰袖玉”，供试菌株为实施例2的黄瓜枯萎病拮抗菌唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3 CCTCC NO:M 2021558。
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌剂制备：将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株20L1-3 CCTCCNO:M 2021558接种于50 mL液体LB培养基中，置于恒温摇床28 ℃、220 rpm震荡培养2 d，4℃恒温箱保存备用。黄瓜播种前用无菌水将培养好的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3发酵液调节浓度至活菌数为1×108 cfu / ml。
黄瓜枯萎病病原菌菌悬液制备：将保存好的黄瓜枯萎病病原菌（尖孢镰孢菌黄瓜专化型）用接种针接种到PDA培养基，待培养基布满菌丝后，倒入适量无菌水刮取菌丝，经双层纱布过滤除去菌丝，滤液用无菌水稀释为浓度1×106 个/ ml的孢子悬浮液。
栽培基质：山东聊城鲁亿育苗基质有限公司与山东齐鲁大学联合研发的固体育苗基质，商品名为：鲁亿育苗基质。其中，有机质含量35 %～45 %，腐殖酸含量15 %～25 %，pH值5.5～6.5。
试验设清水对照（CK1）、只接种病原菌对照（CK2）、接种病原菌后灌施5 mL唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌剂3个处理。每处理150株，3次重复。日常管理同常规，播种后30d测定各指标。
其中，接种黄瓜枯萎病病原菌的方法为：挑选长势一致的黄瓜种子（胚根长约1cm）充分浸没在制备好的黄瓜枯萎病病原菌菌悬液中30 min后捞出。
试验数据测定方法如下：
用直尺测量株高，用游标卡尺测量茎粗，用叶面积仪（托普云农TPYX-A）测量叶面积，用分析天平测定植株干鲜重。
植株根冠比=地下部鲜重/地上部鲜重×100；
壮苗指数=（茎粗/株高+地下部干重/地上部干重）×全株干重。
用丙酮提取法测定叶绿素含量，用红四氮唑（TTC）还原法测定根系活力，用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白，用紫外分光光度法测定过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和脯氨酸（Pro）活性。
黄瓜枯萎病分级：
0级：无症状；
1级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积不超过总面积的50 %；
2级：真叶、子叶黄化或萎蔫面积超过总面积的50 %；
3级：叶片萎蔫或枯死，仅生长点存活；
4级：全株严重萎蔫，以致枯死。
发病率=发病株数/调查总株数×100
病情指数 = ∑ (病级株数×代表级数)/(植株总数×最高代表级值)×100
防治效果 = (对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。
表2 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3对黄瓜植物学性状的影响
Figure 637657DEST_PATH_IMAGE002
表3 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3对黄瓜叶绿素、可溶性蛋白和根系活力的影响
Figure 620656DEST_PATH_IMAGE003
表4 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3对黄瓜防御酶的影响
Figure 281445DEST_PATH_IMAGE004
表5 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3对黄瓜枯萎病的防治效果
Figure 299079DEST_PATH_IMAGE005
表2所示，施用唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3 30d后，黄瓜苗茎粗、叶面积、根冠比和壮苗指数显著高于CK2，分别较CK2增加11.85%、11.68%、20.81%和48.48%。且茎粗、根冠比和壮苗指数和CK1接近。说明唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3对黄瓜枯萎病有显著的防治作用，且能促进黄瓜苗的生长。
表3和表4所示，灌施唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3 30d后，黄瓜苗的叶绿素含量显著高于CK2，较CK2增加11.35%。根系活力、POD 和SOD显著高于CK2，且与CK1接近，分别较CK2增加171.43%、63.99%和20.11%。说明唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3对黄瓜枯萎病有一定的防病促生作用，可促进防御酶POD 和SOD的活性。
表5所示，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3对黄瓜枯萎病的防效显著，防治效果达64.71％。
图4为本发明实施例3中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3发酵液对黄瓜生长的影响。
实施例4 黄瓜枯萎病拮抗菌唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌株的抑菌谱测定
采用对峙培养法测定拮抗唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌株对蔬菜生产中危害严重的8种植物病原菌的抑菌效果。
表6和图5显示，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌株对辣椒疫霉根腐病和辣椒灰霉病菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径分别达35.3mm和 31.0mm；对辣椒早疫病、辣椒腐霉根腐病、西瓜枯萎病菌的抑菌圈直径均在24mm以上；对辣椒立枯病、甜瓜枯萎病和甘蓝枯萎病菌也有一定的拮抗作用。说明唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20 L1-3菌株有比较广的抑菌谱，可以考虑将其应用于除黄瓜枯萎病外的其他作物病害的生防研究。
图5为本发明实施例4中采用对峙培养法测定唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌株对不同病原菌的拮抗效果；图中A为辣椒腐霉根腐病 (Pythium spinosum) 、B为辣椒灰霉病 (Botrytis cinerea)、 C为辣椒立枯病 (Rhizoctonia solani) 、D为辣椒疫霉根腐病(Phytophthora capsici)、 E为辣椒早疫病 (Alternaria solani) 、F为甜瓜枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.melonis) 、G为西瓜枯萎病 (Fusarium oxysporumf.sp.niveum)、H为甘蓝枯萎病 [Fusarium oxysporum Sch1. f. sp.conglutinans(Wollenw) Snyder & Hansen]。
表6 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌株对不同病原菌的拮抗效果
Figure 590383DEST_PATH_IMAGE006
实施例5 黄瓜枯萎病拮抗菌唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌株的促生性能
供试菌株：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20 L1-3。
固氮酶活性测定：采用乙炔还原法(acetylene reduction assays,ARA)。用接种环将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20 L1-3菌株接种在盛有5 mL半固体NFM培养基的10 mL血清瓶中，以不接菌培养基为对照，用棉花塞封口，置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h后，将棉花塞换成橡胶塞，用无菌注射器抽出1 mL气体，然后注入1 mL C2H2气体，置于28 ℃培养箱中培养48 h，培养结束之后用100 μL平口微量进样器从血清瓶中抽取混合气体50 μL，快速注入到气相色谱仪气体进样柱内，记录并观察C2H4出峰时间及峰面积，测定C2H2和C2H4的含量。将纯的标准C2H4气体配置为浓度10，25，50，75，100，200，500，1000 μL/ 10mL的C2H4标准混合气体，用50 μL微量进样器从C2H4标准混合气体抽取50 μL注入气象色谱仪（GC 7890F）进样柱中，观察C2H4峰的峰面积。最后以C2H4浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标作图，即得到C2H4标准曲线。从气相色谱仪显示屏的C2H2、C2H4峰值判断有无C2H4的产生并确定其固氮性能，根据以下公式计算固氮酶活性。
N= (hx×C×V) / (hs×24.9×t)
其中，Hx：样品峰值；Hs：标准C2H4峰值；C：标准C2H4浓度 (nmol/mL) ；V：培养容器体积 (mL)；T：样品培养时间 (h) ；N：产生的C2H4浓度 (nmol/mL·h)。
固氮酶活性=（瓶子上方体积×所测菌株乙烯峰面积）/（1 nmoL乙烯峰面积×瓶内气体体积×菌体蛋白×反应时间）。
有机磷溶磷量测定：采用钼锑抗比色法。将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20 L1-3菌株接种于装有50 mL MJN液体培养基的三角瓶中，待冷却后将0.5 mL待测菌悬液（D600nm=0.5）接种于三角瓶中，以不接菌培养基为对照，置于恒温摇床中在28℃、140r/min条件下振荡培养10 d，加入45 mL 0.5 mol/L的NaHCO3和适量无磷活性炭，封口后在摇床上震荡30 min，再用无磷滤纸过滤，后将1 mL滤液、5 mL 0.5 mol/L NaHCO3、30 mL蒸馏水、5 mL钼锑抗显色剂加入50 mL容量瓶中摇匀后用蒸馏水定容，待其显色半小时后，在700 nm波长下测定吸光度值。经过比色在标准曲线上查出相对应的磷浓度。再利用公式计算培养液有效磷含量，减去对照后的值为有效磷增量。
培养液有效磷含量(μg/mL)=PV*Ts/V0
其中，P：从标准曲线上查得P的质量浓度(μg/mL)；Ts：分取倍数；V：显色时定容的体积(mL)；V0：测定发酵液的体积(mL)。
IAA分泌量测定：取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20 L1-3菌株培养液10 mL于4 ℃、10000 r/min条件下离心10 min，吸取5 mL上清液加入等体积S2比色液。其测定范围为5~200 μg/mL，一般超过100 μg/mL需要稀释。在黑暗下静置30 min后迅速用分光光度计在波长530 nm下测定待测液的吸光值，在标准曲线（0～25 μL IAA标准溶液）上查出待测液的IAA浓度(μg/ mL)。
表7 拮抗菌株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3的促生性能
Figure DEST_PATH_IMAGE008
表7所示，本发明的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌株具有一定的促生作用，具有较强的固氮和溶磷作用。
实施例6 微生物菌肥的制备
将本发明实施例3制备的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌剂，加入到载体中，制备成微生物菌肥，来提高作物的防病促生效果。
其中，所述唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20L1-3菌剂为所述载体重量的10%。
所述载体可以为：草炭：木炭：玉米芯的质量比=8：1：1。
本发明的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20 L1-3菌株除对黄瓜枯萎病有极强的拮抗作用，还对多种土传病害有较强的拮抗作用。由此推测，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌20 L1-3菌株可能产生多种不同的抑菌物质，或该菌株产生的抑菌物质有较广的抑菌能力，具体的活性物质及其功能需进一步研究。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 甘肃省农业科学院蔬菜研究所
<120> 一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1451
<212> DNA
<213> 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)
<400> 1
gggccatatc taccgtggtg accgtcctcc ttgcggttag actagccact tctggtaaaa 60
cccactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgcggca 120
tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcatgcact cgagttgcag agtgcaatcc 180
ggactacgat cggttttctg ggattagctc cccctcgcgg gttggcgacc ctctgttccg 240
accattgtat gacgtgtgaa gccctaccca taagggccat gaggacttga cgtcatcccc 300
accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctc cctagagtgc tcttgcgtag caactaagga 360
caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc 420
catgcagcac ctgtgtatcg gttctctttc gagcaccctc ggatctctcc aaggttccga 480
ccatgtcaag ggtaggtaag gtttttcgcg ttgcatcgaa ttaatccaca tcatccaccg 540
cttgtgcggg tccccgtcaa ttcctttgag ttttaatctt gcgaccgtac tccccaggcg 600
gtcaacttca cgcgttagct acgttactaa ggaaatgaat ccccaacaac tagttgacat 660
cgtttagggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgtgcat 720
gagcgtcagt attggcccag ggggctgcct tcgccatcgg tattcctcca catctctacg 780
catttcactg ctacacgtgg aattctaccc ccctctgcca tactctagct tgccagtcac 840
caatgcagtt cccaggttga gcccggggat ttcacatcgg tcttaacaaa ccgcctgcgc 900
acgctttacg cccagtaatt ccgattaacg ctcgcaccct acgtattacc gcggctgctg 960
gcacgtagtt agccggtgct tattcttccg gtaccgtcat ccccgaagga tattagccct 1020
caggatttct ttccggacaa aagtgcttta caacccgaag gccttcttca cacacgcggc 1080
attgctggat caggctttcg cccattgtcc aaaattcccc actgctgcct cccgtaggag 1140
tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggct ggtcgtcctc tcagaccagc tactgatcgt 1200
cgccttggtg ggcctttacc ccaccaacta gctaatcagc catcggccaa ccctatagcg 1260
cgaggcccga aggtcccccg ctttcatccg tagatcgtat gcggtattaa tccggctttc 1320
gccgggctat cccccactac aggacatgtt ccgatgtatt actcacccgt tcgccactcg 1380
ccaccaggtg caagcactgc gttcagcgca ttcatacgtg acaatcgagg agaacagtac 1440
gcaccggcct a 1451

Claims (10)

1.一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3，其保藏编号为CCTCC NO:M 2021558。
2.含有权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3的微生物菌剂。
3.唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株20L1-3接种于液体LB培养基中，置于恒温摇床28~30 ℃、140~220rpm震荡培养2~3 d。
4.权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3菌株或权利要求2所述的菌剂在制备防治作物土传病害的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述土传病害的病原菌包括黄瓜枯萎病菌、辣椒腐霉根腐病菌、辣椒灰霉病菌、辣椒立枯病菌、辣椒疫霉根腐病菌、辣椒早疫病菌、甜瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、甘蓝枯萎病菌。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述作物为黄瓜、甜瓜、西瓜、甘蓝或辣椒。
7.权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3菌株或权利要求2所述的菌剂在制备促进作物生长的药物中的应用。
8.权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3菌株或权利要求2所述的菌剂在制备微生物菌肥中的应用。
9.一种微生物菌肥，其特征在于：将权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli 20 L1-3菌株或权利要求2所述的菌剂，加入到载体中，制备成微生物菌肥。
10.根据权利要求9所述的微生物菌肥，其特征在于：所述载体包括草炭、木炭和玉米芯。
CN202210739622.0A 2022-06-28 2022-06-28 一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其应用 Active CN115029280B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210739622.0A CN115029280B (zh) 2022-06-28 2022-06-28 一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210739622.0A CN115029280B (zh) 2022-06-28 2022-06-28 一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115029280A true CN115029280A (zh) 2022-09-09
CN115029280B CN115029280B (zh) 2023-08-18

Family

ID=83127023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210739622.0A Active CN115029280B (zh) 2022-06-28 2022-06-28 一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115029280B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116218709A (zh) * 2022-12-16 2023-06-06 安徽农业大学 一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌js-59及其应用
CN116676218B (zh) * 2023-05-16 2024-02-27 上海市农业科学院 一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其防治草莓病害的应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020036265A (ko) * 2000-11-09 2002-05-16 이재호 길항미생물 버홀더리아 글라디올리 지비-0999 균주, 이를포함하는 미생물제제 및 이를 이용하여 식물의 풋마름병을방제하는 방법
CN1946297A (zh) * 2004-02-27 2007-04-11 株式会社树 用芽孢杆菌属细菌防治植物病害的方法和防治剂
CN102533593A (zh) * 2011-12-16 2012-07-04 华南农业大学 洋葱伯克霍尔德氏菌sd7及其培养方法和应用
CN105018371A (zh) * 2015-06-11 2015-11-04 江西师范大学 一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32及其应用
CN106793781A (zh) * 2014-05-28 2017-05-31 拜耳作物科学有限合伙公司 用于防治植物中的真菌性病害和细菌性病害的组合物和方法
CN107099478A (zh) * 2017-06-06 2017-08-29 江苏省中国科学院植物研究所 一株忽地笑内生细菌伯克霍尔德氏菌hdxy‑02及其应用
US20170273309A1 (en) * 2014-09-26 2017-09-28 University Of Guelph Bacterial endophytes for biocontrol of fungus
CN109476710A (zh) * 2016-07-19 2019-03-15 国立植物基因组研究所 抗真菌病原体的新蛋白质
CN111925973A (zh) * 2020-09-21 2020-11-13 深圳职业技术学院 一株荔枝内生唐菖蒲伯克霍尔德菌及其在防治荔枝炭疽病和荔枝霜疫病中的应用
CN113278542A (zh) * 2021-04-07 2021-08-20 华南农业大学 一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌pjb25及其应用
CN113337438A (zh) * 2021-06-17 2021-09-03 华南农业大学 一株高效内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌nspe25及其应用
WO2022225925A1 (en) * 2021-04-19 2022-10-27 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020036265A (ko) * 2000-11-09 2002-05-16 이재호 길항미생물 버홀더리아 글라디올리 지비-0999 균주, 이를포함하는 미생물제제 및 이를 이용하여 식물의 풋마름병을방제하는 방법
CN1946297A (zh) * 2004-02-27 2007-04-11 株式会社树 用芽孢杆菌属细菌防治植物病害的方法和防治剂
CN102533593A (zh) * 2011-12-16 2012-07-04 华南农业大学 洋葱伯克霍尔德氏菌sd7及其培养方法和应用
CN106793781A (zh) * 2014-05-28 2017-05-31 拜耳作物科学有限合伙公司 用于防治植物中的真菌性病害和细菌性病害的组合物和方法
US20170273309A1 (en) * 2014-09-26 2017-09-28 University Of Guelph Bacterial endophytes for biocontrol of fungus
CN105018371A (zh) * 2015-06-11 2015-11-04 江西师范大学 一株东乡野生稻内生细菌唐菖蒲伯克霍尔德菌Fse32及其应用
CN109476710A (zh) * 2016-07-19 2019-03-15 国立植物基因组研究所 抗真菌病原体的新蛋白质
US20190315811A1 (en) * 2016-07-19 2019-10-17 National Institute Of Plant Genome Research Novel protein against fungal pathogens
CN107099478A (zh) * 2017-06-06 2017-08-29 江苏省中国科学院植物研究所 一株忽地笑内生细菌伯克霍尔德氏菌hdxy‑02及其应用
CN111925973A (zh) * 2020-09-21 2020-11-13 深圳职业技术学院 一株荔枝内生唐菖蒲伯克霍尔德菌及其在防治荔枝炭疽病和荔枝霜疫病中的应用
CN113278542A (zh) * 2021-04-07 2021-08-20 华南农业大学 一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌pjb25及其应用
WO2022225925A1 (en) * 2021-04-19 2022-10-27 AgBiome, Inc. Compositions and methods for improving plant health and controlling plant disease
CN113337438A (zh) * 2021-06-17 2021-09-03 华南农业大学 一株高效内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌nspe25及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELSHAFIE H 等: "In vitro antifungal activity of Burkholderia gladioli pv. agaricicola against some phytopathogenic fungi", 《INT J MOL SCI》, vol. 13, no. 12, pages 16291 - 16302, XP055425836, DOI: 10.3390/ijms131216291 *
KUMAR R 等: "Bacteria-fungal Confrontation and Fungal Growth Prevention Assay", 《BIO PROTOC》, vol. 8, no. 2, pages 1 - 7 *
YANG C 等: "Burkholderia gladioli strain KJ-34 exhibits broad-spectrum antifungal activity", 《FRONT PLANT SCI》, vol. 14, pages 1 - 11 *
敖武 等: "1株拮抗真菌的生防细菌Xj11的分离与鉴定", 《微生物学杂志》, vol. 33, no. 3, pages 45 - 48 *
李亚莉 等: "黄瓜枯萎病拮抗菌Burkholderia gladioli L1-3的分离鉴定及防病促生效果", 《中国蔬菜》, vol. 12, pages 52 *
赵新贝 等: "番茄灰霉病拮抗细菌18BS-12发酵条件的优化及防治效果", 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》, vol. 44, no. 6, pages 116 - 124 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116218709A (zh) * 2022-12-16 2023-06-06 安徽农业大学 一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌js-59及其应用
CN116218709B (zh) * 2022-12-16 2023-12-15 安徽农业大学 一株内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌js-59及其应用
CN116676218B (zh) * 2023-05-16 2024-02-27 上海市农业科学院 一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其防治草莓病害的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115029280B (zh) 2023-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Tobacco bacterial wilt can be biologically controlled by the application of antagonistic strains in combination with organic fertilizer
CN106754557B (zh) 枯草芽孢杆菌ybm-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用
CN115029280B (zh) 一株拮抗黄瓜枯萎病的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及其应用
CN110564651A (zh) 一株暹罗芽孢杆菌及其应用
CN112266881A (zh) 一株解淀粉芽胞杆菌及其在防治苹果重茬障碍中的应用
CN107136122B (zh) 一种防治马铃薯晚疫病的生防菌剂
CN111040976B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN107338202B (zh) 具有广谱抑制病原菌功能的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN110904001A (zh) 一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用
CN115261283B (zh) 一种蜡样芽孢杆菌及其在旱作马铃薯病害防控中的应用
CN115820461B (zh) 一种高产吲哚乙酸菌株jb0319及其应用
CN114703100A (zh) 一株绿针假单胞菌yx33及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用
CN116103158B (zh) 一株抗病促生的高山被孢霉菌、含有该菌的菌剂及其应用
CN114164136B (zh) 一种抗香蕉枯萎病的链霉菌新种及其应用
CN114164137B (zh) 一种抗香蕉枯萎病的淀粉酶产色链霉菌及其应用
CN109749953B (zh) 蜡样芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用
CN106635926B (zh) 沙福芽孢杆菌yjc-4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用
CN113151086A (zh) 一种暹罗芽孢杆菌、菌剂、萃取物及其应用
CN106244480B (zh) 一株假格里尼翁苍白杆菌及其防治植物寄生线虫的应用
CN115851479A (zh) 一种对番茄灰霉病菌具有拮抗作用的细菌及其应用
CN112608855B (zh) 一种复合微生物菌肥及其制备方法和应用
CN113832071A (zh) Brevibacillus halotolerans菌及其制备生防菌剂中的应用
Gupta et al. Frankia: a promising N-fixing plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) improved drought tolerance in crops at higher altitude
CN111909871B (zh) 一种拮抗桃细菌性穿孔病菌的粪产碱杆菌及应用
CN108753629A (zh) 一株具有耐盐能力的米根霉及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant