CN106190921A - 一种谷氨酸棒状杆菌与应用 - Google Patents

一种谷氨酸棒状杆菌与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌与应用，所述谷氨酸棒状杆菌与谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032的基因组序列相比较，与缬氨酸合成相关的酶的氨基酸序列存在许多碱基突变，保藏号为CGMCC No.12152，在制备缬氨酸方面具有重要应用价值。

Description

一种谷氨酸棒状杆菌与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是一种谷氨酸棒状杆菌与应用。
背景技术
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，是一类好氧的革兰氏阳性菌，主要生存于土壤中，不具有致病性。主要应用领域为微生物发酵，其产品包括氨基酸、有机酸、维生素等，在全世界范围内皆有广泛应用。目前，大部分氨基酸，包括L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸等，都可运用谷氨酸棒状杆菌发酵生产。
国内的L-缬氨酸生产以谷氨酸棒杆菌的发酵法为主，平均产酸可达60g/L或更高。目前，L-缬氨酸高产菌株主要通过传统的诱变育种选育获得，或在此基础之上结合一部分基因工程的改造，但是目前尚未有报道明确描述L-缬氨酸生产菌株的完整的基因信息和L-缬氨酸的高效合成机制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种谷氨酸棒状杆菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述谷氨酸棒状杆菌的应用，用于高产缬氨酸。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种谷氨酸棒状杆菌，与谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032的基因组序列相比较，与缬氨酸合成相关的酶的氨基酸序列存在如下碱基突变：
苏氨酸脱水酶：A95T，核苷酸序列为序列表<400>1所示序列；
乙酰羟酸合酶催化亚基：K30Q、G128S、A138V、A226S、Y252H、T362S，核苷酸序列为序列表<400>2所示序列；
乙酰羟酸合酶调控亚基：H47L，核苷酸序列为序列表<400>3所示序列；
酮酸异构还原酶：T301A，核苷酸序列为序列表<400>4所示序列；
二羟酸脱水酶：V375E，核苷酸序列为序列表<400>5所示序列；
分支链氨基酸氨基转移酶：Q253H；核苷酸序列为序列表<400>6所示序列；
异丙基苹果酸合酶：E69K、G92D、I162V、R494H、G526D，核苷酸序列为序列表<400>7所示序列；
异丙基苹果酸异构酶大亚基：K93Q、G317S、S319T、S322N、I481L，核苷酸序列为序列表<400>8所示序列；
异丙基苹果酸异构酶小亚基：Y7H，核苷酸序列为序列表<400>9所示序列；
异丙基苹果酸脱氢酶：I334V、K336R，核苷酸序列为序列表<400>10所示序列。
优选的，上述谷氨酸棒状杆菌，为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)XV，保藏号CGMCC No.12152。
上述谷氨酸棒状杆菌在制备缬氨酸方面的应用。
优选的，上述谷氨酸棒状杆菌的应用，制备缬氨酸的具体步骤如下：
(1)斜面培养：置于32-34℃培养箱，第一代活化斜面培养18-24h，第二代活化斜面培养12-16h，经过两代活化培养之后的菌种直接接种于摇瓶种子培养基培养，或置于4℃保存；
(2)摇瓶种子培养：从二代斜面上接种2-4环，置于水平旋转摇床，32-34℃，180-200r/min，培养12h，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间；
(3)二级种子培养：接种量为8-10％，32-34℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，培养至OD600＝15-20；
(4)发酵罐发酵：接种量为10-13％，32-34℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，培养40-50h。
优选的，上述谷氨酸棒状杆菌的应用，制备缬氨酸的具体步骤如下：
(1)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h，经过两代活化培养之后的菌种直接接种于摇瓶种子培养基培养，或置于4℃保存；
(2)摇瓶种子培养：从二代斜面上接种2-4环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间；
(3)二级种子培养：接种量为8-10％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，培养至OD600＝15-20；
(4)发酵罐发酵：接种量为10-13％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，培养40-50h。
优选的，上述谷氨酸棒状杆菌的应用，所述制备缬氨酸的过程中使用培养基具体组成如下：
活化斜面培养基组成为(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂条20，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
摇瓶种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆饼粉水解液20，玉米浆20，NaCl 5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，亮氨酸0.1，异亮氨酸0.1，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
二级种子培养基组成为(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆饼粉水解液20，玉米浆20，NaCl 5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，亮氨酸0.1，异亮氨酸0.1，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖60，豆饼粉水解液25，玉米浆40，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，VB1 0.01，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水。
上述谷氨酸棒状杆菌的应用中所述谷氨酸棒杆菌XV经发酵罐发酵培养后，发酵液中平均可检测到缬氨酸80g/L。
本发明的有益效果是：
本发明所提供谷氨酸棒杆菌是利用传统育种手段中的化学诱变法成功筛选到的一株高效的缬氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌XV株，该菌株经摇瓶发酵培养后，发酵液中平均可检测到缬氨酸30g/L，较原始菌株的0.3g/L，进步显著，经30L发酵罐44-50h发酵后，发酵液中平均可检测到缬氨酸80g/L；对该谷氨酸棒杆菌XV株进行全基因组测序，并在此基础上对其进行基因组学分析，确认诱变之后的菌株的缬氨酸产量明显提高，其最主要原因就是XV株的缬氨酸合成途径中相关基因的碱基突变所导致，为缬氨酸合成及基因研究提供了新的方向与途径。
附图说明
图1是实施例3中缬氨酸HPLC检测结果图；
图2是实施例4中缬氨酸HPLC检测结果图；
图3是实施例5中缬氨酸HPLC检测结果图。
保藏信息
分类名词：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年03月01日
保藏号：CGMCC No.12152
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
谷氨酸棒杆菌的化学诱变
(1)以土壤中分离得到的谷氨酸棒杆菌作为出发菌株，首先在完全培养基斜面上活化，32℃培养12小时；
(2)从斜面接种于液体种子培养基，种子培养基为LB，32℃培养12小时；
(3)用生理盐水对培养后的细胞进行洗涤，重复一次后，用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬菌体，制成107-108细胞/mL的菌悬液；
(4)取5-10mL菌悬液，加入到无菌试管中，再加入1％(V/V)硫酸二乙酯，试管用棉塞封口，震荡30-40min；
(5)用适量无菌水稀释，涂布于含有磺胺胍、L-缬氨酸结构类似物的抗性筛选培养基上，32℃培养，待生长出单菌落；
(6)初筛方式：单菌落利用96孔板培养，以纸层析检测L-缬氨酸产量；
(7)复筛方式：在摇瓶中进行发酵，产物用HPLC进行检测。
实施例2
谷氨酸棒杆菌XV的基因组测序
(1)基因组的提取：使用PROMEGA公司的细菌基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Purification Kit A1120，利用核酸分析仪检测，保证基因组DNA的质量符合测序需要；
(2)利用三代测序平台PacBio RS II对基因组进行测序；
(3)利用PacBio公司提供的装软件对基因组进行组装，并使用相关软件进行常规的比较基因组分析。在基因组序列的基础上，通过对缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌XV与谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032的基因组序列相比较，发现其缬氨酸合成相关基因序列中存在较多碱基突变，碱基突变导致各基因编码产物的氨基酸序列存在以下改变(采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示谷氨酸棒杆菌XV相较于标准株ATCC 13032(Genebank：NC_003450)在相同的酶上发生的氨基酸突变，突变前后的各基因序列所包含的碱基数均与标准株ATCC 13032一致)：
苏氨酸脱水酶：A95T；核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。
乙酰羟酸合酶催化亚基：K30Q、G128S、A138V、A226S、Y252H、T362S；核苷酸序列为序列表<400>2所示序列。
乙酰羟酸合酶调控亚基：H47L；核苷酸序列为序列表<400>3所示序列。
酮酸异构还原酶：T301A；核苷酸序列为序列表<400>4所示序列。
二羟酸脱水酶：V375E；核苷酸序列为序列表<400>5所示序列。
分支链氨基酸氨基转移酶：Q253H；核苷酸序列为序列表<400>6所示序列。
异丙基苹果酸合酶：E69K、G92D、I162V、R494H、G526D；核苷酸序列为序列表<400>7所示序列。
异丙基苹果酸异构酶大亚基：K93Q、G317S、S319T、S322N、I481L；核苷酸序列为序列表<400>8所示序列。
异丙基苹果酸异构酶小亚基：Y7H；核苷酸序列为序列表<400>9所示序列。
异丙基苹果酸脱氢酶：I334V、K336R；核苷酸序列为序列表<400>10所示序列。
实施例3
基因突变前后菌株缬氨酸合成能力比较
(1)活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂条20，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(2)摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆饼粉水解液20，玉米浆20，NaCl5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，亮氨酸0.1，异亮氨酸0.1，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(3)摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，豆饼粉水解液25，玉米浆40，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，VB1 0.01，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(4)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h，经过两代活化培养之后的菌种可直接接种于摇瓶种子培养基培养，也可置于4℃保存；
(5)摇瓶种子培养：容积500mL的三角瓶，装液量为30mL，从二代斜面上接种1-2环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水维持发酵液的pH在6.7到7.2之间；
(6)摇瓶发酵培养：容积500mL的三角瓶，装液量为30mL，接种量为10％，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养36h，培养过程使用氨水维持发酵液的pH在6.7到7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L；
(7)发酵结束后，用HPLC分析发酵液中缬氨酸浓度，标准株ATCC 13032的发酵液中基本检测不到缬氨酸，基因突变之前的菌株的发酵液中最多检测到缬氨酸0.3g/L，突变后菌株的发酵液中平均可检测到缬氨酸30g/L,见图1。
实施例4
基因突变后菌株(XV株)的30L发酵罐分批发酵实验
(1)活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂条20，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(2)摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆饼粉水解液20，玉米浆20，NaCl5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，亮氨酸0.1，异亮氨酸0.1，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(3)二级种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆饼粉水解液20，玉米浆20，NaCl5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，亮氨酸0.1，异亮氨酸0.1，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(4)发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，豆饼粉水解液25，玉米浆40，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，VB1 0.01，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(5)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h，经过两代活化培养之后的菌种可直接接种于摇瓶种子培养基培养，也可置于4℃保存；
(6)摇瓶种子培养：容积1000mL的三角瓶，装液量为100mL，从二代斜面上接种2到4环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水维持发酵液pH在6.7到7.2之间；
(7)二级种子培养：采用5L发酵罐，装液量为3L，接种量为8％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，培养周期在12小时，用分光光度计在波长为600纳米处检测吸光度为16；
(8)30L发酵罐分批发酵：装液量为16L，接种量为10％，32℃培养，发酵过程的溶氧控制在20％到30％之间，培养过程使用氨水维持发酵液pH在6.7到7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，发酵周期为40小时；
(9)发酵结束后，用HPLC分析发酵液中缬氨酸浓度，可检测到缬氨酸67g/L，见图2。
实施例5
基因突变后菌株(XV株)的30L发酵罐分批发酵实验
(1)活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂条20，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(2)摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆饼粉水解液20，玉米浆20，NaCl5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，亮氨酸0.1，异亮氨酸0.1，苯酚红溶液(0.4g/L)20mL，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(3)二级种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，豆饼粉水解液20，玉米浆20，NaCl5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，亮氨酸0.1，异亮氨酸0.1，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(3)发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，豆饼粉水解液25，玉米浆40，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，VB1 0.01，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
(4)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h，经过两代活化培养之后的菌种可直接接种于摇瓶种子培养基培养，也可置于4℃保存；
(5)摇瓶种子培养：容积1000mL的三角瓶，装液量为100mL，从二代斜面上接种2到4环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水维持发酵液pH在6.7到7.2之间；
(6)二级种子培养：采用5L发酵罐，装液量为3L，接种量为10％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，培养周期在16小时，用分光光度计在波长为600纳米处检测吸光度到20；
(7)30L发酵罐分批发酵：装液量为16L，接种量为13％，32℃培养，发酵过程的溶氧控制在20％到30％之间，培养过程使用氨水维持发酵液pH在6.7到7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，发酵周期为50小时；
(8)发酵结束后，用HPLC分析发酵液中缬氨酸浓度，可检测到缬氨酸80g/L，见图3。
上述参照具体实施方式对该一种谷氨酸棒状杆菌与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：与谷氨酸棒杆菌标准株ATCC13032的基因组序列相比较，与缬氨酸合成相关的酶的氨基酸序列存在如下碱基突变：
苏氨酸脱水酶：A95T，核苷酸序列为序列表<400>1所示序列；
乙酰羟酸合酶催化亚基：K30Q、G128S、A138V、A226S、Y252H、T362S，核苷酸序列为序列表<400>2所示序列；
乙酰羟酸合酶调控亚基：H47L，核苷酸序列为序列表<400>3所示序列；
酮酸异构还原酶：T301A，核苷酸序列为序列表<400>4所示序列；
二羟酸脱水酶：V375E，核苷酸序列为序列表<400>5所示序列；
分支链氨基酸氨基转移酶：Q253H，核苷酸序列为序列表<400>6所示序列；
异丙基苹果酸合酶：E69K、G92D、I162V、R494H、G526D，核苷酸序列为序列表<400>7所示序列；
异丙基苹果酸异构酶大亚基：K93Q、G317S、S319T、S322N、I481L，核苷酸序列为序列表<400>8所示序列；
异丙基苹果酸异构酶小亚基：Y7H，核苷酸序列为序列表<400>9所示序列；
异丙基苹果酸脱氢酶：I334V、K336R，核苷酸序列为序列表<400>10所示序列。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：为谷氨酸棒状杆菌XV，保藏号CGMCC No.12152。
3.权利要求1或2所述谷氨酸棒状杆菌在制备缬氨酸方面的应用。
4.根据权利要求3所述的谷氨酸棒状杆菌的应用，其特征在于：制备缬氨酸的具体步骤如下：
(1)斜面培养：置于32-34℃培养箱，第一代活化斜面培养18-24h，第二代活化斜面培养12-16h，经过两代活化培养之后的菌种直接接种于摇瓶种子培养基培养，或置于4℃保存；
(2)摇瓶种子培养：从二代斜面上接种2-4环，置于水平旋转摇床，32-34℃，180-200r/min，培养12h，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间；
(3)二级种子培养：接种量为8-10％，32-34℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，培养至OD600＝15-20；
(4)发酵罐发酵：接种量为10-13％，32-34℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，培养40-50h。
5.根据权利要求4所述的谷氨酸棒状杆菌的应用，其特征在于：制备缬氨酸的具体步骤如下：
(1)斜面培养：置于32℃培养箱，第一代活化斜面培养24h，第二代活化斜面培养12h，经过两代活化培养之后的菌种直接接种于摇瓶种子培养基培养，或置于4℃保存；
(2)摇瓶种子培养：从二代斜面上接种2-4环，置于水平旋转摇床，32℃，200r/min，培养12h，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间；
(3)二级种子培养：接种量为8-10％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，培养至OD600＝15-20；
(4)发酵罐发酵：接种量为10-13％，32℃培养，溶氧维持在20-30％，培养过程使用氨水调节pH维持在6.7-7.2之间，发酵液葡萄糖浓度维持不低于10g/L，培养40-50h。
6.根据权利要求4或5所述的谷氨酸棒状杆菌的应用，其特征在于：所述制备缬氨酸的过程中使用培养基具体组成如下：
活化斜面培养基按g/L计组成为：葡萄糖10，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂条20，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
摇瓶种子培养基按g/L计组成为：葡萄糖30，酵母粉5，豆饼粉水解液20，玉米浆20，NaCl5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，亮氨酸0.1，异亮氨酸0.1，0.4g/L苯酚红溶液20mL，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
二级种子培养基按g/L计组成为：葡萄糖30，酵母粉5，豆饼粉水解液20，玉米浆20，NaCl5，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，亮氨酸0.1，异亮氨酸0.1，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水；
发酵培养基按g/L计组成为：葡萄糖60，豆饼粉水解液25，玉米浆40，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·12H2O 2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，VB1 0.01，pH 6.7-7.2，其余为蒸馏水。
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