CN110904001A - 一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用 - Google Patents

一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用 Download PDF

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Abstract

一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用，涉及微生物领域，尤其一种野生稻根际细菌及其应用。目的是提供一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌，可提高盐渍化土壤种植水稻的抗逆能力和产量，为盐碱地种稻及土壤资源的开发利用奠定良好的基础。该菌株为巨大芽孢杆菌GW8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2019年9月29日，保藏编号为CGMCC No.18632。本发明巨大芽孢杆菌GW8可以在高盐碱条件下溶解难溶性Ca3(PO4)2，同时对于盐碱土栽培水稻具有较强的促生作用。本发明用于提高盐渍化土壤种植水稻的抗逆能力和产量。

Description

一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其一种野生稻根际细菌及其应用。
背景技术
近年来，土壤盐渍化已经成为农牧业不可忽视的问题，而改善盐碱地和利用盐碱土壤成为热门研究课题之一。在诸多课题研究中，盐碱地种植水稻项目取得喜人的成果，水稻因特殊的多水环境，可有效的降低盐碱胁迫对水稻的生理干旱影响，但是与正常土壤中的水稻比较仍有巨大的差距。目前已报到的一些具有促生功能的菌株，其主要的特性包括IAA、固氮、解钾、产铁载体等，但具有耐盐碱特性的促生功能菌的报道较少。因此筛选出耐盐碱特性的促生功能菌，对于提高盐渍化土壤种植水稻的抗逆能力和产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌，可提高盐渍化土壤种植水稻的抗逆能力和产量，为盐碱地种稻及土壤资源的开发利用奠定良好的基础。
本发明耐盐碱解磷的野生稻根际细菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GW8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年9月29日，保藏编号为CGMCC No.18632。
本发明巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GW8是革兰氏阳性细菌，菌落呈白色，表面光滑，粘稠，产淀粉水解酶、接触酶、氧化酶，产酸，分泌生长素IAA。
本发明巨大芽孢杆菌GW8通过16S rDNA序列比对分析，与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)有极高的同源性，同源性为99.08％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，本发明的菌株GW8为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
本发明巨大芽孢杆菌GW8在促进盐渍化土壤种植水稻生长发育中的应用。
进一步的，所述盐渍化土壤的含盐量为3g/L，pH值为9。
进一步的，所述巨大芽孢杆菌GW8促进盐渍化土壤种植水稻的根长、株高、鲜重和干重。
本发明巨大芽孢杆菌GW8在盐碱条件下溶解磷的应用。
进一步的，所述磷为Ca3(PO4)2。
本发明的有益效果：
本发明巨大芽孢杆菌GW8可以在高盐碱条件下溶解难溶性Ca3(PO4)2，同时对于盐碱土栽培水稻具有较强的促生作用，且无致病性。实验结果表明，在含盐量为0g/L和pH为8时，巨大芽孢杆菌GW8的解磷量最高达494mg/L。在pH为9的盐碱条件下，巨大芽孢杆菌GW8促进Ca3(PO4)2的溶解，可以促进水稻幼苗的生长发育，缓解高盐碱条件对水稻造成的不利影响。
由此证明，本发明巨大芽孢杆菌GW8可提高盐渍化土壤种植水稻的抗逆能力和产量，为盐碱地种稻及土壤资源的开发利用奠定良好的基础。
附图说明
图1为巨大芽孢杆菌GW8的系统进化树；
图2为巨大芽孢杆菌GW8在NBRIP固体培养基的溶磷圈；
图3为巨大芽孢杆菌GW8在不同盐碱条件下的pH调节情况；
图4为盐碱条件下，巨大芽孢杆菌GW8对栽培水稻的促生情况。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式耐盐碱解磷的野生稻根际细菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GW8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年9月29日，保藏编号为CGMCC No.18632。
本实施方式参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对本实施方式巨大芽孢杆菌GW8进行生理生化鉴定：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GW8是革兰氏阳性细菌，菌落呈白色，表面光滑，粘稠，产淀粉水解酶、接触酶、氧化酶，产酸，分泌生长素IAA(如表1)。
表1巨大芽孢杆菌GW8的生理生化结果
Figure BDA0002278085060000021
Figure BDA0002278085060000031
具体实施方式二：本实施方式巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GW8的获取方法为：取广东省野生稻根际土壤，采用平板稀释法分离获得了60株耐受NaCl浓度为20g/L的细菌，并对其进行了盐碱梯度筛选。
盐碱梯度筛选：采用平板培养法对60株细菌进行筛选，根据嗜盐菌的盐度耐受程度和嗜碱菌的pH耐受程度，设置NaCl浓度(20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L)和pH(7、8、9、10、11、12)相互交叉的盐碱条件的LB培养基，将待测菌株接种于上述培养基中，逐级筛选得到一株耐受NaCl浓度为100g/L、pH 11的菌株。即为本实施方式的菌株GW8。
对菌株GW8进行分子鉴定，提取菌株的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物送于生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，获得1030bp序列长度，提交至GenBank登录号为MN654023，16SrDNA序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。通过Blast分析与基因库中序列进行同源性比较，通过Mega-X中的Neihbor-Joinhing构建进化树(图1)。结果表明该菌株与与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，MH261029)同源相似性达99.08％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，本实施方式的菌株GW8属于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
具体实施方式三：本实施方式巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GW8解磷能力的测定：
采用NBRIP固体培养法，将菌株在LB培养基上培养12h后，将菌饼接种于NBRIP固体培养基(葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，Ca3(PO4)2 10g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，)，于28℃恒温培养7天，观察解磷圈大小。菌株GW8的解磷能力测定，采用钼锑抗比色法，将菌株GW8接种于100mL的LB液体培养基中，160r/min，28℃恒温培养12h。取1mL菌液接种于装有50mLNBRIP液体培养基的150mL的三角瓶中，160r/min，28℃恒温培养7天。每隔一天测定其可溶性磷含量，得到最大解磷量。结果显示，在NBRIP固体平板上，菌株GW8具有明显解磷圈(图2)；定量测定其最大解磷量，可达到493mg/L。
具体实施方式四：本实施方式巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GW8在不同盐碱环境下的解磷情况：
NBRIP液体培养基的初始含盐量(0、20、40、60、80、100g/L)和pH(7、8、9、10、11、12)对菌株GW8的解磷能力的影响。将菌饼接种于LB液体培养基中发酵培养1d，菌体数稀释至108cfu/mL，按1％体积分数接种到上述不同盐碱条件的NBRIP液体培养基中，于28℃，160r/min摇床培养，48h后取出发酵液。发酵液于12000r/min离心5min，测定上清液中的pH值和可溶性磷含量。结果显示，在不同盐碱发酵条件下，菌株GW8的解磷能力受到影响，据表2显示，在含盐量为0g/L和pH8时，菌株GW8的解磷量最高494mg/L；在含盐量为100g/L和pH 11时，菌株GW8的解磷量最高85mg/L；在pH 12时，菌株裂解死亡，显示低量的可溶性磷含量。据图3显示(图3中
Figure BDA0002278085060000041
表示CNaCl：0g/L，
Figure BDA0002278085060000042
表示CNaCl：20g/L，
Figure BDA0002278085060000043
表示CNaCl：40g/L，
Figure BDA0002278085060000044
表示CNaCl：60g/L，
Figure BDA0002278085060000045
表示CNaCl：80g/L，
Figure BDA0002278085060000046
表示CNaCl：100g/L)，发酵液最终pH的降低量随着初始pH的升高而增高，无论初始pH如何，发酵液的最终pH均维持在一定范围内。综合得出：尽管外界环境的高pH胁迫，菌株GW8仍能够分泌相应有机酸含量，将生存环境的pH维持在一定范围内，保证自身的正常生长繁殖。
表2巨大芽孢杆菌GW8在不同盐碱条件下的解磷情况
pH7 pH8 pH9 pH10 pH11 pH12
C<sub>NaCl</sub>：0g/L 487.7461 493.6327 427.7595 367.7729 158.5121 5.697051
C<sub>NaCl</sub>：20g/L 416.1471 399.7989 356.1605 296.1739 181.9705 5.697051
C<sub>NaCl</sub>：40g/L 320.6817 369.6381 260.6951 200.7085 192.0241 2.345845
C<sub>NaCl</sub>：60g/L 463.4718 299.2627 403.4853 343.4987 178.6193 11.05898
C<sub>NaCl</sub>：80g/L 446.7158 436.6622 386.7292 326.7426 161.8633 11.05898
C<sub>NaCl</sub>：100g/L 356.2332 386.3941 296.2466 236.2601 84.78552 11.05898
具体实施方式五：本实施方式在盐碱条件下，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)GW8对盐碱土栽培水稻的促生情况：
将水稻种子剥去外壳，进行表面消毒处理，置于已灭菌MS培养基平板上，25℃黑暗培养4d，选取长势相同，株高5cm(±1)的无菌水稻幼苗。根据土壤盐渍化程度划分等级，含盐量为3～6g/L，pH为8.5～9.5是中度盐碱地，模拟中度盐碱条件配置NaCl浓度为3g/L，pH9的改良版固体MS培养基和液体MS培养基(已去除含磷元素与促生长成分)，量取50mL改良版固体MS培养基置于组织培养瓶，灭菌后冷却，加入5mL对应盐碱浓度的改良版液体MS培养基。将选定好的无菌水稻苗接种于上述无菌培养体系，设置3种处理：
(1)CK组：不做处理；
(2)固体磷组：加入0.5gCa3(PO4)2；
(3)固体磷+GW8组：加入0.5gCa3(PO4)2和2mL浓度为108cfu/mL的巨大芽孢杆菌GW8菌液。
在光照培养箱中，培养14d，取出水稻，测定水稻根长、株高、鲜重和干重。据图4显示，在菌株GW8的参与下，均比CK组和Ca3(PO4)2组的长势好。据表3显示，Ca3(PO4)2+GW8组与Ca3(PO4)2组相比，根长、株高、鲜重和干重提高了18.7％、16.56％、32.6％和11.9％；Ca3(PO4)2+GW8组与CK组相比，根长、株高、鲜重和干重提高了8.6％、47.6％、124％和22％。
表3盐碱条件下，GW8对栽培水稻的各项生物指标的影响
Figure BDA0002278085060000051
结论：本实施方式在野生稻根际土壤中筛选得到的巨大芽孢杆菌GW8，具有较强的适应高浓度盐碱条件，并能发挥其解磷功能，即使在盐含量100g/L，pH 11的发酵液中GW8也表现出可观的溶磷能力。在CNaCl：3g/L，pH 9的中度盐碱地模拟条件下，巨大芽孢杆菌GW8促进Ca3(PO4)2的溶解，可以促进水稻幼苗的生长发育，缓解高盐碱条件对水稻造成的不利影响。
序 列 表
<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所
<120> 一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1030
<212> DNA
<213> Bacillus megaterium
<220>
<223>巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）GW8的16SrDNA
<400> 1
ggggccgttg gcggcggtgc ctatacatgc aagtcgagcg aatggattaa gagcttgctc 60
ttatgaagtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat aagactggga 120
taactccggg aaaccggggc taataccgga taacattttg aaccgcatgg ttcgaaattg 180
aaaggcggct tcggctgtca cttatggatg gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg 240
taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg 300
actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg 360
aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt 420
gttagggaag aacaagtgct agttgaataa gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa 480
gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga 540
attattgggc gtaaagcgcg cgcaggtggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct 600
caaccgtgga gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc 660
catgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatat ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc 720
tggtctgtaa ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 780
gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg 840
aagttaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga 900
attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagac 960
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaccc tagagatagg gcttcttcct tcgggagcag 1020
agtgacagtg 1030

Claims (6)

1.一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌，其特征在于该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)GW8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年9月29日，保藏编号为CGMCC No.18632。
2.权利要求1所述耐盐碱解磷的野生稻根际细菌在促进盐渍化土壤种植水稻生长发育中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述盐渍化土壤的含盐量为3g/L，pH值为9。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述巨大芽孢杆菌GW8促进盐渍化土壤种植水稻的根长、株高、鲜重和干重。
5.权利要求1所述耐盐碱解磷的野生稻根际细菌在盐碱条件下溶解磷的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述磷为Ca3(PO4)2。
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