CN116731916B - 一株耐盐巨大芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种耐盐巨大芽孢杆菌及其应用，本发明提供的耐盐巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌(CGMCC No.21828)的突变株(Bacillus megaterium SLD)，于2022年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25832，其耐盐能力相比于原始菌株提升17％以上，可用于制备微生物菌剂和复合菌剂，应用于微生物肥料中，促进作物生长，改善盐碱地土壤环境，对于微生物肥料在盐碱地中的应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株具有耐盐性能的巨大芽孢杆菌及其应用。
背景技术
微生物肥料可改变土壤理化性质，提升土壤肥力，改善土壤微生物生态系统，减少作物病害发生，提高作物产量，改善作物品质等。微生物肥料通过提供能源物质给微生物，使得其在土壤中容易定殖和生长繁殖，充分发挥功能微生物的作用。巨大芽孢杆菌是目前农用微生物菌剂中应用最为广泛的一类微生物，据报道，巨大芽孢杆菌能够通过在土壤中分泌代谢产物，分解有机磷，无机磷，提高土壤养分，改良土壤结构，提高化肥利用率，促进作物生长，提高产量。通过筛选优良菌种，可促进微生物产业的发展，对于作物产量以及生态环境都具有积极作用。
目前，盐碱地中因大量盐分的积累，引起一系列土壤物理性状的恶化，使植物生长发育受到抑制，甚至死亡。通过微生物肥料的施用可以改变土壤理化性质，改善土壤微生态，提升土壤肥力，但由于目前市场上多数微生物肥料中功能菌难以适应盐碱地环境，导致效果不突出。因此，亟需提供一种耐盐功能菌。
发明内容
本发明旨在至少一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一株巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium LD(CGMCC No.21828)的突变菌株Bacillusmegaterium SLD，其耐盐能力相对于原始菌株提升17％以上，同时具有较快的生长速度和传代稳定性，将其用于复合菌剂及微生物肥料的制备，在盐碱地土壤环境中可促进作物生长，改善根际环境，对于微生物肥料在盐碱地中的应用具有重要意义。
为此，本发明第一方面提供了一种巨大芽孢杆菌突变菌株Bacillus megateriumSLD，于2022年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25832，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
为获得具有耐盐性的巨大芽孢杆菌，发明人通过采用ARTP(室温常压等离子体)诱变和MMC(全自动高通量微生物液滴培养仪)靶向驯化，经鉴定、传代和效果验证，确定得到耐盐巨大芽孢杆菌突变菌株。
根据本发明的实施例，所述巨大芽孢杆菌突变菌株具有如SEQ IN NO:1所示的16SrDNA序列。
本发明第二方面提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括第一方面所述的巨大芽孢杆菌突变菌株。由此，该复合菌剂耐盐能力有所提升，可更好地应用于微生物肥料中，在盐碱地土壤环境中促进作物生长，改善根际环境。
根据本发明的实施例，所述微生物菌剂中巨大芽孢杆菌突变菌株的有效活菌数至少为1.0×1010CFU/g。由此，以进一步提高复合菌剂的耐盐能力。
根据本发明的优选的实施例，所述微生物菌剂中巨大芽孢杆菌突变菌株的有效活菌数为1.0×1010CFU/g。
根据本发明的实施例，所述微生物菌剂为干粉状，所述微生物菌剂通过下述步骤获得：
对所述微生物菌剂进行放大发酵培养，对获得的发酵产物进行喷雾干燥、粉碎处理，以便获得所述微生物菌剂。
根据本发明的实施例，用于所述放大发酵培养的培养基按照重量份计，包括：
1～5重量份的豆粕，
1～5重量份的玉米粉，
0.1～1重量份的淀粉，
0.1～1重量份的葡萄糖，
0.02～0.3重量份的氯化钠，
0.1～0.8重量份的磷酸氢二钾，
0.01～0.2重量份的硫酸锰，
0.1～1重量份的消泡剂。
本发明第三方面提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第二方面所述的微生物菌剂。
根据本发明的实施例，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为第二方面所述的微生物菌剂，所述第二微生物菌剂包括选自贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述复合菌剂包括30～35重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：
30～35重量份的贝莱斯芽孢杆菌；
30～35重量份的地衣芽孢杆菌；
30～35重量份的枯草芽孢杆菌。
根据本发明的实施例，所述复合菌剂包括巨大芽孢杆菌突变菌株，以及选自贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的至少之一；
其中，
巨大芽孢杆菌突变菌株的有效活菌数至少为1.0×1010CFU/g；
贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为1.0×1011CFU/g；
地衣芽孢杆菌的有效活菌数至少为1.0×1011CFU/g；
枯草芽孢杆菌的有效活菌数至少为1.0×1011CFU/g。
本发明第四方面提供了第一方面所述的巨大芽孢杆菌突变菌株，或第二方面所述的微生物菌剂，或第三方面所述的复合菌剂在制备微生物肥料中的应用。根据本发明提供的巨大芽孢杆菌突变菌株及含有其的微生物菌剂、复合菌剂具有较好耐盐性，将其用于微生物肥料的制备，在盐碱地土壤环境中促进作物生长，改善根际环境，这对于微生物肥料在盐碱地中的应用具有重要意义。
本发明第五方面提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括第一方面所述的巨大芽孢杆菌突变菌株，和/或第二方面所述的微生物菌剂，和/或第三方面所述的复合菌剂。本发明提供的巨大芽孢杆菌突变菌株及含有其的微生物菌剂、复合菌剂具有较好耐盐性，将其用于微生物肥料的制备，在盐碱地土壤环境中促进作物生长，改善根际环境，这对于微生物肥料在盐碱地中的应用具有重要意义。
根据本发明的实施例，所述微生物肥料为固体肥料或液体肥料。
根据本发明的实施例，所述微生物肥料中含有的微生物有效活菌数至少为2.0×107CFU/g。
根据本发明的实施例，所述微生物肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自复合肥、有机肥、有机无机肥中的至少之一。
本发明第六方面提供了一种植物施肥方法，所述方法包括：
对所述植物施加有效量的巨大芽孢杆菌突变菌株、微生物菌剂、复合菌剂、微生物肥料中的至少之一，所述巨大芽孢杆菌突变菌株为第一方面所述的巨大芽孢杆菌突变菌株，所述微生物菌剂为第二方面所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为第三方面所述的复合菌剂，所述微生物肥料为第五方面所述的微生物肥料。
根据本发明的实施例，所述植物选自马铃薯、玉米中的至少之一。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
保藏信息：
菌株名称：Bacillus megaterium SLD
保藏日期：2022年9月28日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.25832
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的巨大芽孢杆菌ARTP致死率曲线；
图2显示了根据本发明一个实施例的巨大芽孢杆菌不同盐浓度下生长情况；
图3显示了根据本发明一个实施例的巨大芽孢杆菌在盐浓度为8.5‰时的生长曲线图；
图4-5显示了根据本发明一个实施例的巨大芽孢杆菌的传代稳定性；
图6显示了巨大芽孢杆菌突变菌株在培养基上的菌落照片；
图7显示了巨大芽孢杆菌突变菌株的系统进化树示意图；
图8显示了代谢产物KEGG通路富集分析情况(SLD_VS_LD)，横坐标对应通路均为突变菌株Bacillus megaterium SLD相比原始菌株Bacillus megaterium LD的差异富集通路，其中Pvalue<0.001的标记为***，Pvalue<0.01的标记为**，Pvalue<0.05的标记为*；
图9显示了突变菌株Bacillus megaterium SLD和原始菌株Bacillus megateriumLD代谢产物中脯氨酸的相对含量；
图10显示了突变菌株Bacillus megaterium SLD和原始菌株Bacillusmegaterium LD代谢产物中甜菜碱的相对含量；
图11显示了突变菌株Bacillus megaterium SLD和原始菌株Bacillusmegaterium LD代谢产物中生育酚的相对含量。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
以下实施例所使用的培养基中，物料配比所用的百分数(％)及千分数(‰)计量单位，除特殊说明外均为质量百分比或质量千分比。
根据本发明的实施例，本发明第一方面提供了一种巨大芽孢杆菌突变菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25832。所提供的突变菌株的耐盐能力相对于原始菌株提升17％以上，同时具有较快的生长速度和传代稳定性，将其用于复合菌剂及微生物肥料的制备，在盐碱地土壤环境中可促进作物生长，改善根际环境，这对于微生物肥料在盐碱地中的应用具有重要意义。
本发明提供的巨大芽孢杆菌突变菌株经鉴定，突变菌株与原始菌株相似，均为革兰氏阳性，菌体呈杆状，具圆端。巨大芽孢杆菌突变菌株在LB培养基上形成近圆形菌落，且表面光滑，边缘整齐，淡黄色，不透明，带有光泽。
根据本发明的实施例，所述巨大芽孢杆菌突变菌株具有如SEQ IN NO:1所示的16SrDNA序列。
根据本发明的实施例，本发明第二方面提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括第一方面所述的巨大芽孢杆菌突变菌株。
根据本发明的实施例，所述微生物菌剂中巨大芽孢杆菌突变菌株的有效活菌数至少为1.0×1010CFU/g。
根据本发明的优选的实施例，所述微生物菌剂中巨大芽孢杆菌突变菌株的有效活菌数为1.0×1010CFU/g。
根据本发明的实施例，所述微生物菌剂为干粉状，所述微生物菌剂通过下述步骤获得：
对所述微生物菌剂进行放大发酵培养，对获得的发酵产物进行喷雾干燥、粉碎处理，以便获得所述微生物菌剂。
根据本发明的实施例，用于所述放大发酵培养的培养基按照重量份计，包括：
1～5重量份的豆粕，
1～5重量份的玉米粉，
0.1～1重量份的淀粉，
0.1～1重量份的葡萄糖，
0.02～0.3重量份的氯化钠，
0.1～0.8重量份的磷酸氢二钾，
0.01～0.2重量份的硫酸锰，
0.1～1重量份的消泡剂。
其中，用于所述放大发酵培养的培养基包括但不限于采用上述的培养基类型，其余可实现对所述微生物菌剂进行放大发酵培养的培养基均可用于本发明中。所述消泡剂可消除或抑制发酵过程中产生的泡沫，主要有聚醚类、硅类、硅醚复合类等，可根据实际发酵需要进行选择。
根据本发明的实施例，本发明第三方面提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第二方面所述的微生物菌剂。
根据本发明的实施例，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为第二方面所述的微生物菌剂，所述第二微生物菌剂包括选自贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述复合菌剂包括30～35重量份的所述第一微生物菌剂，所述复合菌剂包括30～35重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：
30～35重量份的贝莱斯芽孢杆菌；
30～35重量份的地衣芽孢杆菌；
30～35重量份的枯草芽孢杆菌。
根据本发明的实施例，所述复合菌剂包括巨大芽孢杆菌突变菌株，以及选自贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的至少之一；
其中，
巨大芽孢杆菌突变菌株的有效活菌数至少为1.0×1010CFU/g；
贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为1.0×1011CFU/g；
地衣芽孢杆菌的有效活菌数至少为1.0×1011CFU/g；
枯草芽孢杆菌的有效活菌数至少为1.0×1011CFU/g。
根据本发明的实施例，本发明第四方面提供了第一方面所述的巨大芽孢杆菌突变菌株，或第二方面所述的微生物菌剂，或第三方面所述的复合菌剂在制备微生物肥料中的应用。
根据本发明的实施例，本发明第五方面提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括第一方面所述的巨大芽孢杆菌突变菌株，和/或第二方面所述的微生物菌剂，和/或第三方面所述的复合菌剂。
根据本发明的实施例，所述微生物肥料为固体肥料或液体肥料。
根据本发明的实施例，所述微生物肥料中含有的微生物有效活菌数至少为2.0×107CFU/g。
根据本发明的实施例，所述微生物肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自复合肥、有机肥、有机无机肥中的至少之一。
根据本发明的实施例，本发明第六方面提供了一种植物施肥方法，所述方法包括：
对所述植物施加有效量的巨大芽孢杆菌突变菌株、微生物菌剂、复合菌剂、微生物肥料中的至少之一，所述巨大芽孢杆菌突变菌株为第一方面所述的巨大芽孢杆菌突变菌株，所述微生物菌剂为第二方面所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为第三方面所述的复合菌剂，所述微生物肥料为第五方面所述的微生物肥料。
根据本发明的实施例，所述植物选自马铃薯、玉米中的至少之一。
本发明中经ARTP诱变和MMC驯化，改变了原始菌株的合成代谢通路，并提供了一些与提高菌株耐盐能力相关的代谢通路和产物。所述代谢通路和产物均来自本发明第一方面所述的巨大芽孢杆菌突变菌株Bacillus megaterium SLD。所述代谢通路包括但不限于缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路，半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路。所述代谢产物包括但不限于调节渗透压的物质如脯氨酸、琥珀酸、5-氨基戊酸和甜菜碱等，抗氧化的物质如生育酚、肉碱和虾青素等。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1巨大芽孢杆菌的诱变及突变菌株的驯化和筛选
步骤一：巨大芽孢杆菌诱变
采用LB培养基，将巨大芽孢杆菌原始菌株Bacillus megaterium LD培养至对数生长期，调整菌悬液的浓度到106～108个/mL，对菌液进行ARTP诱变(无锡源清天木生物科技有限公司，ARTP-II型)。根据致死率确定适合菌株的ARTP诱变时间(如图1所示)，选择致死率85％-95％的处理时间，即选择ARTP诱变时间为25-35s的菌悬液，统一收集至新鲜的液体培养基中，得到突变库样本，备用；
步骤二：巨大芽孢杆菌单因素多水平试验
预先配制不同浓度盐分的发酵培养基，通过MMC(无锡源清天木生物科技有限公司，MMC-B1型)“单因素多水平”功能测定原始菌株的生长情况，以确定后续突变菌株驯化培养的实验参数。
具体而言，MMC设备根据原始菌株即巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium LD(保藏编号：CGMCC No.21828)的基本信息自动生成8个不同的盐浓度梯度，分别为5.6‰、5.98‰、6.41‰、6.79‰、7.225‰、7.6‰、7.98‰和9.6‰，配制发酵培养基。其中，发酵培养基配方：豆粕5％、玉米粉6％、淀粉1.5％、葡萄糖0.5％、硫酸锰0.2g/L、磷酸二氢钾3g/L，pH为7.5。所用调节盐浓度的适应因子为NaCl和MgCl2的混合盐溶液，按质量比1：1配制，通过调节加入的混合盐溶液的总质量实现发酵培养基盐浓度的调节。通过MMC“单因素多水平”功能测定原始菌株的生长情况。不同盐浓度下菌株的生长曲线如图2所示，结果显示在连续培养40h的过程中，随着盐浓度的增加，菌株生长(OD600)受到明显抑制，其中盐浓度为9.6‰时对菌株生长的抑制最为明显，同时由于6.79‰盐浓度对菌株生长有一定抑制，但菌株仍可生长，作为初始盐浓度进行驯化相对合适，故选择6.79‰盐浓度作为诱变菌株耐盐驯化的初始浓度；
步骤三：巨大芽孢杆菌突变菌株的耐盐性驯化
将步骤一中完成ARTP诱变的突变库样本按5％的接种量接入新鲜发酵培养基，混匀后转入MMC(无锡源清天木生物科技有限公司，MMC-B1型)，设置通过步骤二确定的实验参数，如表1所示，开始驯化实验。
表1MMC实验参数设置
突变菌株在0‰盐浓度下传代15代，传代时间为5.5h，在6.79‰盐浓度下驯化8代，在7.0‰盐浓度下驯化17代，在7.5‰盐浓度下驯化8代，在8.0‰盐浓度下驯化31代，在8.2‰盐浓度下驯化7代，在8.3‰盐浓度下驯化13代，在8.4‰盐浓度下驯化8代，在8.5‰盐浓度下驯化19代，选取生长最优的2、14、17、18、48号液滴稀释涂布。
与此同时，取活化后的原始菌株上机，重复步骤三作为对照组；
步骤四：巨大芽孢杆菌突变菌株的筛选
将步骤三得到的5株巨大芽孢杆菌突变菌株(2、14、17、18、48号)和作为对照组的原始菌株分别进行发酵，培养基配方采用步骤二中的培养基配方，盐浓度设定为8.5‰，实验结果如图3所示。与原始菌株相比，5株突变菌株生长速度明显提升，且各突变菌株生长趋势相近。培养10h时，各突变菌株生长量OD600相比原始菌株提高80％以上，培养至生长后期约38h时，17号突变菌株生长量最高，相比原始菌株，约提高17.82％(见表2)。根据试验结果筛选出17号菌株，将其编号为Bacillus megaterium SLD。
表2盐浓度为8.5‰时不同菌株38h生长情况
| 菌株 | 原始菌株 | 2号 | 14号 | 17号 | 18号 | 48号 |
| 生长量增加(OD600) | 5.28 | 6.194 | 6.203 | 6.221 | 6.163 | 5.589 |
实施例2巨大芽孢杆菌突变菌株的传代稳定性
将实施例1中筛选得到的突变菌株Bacillus megaterium SLD连续传代5-10次后再次验证耐盐效果。将Bacillus megaterium SLD突变菌株在盐浓度为6.5‰和8.5‰的发酵培养基中连续培养30h，分别在6h、12h、24h和30h检测菌液OD600，并将其与原始菌株进行对比，结果如图4-5所示。结果表明：
(1)盐浓度在6.5‰时，原始菌株培养6h、12h、24h和30h的生物量分别为0.521、0.809、1.207和1.160，突变菌株生物量分别为1.213、1.490、1.398和1.360。与原始菌株相比，突变菌株培养6h、12h、24h和30h的生物量分别提高132％、84％、15％和17％以上；
(2)盐浓度为8.5‰时，原始菌株培养6h、12h、24h和30h的生物量分别为0.489、0.716、1.153和1.096，突变菌株生物量分别为1.175、1.395、1.315和1.308。与原始菌株相比，突变菌株培养6h、12h、24h和30h的生物量分别提高140％、94％、14％和19％以上；
(3)突变菌株在12h左右即达到稳定生长期，原始菌株约24h才能达到；
以上结果表明筛选得到的突变菌株Bacillus megaterium SLD在一定盐浓度条件下经过多次连续传代后，相比原始菌株，其生长速度和生物量仍有明显提高。
实施例3巨大芽孢杆菌突变菌株的鉴定
对该突变菌株进行形态特征和分子生物学鉴定。
(1)形态特征：
对突变菌株Bacillus megaterium SLD和原始菌株进行革兰氏染色和稀释涂布，结果显示突变菌株与原始菌株相似，均为革兰氏阳性，菌体呈杆状，具圆端。突变菌株在LB培养基上形成近圆形菌落，且表面光滑，边缘整齐，淡黄色，不透明，带有光泽(如图6所示)。
(2)分子生物学特征：
突变菌株Bacillus megaterium SLD的16S rDNA基因序列(1421bp)及系统发育树分析结果如下：
TGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCC(SEQ ID NO：1)
其16S rDNA的系统分析结果如图7所示，突变菌株的基因测序结果与Bacillusmegaterium 728E DQ904608以99％支持率聚成同一分支，确定该突变菌株为巨大芽孢杆菌。
实施例4微生物菌剂制备及盐碱土定殖促生效果验证
将试管中保存的巨大芽孢杆菌(CGMCC No.21828)和巨大芽孢杆菌突变株(CGMCCNo.25832)，分别用接种环接种至含有100mL LB培养液的三角瓶(250mL)中，培养温度为37℃，转速为210rpm，于恒温培养箱中培养16h，收集菌体制备菌悬液，备用。
使用玉米开展盐碱土实验，设定每盆土壤7kg，玉米2株，每组处理设置15盆，土壤盐分含量为4.24g/kg。玉米出苗后，采用上述制备过程制备的菌悬液进行灌根，保证土壤中的活菌数达到300万CFU/g，空白组按正常水量进行浇灌，盐碱土壤具体指标如表3所示。
在玉米生长1个月后，跟踪玉米根际土壤定殖的活菌数及玉米生长情况。实验结果显示，在盐碱土壤中原始菌株Bacillus megaterium LD和突变菌株Bacillus megateriumSLD均能够有效定殖，玉米根际土壤定殖的活菌数分别为96和202万CFU/g，突变菌株Bacillus megaterium SLD相比原始菌株提高110.42％，具体如表4所示。促生结果显示，突变菌株Bacillus megaterium SLD相比原始菌株在玉米株高、鲜重和干重方面，分别提高13.38％、9.63％和16.67％，说明在盐碱土壤中突变菌株具有更强的适应能力和促进作物生长的能力，具体如表5所示。
表3盐碱土各检测指标
表4各菌株在盐碱土中的定殖效果
表5各菌株在盐碱土中的促生效果
实施例5复合菌剂制备及效果验证
本实施例提供了一种复合菌剂，具体通过下述方法制备获得：
将平皿中保存的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium SLD，用接种环接种至含有100mL LB培养液的三角瓶(250mL)中，培养温度为37℃，转速为210rpm，于恒温培养箱中培养16h。同时，纯化、接种、培养产业化菌株枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌(均为中化化肥有限公司临沂研发中心自主筛选功能菌株)，这几种菌株分别选择两种和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium SLD复配，质量比为1:1:1，进行盐碱地玉米大田促生效果验证。
将上述Bacillus megaterium SLD培养16h菌液接种至放大发酵罐中(10L—50L—500L)，于32℃进行培养，逐级进行发酵。发酵完成后进行喷雾干燥，分装，活菌数为100亿CFU/g。其中放大发酵培养基配方为：豆粕3％，玉米粉2％，淀粉0.5％，葡萄糖0.50％，氯化钠0.10％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸锰0.02％，消泡剂0.3％，pH调节为7.0。复合菌剂所含其余菌株均按照Bacillus megaterium SLD菌剂制备流程进行制备，最终将各菌剂按比例混合，复配比例为1:1:1，分别制备3组(T1：Bacillus megaterium LD+枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌；T2：Bacillus megaterium SLD+枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌；T3：Bacillusmegaterium SLD+枯草芽孢杆菌+贝莱斯芽孢杆菌)，制备完成用于田间试验。
本次实验设置5组处理，每组处理3个区域，每个区域50m2，分别为对照组1(不添加菌剂)、对照组2(添加市场菌剂，包括巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌)、实验组1、实验组2和实验组3。实验结果见表6，结果显示实验组3(T3复合菌剂)对玉米的促生效果最显著，相比对照组1、对照组2和实验组1(T1复合菌剂)，分别提高18.56％、6.70％和3.43％。其次为实验组2(T2复合菌剂)，相比对照组1、对照组2和实验组1(T1复合菌剂)，分别提高17.98％、6.18％和2.92％。说明在盐碱土壤中含有突变菌株的复合菌剂具有更强的促进作物生长的能力。
表6复合菌剂效果验证结果
实施例6微生物肥料制备及效果验证
分别将实施例5中制备的复合菌剂T1、T2和T3在有机肥、复合肥包膜工段与防结粉混合均匀后按照2‰的比例添加，待稳定生产后所得相应的肥料即为微生物肥料，有效活菌数≥0.2亿CFU/g。上述用作制备微生物肥料的基础肥料分别为颗粒有机肥(总养分≥5％，有机质≥30％)，复合肥为纯硫基复合肥15-15-15/S。
将所制备的微生物肥料进行田间效果验证，在山东省临沂市开展实验。共设置8组处理，包括对照组1、对照组2(市场菌剂产品，包括巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌)和实验组1、2、3、4、5、6，每组处理3个区域，每个区域50m2，肥料施用量为复合肥50Kg/亩或复合肥30Kg+有机肥50kg/亩。对照组1为常规施肥，肥料中不添加菌剂，对照组2为施用市场购买的微生物肥料。实验具体处理及效果见表7。
结果表明添加T1、T2和T3菌剂的有机肥和复合肥效果明显优于对照组和市场菌剂产品，同时，添加T2菌剂和T3菌剂相比添加T1菌剂，复合肥实验组产量分别增加10.84％和11.24％，复合肥+有机肥实验组产量分别增加9.77％和9.92％，说明含有突变菌株的微生物肥料(添加T2/T3菌剂)相比含有原始菌株的微生物肥料(添加T1菌剂)更能够促进作物生长。
表7微生物肥料各处理实验结果
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实施例7突变菌株Bacillus megaterium SLD代谢组学研究
本实施例提供了突变菌株Bacillus megaterium SLD代谢产物的研究内容，并对耐盐相关功能物质进行分析，具体步骤如下：
(1)将平皿中保存的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium SLD，用接种环接种至含有100mL LB培养液的三角瓶(250mL)中，培养温度为37℃，转速为210rpm，于恒温培养箱中培养16h。原始菌株Bacillus megaterium LD进行相同处理；
(2)采用上述菌液开展3L小试，制备代谢产物，小试发酵培养基配方为：豆粕3％，玉米粉2％，淀粉0.5％，葡萄糖0.5％，氯化钠0.10％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸锰0.02％，消泡剂0.3％，pH调节为7.0。发酵24h后，离心收集发酵上清液，备用；
(3)将上述步骤(2)中制备的发酵上清液送至上海美吉生物医药科技有限公司进行非靶向代谢组学分析。
代谢组学实验结果显示，经ARTP诱变和MMC驯化，改变了原始菌株的合成代谢通路。主要是通过改变氨基酸相关的代谢通路，如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路，半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路等，合成更多调节渗透压和抗氧化的物质，以提高菌株对盐分的耐受性。其中，合成的调节渗透压的物质有脯氨酸、琥珀酸、5-氨基戊酸和甜菜碱等，合成的抗氧化的物质有生育酚、肉碱和虾青素等。说明突变菌株Bacillus megaterium SLD通过产生更多的调节渗透压和抗氧化的物质，提高自身的耐盐能力。具体如图8-11所示，其中图8为代谢产物KEGG通路富集分析情况，横坐标对应通路均为突变菌株相比原始菌株差异富集通路，Pvalue<0.001的标记为***，Pvalue<0.01的标记为**，Pvalue<0.05的标记为*，Pvalue值越小差异越大。
综上，本发明通过ARTP诱变和MMC耐盐驯化，获得一株耐盐能力提升17％以上的巨大芽孢杆菌突变菌株，其具有较快生长速度和传代稳定性，且能够产生更多调节渗透压和抗氧化的物质，提高自身耐盐能力，可将其用于制备复合菌剂以及应用于微生物肥料中。本发明不仅提高了菌种选育的效率，扩大了菌株的适应范围，而且对于改善盐碱地环境中作物的生长状态和作物根际环境，提升微生物肥料在盐碱地中的作用效果具有重要意义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本公开的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本公开的限制，本领域的普通技术人员在本公开的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (16)
1.一种巨大芽孢杆菌突变菌株(Bacillus megaterium SLD)，于2022年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25832。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括权利要求1所述的巨大芽孢杆菌突变菌株。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中巨大芽孢杆菌突变菌株的有效活菌数至少为1.0×1010CFU/g。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为干粉状，所述微生物菌剂通过下述步骤获得：
对所述微生物菌剂进行放大发酵培养，对获得的发酵产物进行喷雾干燥、粉碎处理，以便获得所述微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，用于所述放大发酵培养的培养基按照重量份计，包括：
1～5重量份的豆粕，
1～5重量份的玉米粉，
0.1～1重量份的淀粉，
0.1～1重量份的葡萄糖，
0.02～0.3重量份的氯化钠，
0.1～0.8重量份的磷酸氢二钾，
0.01～0.2重量份的硫酸锰，
0.1～1重量份的消泡剂。
6.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括权利要求2-5中任一项所述的微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为权利要求2-5中任一项所述的微生物菌剂，所述第二微生物菌剂包括选自贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的至少之一。
8.根据权利要求7所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括30～35重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：
30～35重量份的贝莱斯芽孢杆菌；
30～35重量份的地衣芽孢杆菌；
30～35重量份的枯草芽孢杆菌。
9.根据权利要求7或8所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括巨大芽孢杆菌突变菌株，以及选自贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的至少之一；
其中，
巨大芽孢杆菌突变菌株的有效活菌数至少为1.0×1010CFU/g；
贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为1.0×1011CFU/g；
地衣芽孢杆菌的有效活菌数至少为1.0×1011CFU/g；
枯草芽孢杆菌的有效活菌数至少为1.0×1011CFU/g。
10.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌突变菌株，或权利要求2-5中任一项所述的微生物菌剂，或权利要求6-9所述的复合菌剂在制备微生物肥料中的应用。
11.一种微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料包括权利要求1所述的巨大芽孢杆菌突变菌株，和/或权利要求2-5中任一项所述的微生物菌剂，和/或权利要求6-9中任一项所述的复合菌剂。
12.根据权利要求11所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料为固体肥料或液体肥料。
13.根据权利要求11所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料中含有的微生物有效活菌数至少为2.0×107CFU/g。
14.根据权利要求11所述的微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自复合肥、有机肥、有机无机肥中的至少之一。
15.一种植物施肥方法，其特征在于，包括：
对所述植物施加有效量的巨大芽孢杆菌突变菌株、微生物菌剂、复合菌剂、微生物肥料中的至少之一，所述巨大芽孢杆菌突变菌株为权利要求1所述的巨大芽孢杆菌突变菌株，所述微生物菌剂为权利要求2-5中任一项所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为权利要求6-9中任一项所述的复合菌剂，所述微生物肥料为权利要求11-14中任一项所述的微生物肥料。
16.根据权利要求15所述的植物施肥方法，其特征在于，所述植物选自马铃薯、玉米中的至少之一。
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