CN111235192A

CN111235192A - 一种生产、分离和纯化l-苯丙氨酸的工艺

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Publication number: CN111235192A
Application number: CN202010281544.5A
Authority: CN
Inventors: 刘加林; 霍萧勇; 刘加海; 方朝杰; 张渊源
Original assignee: Hangzhou Brother Bio Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Brother Bio Technology Co ltd
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: CN111235192B

Abstract

本发明属于L‑苯丙氨酸生产技术领域，公开了一种生产、分离和纯化L‑苯丙氨酸的工艺，其包括如下工序：1）生产工序：将产L‑苯丙氨酸大肠杆菌种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养24h，然后进行超声处理，再添加代谢调节物，并继续发酵培养20‑30h，得到发酵液；2）分离和纯化工序：将发酵液离心，然后进行陶瓷膜过滤和超滤膜超滤，再进行脱色、真空浓缩结晶，最后进行烘干，即得。本发明对现有技术分离纯化L‑苯丙氨酸技术进行了改进，对发酵液采用碟片离心机分离出菌体，高效快捷，菌体分离彻底；分离纯化工艺中不采用离子交换树脂，降低了成本，减少了对环境的污染，绿色环保。

Description

一种生产、分离和纯化L-苯丙氨酸的工艺

技术领域

本发明属于L-苯丙氨酸生产技术领域，具体涉及一种生产、分离和纯化L-苯丙氨酸的工艺。

背景技术

L-苯丙氨酸广泛应用于医药领域，是苯丙氨苄、甲酸溶肉瘤素等氨基酸类抗癌药物的中间体，也是生产肾上腺素、甲状腺素和黑色素的原料药；已有研究表明，L-苯丙氨酸可作为抗癌药物的载体将药物分子直接导入癌瘤区，其效果是其他氨基酸的3～5倍。苯丙氨酸的制备方法不断得到改进 L-苯丙氨酸可由天然蛋白质水解法、酶法、化学合成法、发酵法得到。目前工业化生产路线主要为发酵法和酶法，化学合成法应用也较广泛。

天然蛋白质水解法是最早应用于获得L-苯丙氨酸的方法，主要通过水解大豆获得，但是大豆中L-苯丙氨酸含量较低，生产分离提纯较复杂和困难，生产成本高，难以大规模推广使用。酶法具有产物浓度高，纯化步骤少，生产能力强等优点，缺点是原料和酶的价格较高。化学合成法会产生大量的副产物和废水废气，在合成L-苯丙氨酸过程中，需要综合考虑原料的来源、价格以及合成工艺条件实现的难易程度，各步反应生成副产物的多少、收率的高低以及对环境的影响程度等诸多因素。

L-苯丙氨酸的发酵法是一种利用微生物发酵合成L-苯丙氨酸的方法，这种方法可以克服化学法和酶法合成L-苯丙氨酸的缺陷，绿色环保，而且能耗低，可持续发展性强。发酵法由于使用的菌种、原料以及发酵培养条件的不同，最终发酵液中L-苯丙氨酸的含量差异很大，要想获得苯丙氨酸的高效率，主要需选择菌株以及对其合理调节代谢通路。申请人之前的研究成果“一种利用大肠杆菌发酵制备L-苯丙氨酸的方法”，通过对代谢途径进行优化，提高了L-苯丙氨酸的发酵产量。从发酵液中分离纯化L-苯丙氨酸也有较多文献报告。例如，中国专利CN201210181165，公开了一种从发酵液中提取L-苯丙氨酸的方法，经过膜过滤、离子交换、减压浓缩、板框脱色等、烘干等步骤，解决了现有技术中苯丙氨酸的产酸率低，收率不高，成品质量一次合格率不高的技术问题。中国专利CN201210145248公开了一种L-苯丙氨酸提纯工艺，包括以下步骤：将L-苯丙氨酸发酵液分别进行陶瓷膜分离处理、离子交换系统进行离子交换处理、超滤处理、纳滤处理，循环洗滤后，去除残留液，得到苯丙氨酸溶液。但是上述技术中均采用了离子交换方法，会产生大量的废水，造成资源浪费和环境污染。

发明内容

为了克服现有技术中生产、分离以及纯化L-苯丙氨酸工艺存在的缺陷，本发明提供了一种生产、分离和纯化L-苯丙氨酸的工艺，该工艺使用的原料易得，成本低廉，环境污染较小，并且产物纯度较高。

为了实现本发明所带来的技术效果，本发明采用如下的技术方案。

一种生产、分离和纯化L-苯丙氨酸的工艺，其包括如下工序：

1）生产工序：将产L-苯丙氨酸大肠杆菌种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养24h，然后进行超声处理，再添加占发酵液体积10-20%的代谢调节物，并继续发酵培养20-30h，得到发酵液；

2）分离和纯化工序：将发酵液进行离心，然后进行陶瓷膜过滤和超滤膜超滤，再进行脱色、真空浓缩结晶，最后进行烘干，即得。

优选地，所述代谢调节物为丙二酸钠或/和丙氨酸的水溶液。

优选地，所述超声处理的参数为：功率为500W，超声频率为20KHz，振幅为60%，超声总时间为5min，每次超声时间为30 s，间隔时间为90s。

优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖80g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾5g/L，碳酸钙2g/L，柠檬酸三钠1g/L，色氨酸0.5g/L，酪氨酸0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，维生素B₁0.01g/L，三氯化镧0.005g/L，pH控制在6.8。

优选地，所述离心的条件为：高速碟片离心机以5000-6000rpm的转速离心4-8min。

优选地，所述陶瓷膜的截留分子量为10000Da。

优选地，所述超滤膜的截留分子量为300Da。

优选地，所述脱色条件为：pH为3.0，活性炭添加量为0.5%，脱色时间为60min。

优选地，所述真空浓缩结晶包括：真空浓缩温度为 60-70℃，真空度控制在0.08-0.09MPa，将浓缩液排入到结晶罐中，调节浓缩液的pH值为 4.5-4.8，搅拌均匀，然后降温至10-15℃，保温条件下放置3h，调节pH值为 5.0-5.2，继续降温至3-5℃，保温条件下放置12h，过滤收集L-苯丙氨酸湿晶体。

更优选地，所述代谢调节物的组分为：丙二酸钠5g/L和丙氨酸10g/L。

本发明取得的有益效果主要包括以下几个方面：

L-苯丙氨酸代谢涉及多个代谢通路和中间代谢物，需要考虑多个因素进行调控，以使得前体物质更多地应用于生成目的产物，并且提高底物的利用度。PEP 流向 Pyr的代谢流过大时，流向L-苯丙氨酸合成途径的代谢流变小，而流向HMP途径的代谢流量超过代谢能力时，会使代谢流流向副产物，造成副产物的积累；因此，需要增加PEP 流向L-苯丙氨酸代谢途径的代谢流。通过加入适量的丙氨酸，对丙酮酸激酶有变构抑制作用，减少PEP流向 Pyr的代谢流，但是不易过度抑制，否则会造成TCA循环效率降低，影响微生物正常的代谢。丙二酸钠是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，能够弱化TCA循环，减少进入TCA循环的代谢流；采用丙氨酸和丙二酸钠联合对TCA循环进行弱化，以提高增加PEP 流向L-苯丙氨酸代谢途径的代谢流。发酵前期以菌株增殖为主，TCA循环是维持菌株正常增殖和活力的途径，此时不宜过度弱化TCA循环，选择发酵中期进行弱化较为合适。在发酵中期进行超声处理，能够加快菌体代谢生长速度，提高了菌体细胞膜的通透性，促进L-苯丙氨酸的分泌；发酵培养基中添加镧元素，能够激活体内的合成酶积累L-苯丙氨酸，但是，过大量的镧元素对菌株有一定的损害。

本发明对现有技术分离纯化L-苯丙氨酸技术进行了改进，对发酵液采用碟片离心机分离出菌体，高效快捷，菌体分离彻底；分离纯化工艺中不采用离子交换树脂，降低了成本，减少了对环境的污染，绿色环保；本发明制备的L-苯丙氨酸纯度较高，可达到98%以上。

附图说明

图1：超声波对L-苯丙氨酸产量的影响；

图2：三氯化镧对L-苯丙氨酸产量的影响；

图3：三氯化镧对L-苯丙氨酸产酸效率的影响；

图4：丙二酸钠和丙氨酸对L-苯丙氨酸产量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种生产、分离和纯化L-苯丙氨酸的工艺，具体参照以下操作流程：

步骤1)制备大肠杆菌种子液：以产L-苯丙氨酸的大肠杆菌ATCC31882为研究对象，将大肠杆菌接种到LB固体培养基上进行活化，然后接种到一级种子培养基、二级种子培养基中进行扩大培养，得到OD₆₀₀值为10的大肠杆菌种子液；

步骤2）制备发酵培养基：

按照如下配比浓度取各原料：葡萄糖80g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾5g/L，碳酸钙2g/L，柠檬酸三钠1g/L，色氨酸0.5g/L，酪氨酸0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，维生素B₁ 0.01g/L，三氯化镧（LaCl₃.7H₂O）0.005g/L，pH控制在6.8，在115℃下灭菌15min，自然冷却即得；

步骤3）制备代谢调节物：将丙二酸钠和丙氨酸依次添加无菌水中，搅拌均匀，控制丙二酸钠和丙氨酸的浓度分别为5g/L和10g/L；

步骤4）发酵产L-苯丙氨酸：

将大肠杆菌种子液按照7%接种量接种到装有700L发酵培养基的1立方米发酵罐中进行发酵培养24h，然后进行超声处理，超声处理的参数为：功率为500W，超声频率为20KHz，振幅为60%，超声总时间为5min，每次超声时间为30 s，间隔时间为90s；再添加占发酵液体积10%的代谢调节物，并继续发酵培养24h，停止发酵；发酵培养条件为：转速为200rpm，溶氧量为15%，温度为34℃，罐压为0.05MPa；发酵过程中，通过流加氨水控制pH值在6.8，通过流加60%（质量体积比）的葡萄糖溶液控制残糖浓度为1g/L，直至发酵结束；

所述一级和二级种子培养基的组分均为：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化镁0.2g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，一水硫酸锰0.005g/L，pH控制在6.8，在115℃下灭菌15min；

步骤5）分离和纯化：将发酵液的pH调节为2.0，然后置于高速碟片离心机中，以6000rpm的转速离心5min，收集上层液体，然后进行陶瓷膜过滤，陶瓷膜的截留分子量为10000Da，收集滤过液，再进行超滤，超滤膜的截留分子量为300Da，收集超滤液，将超滤液进入脱色罐进行脱色，脱色条件为：pH为3.0，活性炭添加量为0.5%（质量体积比），脱色时间为60min；过滤去除活性炭，然后进行真空浓缩，浓缩温度为 70℃，真空度控制在0.09MPa，当浓缩液浓度达到100g/L时浓缩结束；将浓缩液排入到结晶罐中，调节浓缩液的pH值为 4.5，搅拌均匀，然后降温至10℃，保温条件下放置3h，调节pH值为 5.2，继续降温至5℃，保温条件下放置12h，过滤得到母液和L-苯丙氨酸湿晶体，将L-苯丙氨酸湿晶体置于80℃烘干3h，即得纯度为98.4％的L-苯丙氨酸。

实施例2

步骤1)制备大肠杆菌种子液：以产L-苯丙氨酸的大肠杆菌工程菌ATCC31882为研究对象，将大肠杆菌接种到LB固体培养基上进行活化，然后接种到一级种子培养基、二级种子培养基中进行扩大培养，得到OD₆₀₀值为9的大肠杆菌种子液；

步骤2）制备发酵培养基：

按照如下配比浓度取各原料：葡萄糖80g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾5g/L，碳酸钙2g/L，柠檬酸三钠1g/L，色氨酸0.5g/L，酪氨酸0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，维生素B₁ 0.01g/L，三氯化镧0.005g/L，pH控制在6.8，在115℃下灭菌15min，自然冷却即得；

步骤3）制备代谢调节物：将丙二酸钠和丙氨酸依次添加无菌水中，搅拌均匀，控制丙二酸钠和丙氨酸的浓度分别为6g/L和12g/L；

步骤4）发酵产L-苯丙氨酸：

将大肠杆菌种子液按照5%接种量接种到装有300L发酵培养基的500L发酵罐中进行发酵培养24h，然后进行超声处理，超声处理的参数为：功率为500W，超声频率为20KHz，振幅为60%，超声总时间为5min，每次超声时间为30s，间隔时间为90s；再添加占发酵液体积10%的代谢调节物，并继续发酵培养30h，停止发酵；发酵培养条件为：转速为200rpm，溶氧量为18%，温度为33℃，罐压为0.05MPa；发酵过程中，通过流加氨水控制pH值在6.8，通过流加60%（质量体积比）的葡萄糖溶液控制残糖浓度为1g/L，直至发酵结束；

步骤5）分离和纯化：将发酵液的pH调节为2.2，然后置于高速碟片离心机中，以5000rpm的转速离心6min，收集上层液体，然后进行陶瓷膜过滤，陶瓷膜的截留分子量为10000Da，收集滤过液，再进行超滤，超滤膜的截留分子量为300Da，收集超滤液，将超滤液进入脱色罐进行脱色，脱色条件为：pH为3.2，活性炭添加量为0.5%（质量体积比），脱色时间为60min；过滤去除活性炭，然后进行真空浓缩，浓缩温度为 65℃，真空度控制在0.08MPa，当浓缩液浓度达到100g/L时浓缩结束；将浓缩液排入到结晶罐中，调节浓缩液的pH值为 4.6，搅拌均匀，然后降温至12℃，保温条件下放置3h，调节pH值为 5.0-5.2，继续降温至4℃，保温条件下放置12h，过滤得到母液和L-苯丙氨酸湿晶体，将L-苯丙氨酸湿晶体置于70℃烘干5h，即得纯度为98.1％的L-苯丙氨酸。

对照例1

一种发酵生产L-苯丙氨酸的工艺，具体参照以下操作流程：

步骤1)制备大肠杆菌种子液：以产L-苯丙氨酸的大肠杆菌工程菌ATCC31882为研究对象，将大肠杆菌接种到LB固体培养基上进行活化，然后接种到一级种子培养基、二级种子培养基中进行扩大培养，得到OD₆₀₀值为10的大肠杆菌种子液；

步骤2）制备发酵培养基：

按照如下配比浓度取各原料：葡萄糖80g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾5g/L，碳酸钙2g/L，柠檬酸三钠1g/L，色氨酸0.5g/L，酪氨酸0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，维生素B₁ 0.01g/L，pH控制在6.8，在115℃下灭菌15min，自然冷却即得；

步骤3）发酵产L-苯丙氨酸：

将大肠杆菌种子液按照7%接种量接种到装有700L发酵培养基的1立方米发酵罐中进行发酵培养48h，停止发酵；发酵培养条件为：转速为200rpm，溶氧量为15%，温度为34℃，罐压为0.05MPa；发酵过程中，通过流加氨水控制pH值在6.8，通过流加60%（质量体积比）的葡萄糖溶液控制残糖浓度为1g/L，直至发酵结束，L-苯丙氨酸含量为25.1g/L；

所述一级和二级种子培养基的组分均为：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化镁0.2g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，一水硫酸锰0.005g/L，pH控制在6.8，在115℃下灭菌15min。

对照例2

一种发酵生产L-苯丙氨酸的工艺，具体参照以下操作流程：

步骤2）制备发酵培养基：

步骤3）发酵产L-苯丙氨酸：

将大肠杆菌种子液按照7%接种量接种到装有700L发酵培养基的1立方米发酵罐中进行发酵培养24h，然后进行超声处理，超声处理的参数为：功率为500W，超声频率为20KHz，振幅为60%，超声总时间为5min，每次超声时间为30 s，间隔时间为90s；继续发酵培养24h，停止发酵；发酵培养条件为：转速为200rpm，溶氧量为15%，温度为34℃，罐压为0.05MPa；发酵过程中，通过流加氨水控制pH值在6.8，通过流加60%（质量体积比）的葡萄糖溶液控制残糖浓度为1g/L，直至发酵结束；

实施例3

在常规发酵方式对照例1的基础上进行改进和优化，以提高L-苯丙氨酸的产量和产酸效率。

1、不同发酵时间采用超声处理对L-苯丙氨酸产量的影响，分别在发酵0,6,12,18，24,30,36，42h，八个时间点进行超声波处理，参数为：功率为500W，超声频率为20KHz，振幅为60%，超声总时间为5min，每次超声时间为30 s，间隔时间为90s。如图1所示，发酵初期采用超声处理，对L-苯丙氨酸产量并没有明显影响，发酵中期进行超声处理，L-苯丙氨酸产量有较大的上浮，较对比例1组提高了41.8%，发酵后期，L-苯丙氨酸合成已经放缓，此时进行超声处理，对L-苯丙氨酸产量影响也不大。

2、根据上述试验结果选择在发酵24h时进行超声处理。验证三氯化镧对L-苯丙氨酸产量和产酸效率的影响，发酵培养基中添加三氯化镧的量为0.001，0.003，0.005，0.007，0.009，0.011，0.013，0.015单位g/L，如图2-3所示，随着三氯化镧添加量的增加，对L-苯丙氨酸产量和产酸效率有正向的调节作用，添加量达到0.005g/L时，L-苯丙氨酸产量和产酸效率达到峰值，继续增大三氯化镧的添加量，对L-苯丙氨酸产量和产酸效率没有明显的提升作用，三氯化镧的添加量达到0.13g/L时，反而对L-苯丙氨酸产量和产酸效率产生不利影响，可能是过大量的镧元素对菌株有一定的损害，从而降低了产酸效率。

3、选择三氯化镧在发酵培养基中的添加量为0.005g/L。验证不同的代谢调节物对L-苯丙氨酸产量的影响，分别设置代谢调节物中丙二酸钠和丙氨酸的浓度为1,2.5，5，7.5，10，12.5，15，20，30,单位为g/L，如图4所示，随着丙二酸钠和丙氨酸的浓度的增大，L-苯丙氨酸产量随之提高，丙二酸钠浓度过大时，反而会降低L-苯丙氨酸的产量，而过大浓度的丙氨酸也不会明显提高L-苯丙氨酸的产量。通过将丙二酸钠和丙氨酸二者进行组合制备成代谢调节物，具备明显的协同作用，当丙二酸钠添加浓度为5g/L，且丙二酸钠：丙氨酸=1:2时，效果最好，L-苯丙氨酸的产量可达到61.4g/L，较采用单一调节物的最高值提高了20%以上；可能是二者通过不同的调节方式来对代谢流进行调控，对代谢流的调控更加有序合理，是一种经济有效地利用碳源的方式，在提高L-苯丙氨酸合成通路代谢流的同时，不会对菌株活力造成较大的损害；

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种生产、分离和纯化L-苯丙氨酸的工艺，其包括如下工序：

1）生产工序：将产L-苯丙氨酸大肠杆菌的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养24h，然后进行超声处理，再添加代谢调节物，并继续发酵培养20-30h，得到发酵液；

2）分离和纯化工序：将发酵液进行离心，然后进行陶瓷膜过滤和超滤膜超滤，再进行脱色和浓缩结晶，最后进行烘干，即得。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述代谢调节物为丙二酸钠或/和丙氨酸的水溶液。

3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述超声处理的参数为：功率为500W，超声频率为20KHz，振幅为60%，超声总时间为5min，每次超声时间为30 s，间隔时间为90s。

4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖80g/L，玉米浆50g/L，磷酸二氢钾5g/L，碳酸钙2g/L，柠檬酸三钠1g/L，色氨酸0.5g/L，酪氨酸0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，维生素B₁ 0.01g/L，三氯化镧0.005g/L，pH控制在6.8。

5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述离心的条件为：高速碟片离心机以5000-6000rpm的转速离心4-8min。

6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述陶瓷膜的截留分子量为10000Da。

7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为300Da。

8.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述脱色条件为：pH为3.0，活性炭添加量为0.5%，脱色时间为60min。

9.根据权利要求1或8所述的工艺，其特征在于，所述浓缩结晶包括：浓缩温度为 60-70℃，真空度控制在0.08-0.09MPa，将浓缩液排入到结晶罐中，调节浓缩液的pH值为 4.5-4.8，搅拌均匀，然后降温至10-15℃，保温条件下放置3h，调节pH值为 5.0-5.2，继续降温至3-5℃，保温条件下放置12h，过滤收集L-苯丙氨酸湿晶体。

10.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述代谢调节物的组分为：丙二酸钠5g/L和丙氨酸10g/L。