CN113881723A - L-缬氨酸的发酵、分离以及纯化方法 - Google Patents

L-缬氨酸的发酵、分离以及纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于氨基酸生产技术领域，提供了L‑缬氨酸的发酵、分离以及纯化方法，其包括如下步骤：采用恒容发酵工艺获得L‑缬氨酸发酵液，收集L‑缬氨酸发酵液，离心收集上清液和菌体沉淀，菌体沉淀进入饲料加工工序；将上清液通过中空纤维膜进行过滤，收集滤过液；往滤过液中添加活性炭进行脱色，板框过滤，收集脱色液；将脱色液进行减压蒸发至有少量晶体析出，然后进入结晶罐，调整pH，搅拌结晶，过滤，收集晶体，洗涤，烘干，即得。本发明方法发酵产率高，并且分离纯化工艺工业能耗低，属于环境友好型工艺。

Description

L-缬氨酸的发酵、分离以及纯化方法
技术领域
本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及L-缬氨酸的发酵、分离以及纯化方法。
背景技术
L-缬氨酸是人和动物机体所必需的八种氨基酸之一，与亮氨酸、异亮氨酸同属于三种支链氨基酸，在生理上具有多种调节功能，在人类生命代谢中具有重要的地位，其除用于一般营养型膳食配制以外，还大量用于生产各类复合氨基酸制剂，在医疗方面具有极为广泛的应用。L-缬氨酸是药用氨基酸原料中用量最大的品种之一。目前来看，L-缬氨酸主要利用谷氨酸棒状杆菌进行微生物发酵生产，此生产方式具有成本低、条件温和以及可大规模生产等优点，是非常经济的一种生产方法。因此，利用微生物发酵法生产缬氨酸具有重要意义。
缬氨酸的发酵法已经应用于工业生产中，如何提高发酵产率是关注焦点。但是，对发酵液进行进一步的分离和纯化也是企业关注的重点。缬氨酸发酵液中成分复杂，不仅含有缬氨酸，而且含有色素、蛋白质、多糖、还原糖等，分离过程难度较大。
文献1：CN101580475A公开了一种提取分离缬氨酸的工艺，包括超滤膜过滤、浓缩、重结晶、离子交换等工艺，获得了食品医药级的缬氨酸产品。文献2：CN105294467A分离提取缬氨酸的工艺包括：制备发酵液；微滤；超滤：将步骤(2)中获得的微滤后母液选用超滤膜技术进行过滤；(4)离子交换柱吸附、洗脱；(5)间歇搅拌脱色；(6)板框过滤；(7)间歇补料真空浓缩；(8)降温结晶；(9)离心洗涤；(10)结晶干燥。上述技术能够获得较高的提取率和纯度，但是使用了离子交换，成本高，而且会产生大量的废水。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供缬氨酸的发酵、分离以及纯化方法，该方法能够获得较高的发酵产率，并且分离纯化工艺工业能耗低，环境友好性高。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
L-缬氨酸的发酵、分离以及纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
采用恒容发酵工艺获得L-缬氨酸发酵液，收集L-缬氨酸发酵液，离心收集上清液和菌体沉淀，菌体沉淀进入饲料加工工序；将上清液通过中空纤维膜进行过滤，收集滤过液；往滤过液中添加活性炭进行脱色，板框过滤，收集脱色液；将脱色液进行减压蒸发至有少量晶体析出，然后进入结晶罐，调整pH为6，搅拌结晶，过滤，收集晶体，洗涤，烘干，即得。
进一步地，
所述恒容发酵工艺包括如下步骤：按10-20％的接种量将产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌种子液接入装有20L发酵罐培养基的发酵罐中，发酵进行至32h时，以0.85L/h的速率流加补充葡萄糖营养液，并以0.15L/h的速率流加补充代谢调节液；同时以1L/h的速率放出发酵液；当发酵进行至84h时，结束发酵；整个发酵过程中，温度控制在30-32℃培养，溶氧控制在20-25％。
进一步地，
所述离心为：用碟片式离心机以5000rpm离心4min。
进一步地，
所述中空纤维膜的孔径为0.1-0.2μm。
进一步地，
所述活性炭脱色为：添加量为1g：100ml，脱色温度为60℃，脱色时间为60min。
优选地，
所述发酵培养基组分为：葡萄糖140g/L，玉米浆40g/L，黄豆饼粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，VB1 10mg/L，pH6.7-7.2。
优选地，
所述葡萄糖营养液组分中葡萄糖的含量为100-150g/L。
优选地，
所述代谢调节液的组分包括正丙醇和/或3-氟代丙酮酸。
更优选地，
所述葡萄糖营养液组分为：葡萄糖140g/L，KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、VB1 0.4mg/L、玉米浆干粉4g/L。
更优选地，
所述代谢调节液组分为：正丙醇5g/L，3-氟代丙酮酸20mg/L。
本发明的技术方案具备如下有益效果：
本发明采用提高缬氨酸产酸效率的恒容发酵控制方式，通过同时流加补料与放料的方式，控制发酵全程装液量恒定，同时调节流加补料，在满足装液量恒定的情况下维持罐内L-缬氨酸浓度在一定范围内不变，防止发酵后期由于罐内L-缬氨酸浓度积累过高造成的反馈抑制效果，同时维持菌体活力延长产酸高峰期，提高单批次L-缬氨酸产量与产酸效率，降低副产物L-丙氨酸合成量。
针对缬氨酸发酵代谢合成途径进行补充添加葡萄糖营养液和代谢调节液，葡萄糖营养液提供了菌株正常生长维持活性的营养物质，代谢调节液中包括正丙醇和3-氟代丙酮酸，其中一定添加量的3-氟代丙酮酸能够抑制部分丙酮酸脱氢酶的酶活，导致更多地代谢流转入缬氨酸合成途径，正丙醇可能通过对菌株产生一定的胁迫作用而提高缬氨酸的积累，也可能通过激活缬氨酸合成中的关键酶，例如缬氨酸脱氢酶的酶活力来促进缬氨酸的合成，具体机制还需要进一步的研究阐明。
本发明分离纯化方法简单可行，占地面积小，工业能耗低，不采用离子交换树脂技术，其产生的废水大幅减少，环境友好性高，制备的产品完全适合饲用要求，具备较高的实用价值。
附图说明
图1：发酵罐结构图，1、压力表；2、液位电极；3、补料罐I；4、补料罐II；5、补料罐III；6、罐体；7、搅拌轴；8、搅拌叶片；9、放料口；10、蠕动泵；11、储液箱；
图2：恒容发酵工艺中代谢调节液组分对发酵液中缬氨酸浓度的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本发明使用的谷氨酸棒杆菌为现有菌株，保藏号为CGMCC.NO.12152(参见CN106190921B)。
实施例1
一种提高L-缬氨酸产酸效率的恒容发酵控制方式，通过同时进行流加补料与放料的方式，控制发酵全程装液量恒定，同时调节流加补料，在满足装液量恒定的情况下维持罐内L-缬氨酸浓度在一定范围内不变，具体实施如下：
如图1所示，在发酵罐(体积为30L)罐体6的底部处有一放料口9通过自动取料蠕动泵10与储液箱11连接，此蠕动泵速率与流加补料速率相等；在罐体装液量80％处装有液位电极2，当出现发酵异常及其他情况导致装液量过高超过80％时，自动打80％液位处的放料口开关。搅拌轴7带动搅拌叶片8以转速150rpm搅拌培养，压力表1用于监控罐压。
缬氨酸的发酵培养时，按10％的接种量将谷氨酸棒杆菌种子液接入装有20L发酵罐培养基的30L发酵罐中，接种浓度OD600为2左右，发酵培养基组分为：葡萄糖140g/L，玉米浆40g/L，黄豆饼粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，VB1 10mg/L，pH6.7-7.2，其余为蒸馏水。32℃培养，溶氧控制在20％，在发酵进行至32h时，测得罐内葡萄糖浓度为1g/L左右，此时L-缬氨酸浓度为60.4g/L。补料罐I开始以0.85L/h的速率流加补充葡萄糖营养液，组分为：葡萄糖140g/L，KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、VB1 0.4mg/L、玉米浆干粉4g/L；补料罐II开始以0.15L/h的速率流加补充代谢调节液，组分为：正丙醇5g/L，3-氟代丙酮酸20mg/L；同时放料口9以1L/h的速率放出发酵液；补料罐III用于流加氨水控制pH为6.8-7.0之间。
发酵罐内L-缬氨酸浓度在60g/L左右浮动，当发酵进行至72h时罐内L-缬氨酸浓度开始呈轻微下降趋势，当发酵进行至84h时，罐内L-缬氨酸浓度下降至50.6g/L，此时停罐结束发酵。
对比例1
缬氨酸的发酵培养时，按10％的接种量将谷氨酸棒杆菌种子液接入装有18L发酵罐培养基的30L发酵罐中，接种浓度OD600为2，发酵培养基组分为：葡萄糖140g/L，玉米浆40g/L，黄豆饼粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O10mg/L，VB1 10mg/L，pH6.7-7.2，其余为蒸馏水。在发酵进行至32h时，测得罐内葡萄糖浓度为1g/L左右，此时L-缬氨酸浓度为60g/L左右，同时添加葡萄糖控制浓度不低于3g/L；继续发酵培养，并且实时监控L-缬氨酸浓度，40h时达到79g/L，50h时L-缬氨酸浓度85g/L，然后L-缬氨酸浓度不再增加，选择50h停止发酵。
实施例2
实施例1和对比例1发酵性能比较。
表1
发酵性能指标 实施例1 对比例1
发酵周期h 84 50
单次发酵产酸总量g 4310 2040
平均产酸率g/h 51.3 40.8
糖酸转化率％ 39.9 36.2
丙氨酸浓度g/L 1.03 11.67
如表1所示，以上所述发酵方式使产酸周期延长了68％，单批次发酵产酸总量提高了111％，单位时间内的产酸效率提高了25.7％，同时副产物L-丙氨酸的浓度下降了88.26％。可见本发明采用恒容发酵的方式能够有效提高L-缬氨酸发酵的产量并降低副产物的浓度，具有很大的生产研究价值。
实施例3
本发明恒容发酵工艺中代谢调节液组分对发酵液中缬氨酸浓度的影响。
对照组1：代谢调节液替换为等量的蒸馏水，其余同实施例1；
对照组2：代谢调节液组分为正丙醇5g/L，其余同实施例1；
对照组3：代谢调节液组分为3-氟代丙酮酸20mg/L，其余同实施例1；
实验组：实施例1。
分别在36，42，48，54，60，66，72，78，84，单位为h，检测发酵液中缬氨酸的含量，发酵32h时，各组别缬氨酸的浓度均为60g/L左右(实施例1)，如图2所示，随着发酵时间的增加，实验组中缬氨酸浓度变化不大，72h时后有轻微下降的趋势，84h时为50g/L上下浮动，此时结束发酵；对照组1在42h后有明显的下降，54h降为46.7g/L，此时需要结束发酵；对照组2在42h后呈现下降趋势，60h时为53.4g/L，72h降为48.1g/L，结束发酵；对照组3在54h后呈现下降趋势，下降速率较快，66h降低为50.8g/L，结束发酵。
实施例4
缬氨酸的发酵、分离以及纯化方法，其包括如下：
发酵工艺，参照实施例1；
收集缬氨酸发酵液，用碟片式离心机以5000rpm离心4min，收集上清液和菌体沉淀，菌体沉淀进入饲料加工工序；将上清液通过孔径为0.2μm的中空纤维膜进行过滤，收集滤过液；往滤过液中添加活性炭，添加量为1g：100ml，脱色温度为60℃，脱色时间为60min，板框过滤，收集脱色液；将脱色液进行减压蒸发至有少量晶体析出，然后进入结晶罐，调整pH为6，搅拌转速为100rpm，结晶12h，过滤，收集晶体，洗涤，烘干，即得L-缬氨酸产品。经HPLC检测，纯度为89.5％，含有少量的丙氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸，适合应用于饲料用氨基酸产品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.L-缬氨酸的发酵、分离以及纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
采用恒容发酵工艺获得L-缬氨酸发酵液，收集L-缬氨酸发酵液，离心得到上清液和菌体沉淀，菌体沉淀进入饲料加工工序；将上清液通过中空纤维膜进行过滤，收集滤过液；往滤过液中添加活性炭脱色，板框过滤，收集脱色液；将脱色液进行减压蒸发至有少量晶体析出，然后进入结晶罐，调整pH为6，搅拌结晶，过滤，收集晶体，洗涤，烘干，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒容发酵工艺包括如下步骤：按10-20％的接种量将产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌种子液接入装有20L发酵罐培养基的发酵罐中，发酵进行至32h时，以0.85L/h的速率流加补充葡萄糖营养液，并以0.15L/h的速率流加补充代谢调节液；同时以1L/h的速率放出发酵液；当发酵进行至84h时，结束发酵；整个发酵过程中，温度控制在30-32℃培养，溶氧控制在20-25％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心为：用碟片式离心机以5000rpm离心4min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维膜的孔径为0.1-0.2μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性炭脱色为：添加量为1g：100ml，脱色温度为60℃，脱色时间为60min。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组分为：葡萄糖140g/L，玉米浆40g/L，黄豆饼粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，VB1 10mg/L，pH6.7-7.2。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖营养液组分中葡萄糖的含量为100-150g/L。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述代谢调节液的组分包括正丙醇和/或3-氟代丙酮酸。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖营养液组分为：葡萄糖140g/L，KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、VB1 0.4mg/L、玉米浆干粉4g/L。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述代谢调节液组分为：正丙醇5g/L,3-氟代丙酮酸20mg/L。
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