CN113005161A - 一种聚唾液酸的制备方法及聚唾液酸制品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体公开了一种聚唾液酸的制备方法及聚唾液酸制品。本发明方法包括以下步骤：S1.菌种发酵；S2.过膜除菌体：将发酵液经陶瓷膜过滤，得到膜清液；S3.热处理：在膜清液加入碱液，调节膜清液的pH值，水浴热处理制得热处理液；S4.过滤、沉淀：在热处理液中加入硅藻土，然后压滤，取滤液I，通过有机膜超滤，取滤液II，加入无水乙醇，得聚唾液酸粗品沉淀；S5.溶解、脱色；S6.浓缩、离心。本发明制备方法简单，去除菌体更为彻底，去除多余的盐分和小分子杂质，并且采用在碱性加热条件下除蛋白的效果较为明显，减少了络合剂的加入，方法安全有效。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种聚唾液酸的制备方法及聚唾液酸制品。
背景技术
聚唾液酸(polysialic acid，PSA)是一类线性、均一多聚α2,8连接唾液酸的独特碳水化合物，它主要通过典型的N-连接糖苷键附着在脊椎动物神经系统神经黏附分子上。多聚唾液酸通过改变神经系统神经黏附分子的黏附性调节神经细胞发育、神经导向以及突触形成，从而在神经发育中起关键作用。
其水解产物唾液酸是一种存在于动物细胞内的物质，具有阻碍病原体附着在细胞上以及使细胞产生免疫抗体作用；作为食品添加剂，适合用于婴儿断奶食品及住院患者营养品；作为药物对于中心或外用性神经疾病以及脱髓鞘病有疗效。以它为原料能开发一系列重要的糖药物，在抗病毒、抗肿瘤、抗炎症、治疗老年性痴呆症上均有非常好的效果。
目前，聚唾液酸的制备主要有化学合成、酶合成提取以及微生物发酵法。从生物发酵法所得发酵液中提取聚唾液酸的传统步骤包括：菌液分离、沉淀聚唾液酸、复溶、络合剂络合、氯仿脱蛋白、冷冻干燥得到成品。现有方法涉及的络合剂或洗脱剂多为有毒性、刺激性试剂，对人体存在危害，不适合作为提取食品原料的试剂，因此，还有改善的空间。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种聚唾液酸的制备方法，制备方法简单，去除菌体更为高效彻底，去除了聚唾液酸中多余的盐分和小分子杂质，并且本发明方法采用在碱性加热条件下除蛋白的效果较为明显，减少了络合剂的加入，减少了对人体产生危害的情况，方法安全有效。
本发明第一目的是提供了一种聚唾液酸的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
所述聚唾液酸的制备方法，包括以下步骤：
S1.菌种发酵：将大肠杆菌进行发酵培养，得发酵液；
S2.过膜除菌体：将步骤S1制得的发酵液经陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有聚唾液酸的膜清液；
S3.热处理：在步骤S2制得的膜清液加入碱液，调节膜清液的pH值，水浴热处理制得热处理液；
S4.过滤、沉淀：在步骤S3制得的热处理液中加入硅藻土，然后通过单层压滤膜进行压滤，取滤液I，滤液I通过有机膜超滤，取滤液II，向滤液II中加入无水乙醇，得聚唾液酸粗品沉淀；
S5.溶解、脱色：将步骤S4制得的聚唾液酸粗品沉淀用去离子水溶解，加入活性炭进行脱色获得脱色液，采用陶瓷膜对脱色液进行过滤，取滤液III；
S6.浓缩、离心：将步骤S5制得的滤液III进行浓缩，取浓缩液，向浓缩液中加无水乙醇，然后离心，取沉淀烘干得聚唾液酸。
在本发明的技术方案中，采用陶瓷膜过滤的方式去除大肠杆菌菌体，减少了传统的板框压滤、离心等分离方式中复杂的操作步骤，大大提高分离效率。
本发明还采用等电点下热处理变性的方式除去膜清液中的蛋白，有效避免了其它除蛋白试剂的引入，更加安全环保。
并且，本发明采用高分子有机膜超滤处理滤液I，利用聚合物大分子量的特性，分离滤液I中小分子杂质和盐分，纯化滤液I，再经过沉淀、溶解、脱色、浓缩、离心等其他步骤相互配合处理最终得到98％以上的聚唾液酸产品。
作为本发明所述聚唾液酸的制备方法的优选实施方式，述步骤S1大肠杆菌进行发酵培养过程中，调整通气量和搅拌转速维持发酵溶氧量在30-40％。
本发明调整通气量和搅拌转速，维持发酵溶氧量在30-40％，使得培养得到的发酵液质量更佳，菌种的活性高；并且在发酵过程中如果底糖耗完后以12g/L·h的速率流加葡萄糖，以补充发酵过程中的营养物质。
作为本发明所述聚唾液酸的制备方法的优选实施方式，所述步骤S2和步骤S5中陶瓷膜的孔径为30～400nm。
步骤S2中发酵液经孔径为30～400nm的陶瓷膜过滤，截留了大肠杆菌菌体，减少了传统的板框压滤、离心等分离方式中复杂的操作步骤，大大提高分离效率；步骤S5中采用孔径为30～400nm的陶瓷膜对脱色液进行过滤，使得脱色液中少量未被吸附的蛋白被截留，提高了聚唾液酸的纯度。
作为本发明所述聚唾液酸的制备方法的优选实施方式，所述步骤S5中陶瓷膜的孔径为30nm。
步骤S5中采用孔径为30nm的陶瓷膜，使得脱色液中未被吸附的蛋白更好的被截留，进一步提高了聚唾液酸的纯度。
作为本发明所述聚唾液酸的制备方法的优选实施方式，所述步骤S3中加入碱液调节膜清液的pH值为10-12。
在本发明的技术方案中，膜清液调节pH值至10-12，有利于提高S3步骤热处理液中蛋白变性析出效率，使物料中蛋白类杂质在此步骤更多的被去除，从而提高产品纯度；有利于提高S4步骤加乙醇沉淀所得聚唾液酸粗品的收率。其他pH条件下，杂蛋白析出量变少，加乙醇后粗品聚唾液酸的收率降低。
作为本发明所述聚唾液酸的制备方法的优选实施方式，所述步骤S3中水浴温度为80-90℃，热处理0.5-1h。
在本发明的技术方案中，膜清液采用水浴温度为80-90℃，热处理0.5-1h等处理，使得膜清液中的蛋白质发生变性析出，有效避免了其它除蛋白试剂的引入，更加安全环保。
作为本发明所述聚唾液酸的制备方法的优选实施方式，所述步骤S4中硅藻土在热处理液中的质量浓度为15～20g/L。
在本发明的技术方案中，加入硅藻土可以更好吸附热处理液中的变性的蛋白质，减少变性的蛋白质残留在聚唾液酸产品中的情况。
作为本发明所述聚唾液酸的制备方法的优选实施方式，所述步骤S4中滤液I通过截留量分子量为5000～10000DA的有机膜超滤。
本发明中有机膜可以截留分子量为5000～10000DA的小分子杂质和盐分，使得纯化得到的聚唾液酸纯度更高。
作为本发明所述聚唾液酸的制备方法的优选实施方式，所述步骤S4中无水乙醇的加入量为滤液II体积的3-5倍，所述步骤S6中无水乙醇的加入量为浓缩液体积的3-5倍。
在本发明的技术方案中，步骤S4中加入3-5倍体积的无水乙醇是利用聚唾液酸在乙醇中溶解度较低，蛋白类杂质在乙醇中发生变性析出的原理来提取粗品聚唾液酸和蛋白杂质。步骤S6中加入3-5倍体积的无水乙醇是为了利用相同原理进一步提取高纯度聚唾液酸。其中3-5倍体积的乙醇为综合考虑收率和成本后优化得出的最佳用量。
本发明的第二目的是提供了一种聚唾液酸制品，由上述聚唾液酸的制备方法所制得。
本发明采用上述聚唾液酸的制备方法获得的聚唾液酸制品，纯度高，并且经过高效液相法检测聚唾液酸的纯度大于98％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种聚唾液酸的制备方法，制备方法简单，分离效率高，采用本发明的方法可以更为高效的过滤了制备聚唾液酸过程中的蛋白、盐分和小分子杂质，为制备高纯度聚唾液酸提供保障；
2、本发明提供了一种聚唾液酸的制备方法，在碱性条件下热处理含有聚唾液酸的膜清液，使得除蛋白的效果更为明显，有效避免了其它除蛋白试剂的引入，更加安全环保；
3、本发明提供了一种聚唾液酸制品，纯度高，经过高效液相法检测聚唾液酸的纯度大于98％。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明中，大肠杆菌为申请号为201810458924.4的产聚唾液酸细菌，产聚唾液酸细菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2018103。
在以下实施例和对比例中，所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1、一种聚唾液酸的制备方法
一种聚唾液酸的制备方法，包括以下步骤：
S1.菌种发酵：取-80℃冻存的产聚唾液酸细菌，解冻后，用接种环取一环涂布于含有固体培养基的培养皿中，37℃培养12h。取单菌落接种于液体LB培养基中，220rpm，37℃培养12h，形成一级种子液，再将一级种子液以1％的接种量接种于LB培养基中，220rpm，37℃培养6h，形成二级种子液；取二级种子液，按照1％的接种量接种至含50％装液量的发酵培养基的发酵罐中，起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄糖，得发酵液；
S2.过膜除菌体：将步骤S1制得的发酵液经膜孔径为30nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有聚唾液酸的膜清液；
S3.热处理：在步骤S2制得的膜清液加入氢氧化钠溶液，调节膜清液的pH值至11，倒入加热罐中，85℃水浴热处理1小时，使蛋白发生变性析出，制得热处理液；
S4.过滤、沉淀：在步骤S3制得的热处理液中加入15g/L的硅藻土，然后通过0.22um的单层压滤膜进行压滤，去除变性蛋白，取滤液I，滤液I通过截留量分子量为8000DA的有机膜超滤，加超纯水透析出盐分和小分子杂质，取滤液II，向滤液II中加入4倍体积的无水乙醇，得聚唾液酸粗品沉淀；
S5.溶解、脱色：将步骤S4制得的聚唾液酸粗品沉淀用去离子水溶解，加入0.25g/L的活性炭进行脱色获得脱色液，并且通过0.22um的单层压滤膜进行过滤去除活性炭，采用膜孔径为30nm的陶瓷膜对脱色液进行过滤，取滤液III。
S6.浓缩、离心：将步骤S5制得的滤液III经旋转蒸发仪70℃真空浓缩至聚唾液酸含量在70～100g/L之间，取浓缩液，向浓缩液中加4倍体积的无水乙醇，使纯化后的聚唾液酸沉淀析出，沉淀液经高速离心机10000转/分钟离心沉降，取沉淀在60℃常压条件下烘干得聚唾液酸。
在本实施例中，高效液相法检测聚唾液酸的纯度为98％，并且聚唾液酸提取纯化收率为75.52％。
实施例2、一种聚唾液酸的制备方法
一种聚唾液酸的制备方法，包括以下步骤：
S1.菌种发酵：与实施例1相同；
S2.过膜除菌体：将步骤S1制得的发酵液经膜孔径为100nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有聚唾液酸的膜清液；
S3.热处理：在步骤S2制得的膜清液加入氢氧化钠溶液，调节膜清液的pH值至10，倒入加热罐中，80℃水浴热处理0.5小时，使蛋白发生变性析出，制得热处理液；
S4.过滤、沉淀：在步骤S3制得的热处理液中加入18g/L的硅藻土，然后通过0.22um的单层压滤膜进行压滤，去除变性蛋白，取滤液I，滤液I通过截留量分子量为5000DA的有机膜超滤，加超纯水透析出盐分和小分子杂质，取滤液II，向滤液II中加入3倍体积的无水乙醇，得聚唾液酸粗品沉淀；
S5.溶解、脱色：将步骤S4制得的聚唾液酸粗品沉淀用去离子水溶解，加入0.1g/L的活性炭进行脱色获得脱色液，并且通过0.22um的单层压滤膜进行过滤去除活性炭，采用膜孔径为400nm的陶瓷膜对脱色液进行过滤，取滤液III。
S6.浓缩、离心：将步骤S5制得的滤液III经旋转蒸发仪70℃真空浓缩至聚唾液酸含量在70～100g/L之间，取浓缩液，向浓缩液中加3倍体积的无水乙醇，使纯化后的聚唾液酸沉淀析出，沉淀液经高速离心机8000转/分钟离心沉降，取沉淀在60℃常压条件下烘干得聚唾液酸。
在本实施例中，高效液相法检测聚唾液酸的纯度为93.4％，并且聚唾液酸提取纯化收率为75.28％。
实施例3、一种聚唾液酸的制备方法
一种聚唾液酸的制备方法，包括以下步骤：
S1.菌种发酵：与实施例1相同；
S2.过膜除菌体：将步骤S1制得的发酵液经膜孔径为200nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有聚唾液酸的膜清液；
S3.热处理：在步骤S2制得的膜清液加入氢氧化钠溶液，调节膜清液的pH值至12，倒入加热罐中，90℃水浴热处理1小时，使蛋白发生变性析出，制得热处理液；
S4.过滤、沉淀：在步骤S3制得的热处理液中加入20g/L的硅藻土，然后通过0.22um的单层压滤膜进行压滤，去除变性蛋白，取滤液I，滤液I通过截留量分子量为10000DA的有机膜超滤，加超纯水透析出盐分和小分子杂质，取滤液II，向滤液II中加入5倍体积的无水乙醇，得聚唾液酸粗品沉淀；
S5.溶解、脱色：将步骤S4制得的聚唾液酸粗品沉淀用去离子水溶解，加入0.4g/L的活性炭进行脱色获得脱色液，并且通过0.22um的单层压滤膜进行过滤去除活性炭，采用膜孔径为100nm的陶瓷膜对脱色液进行过滤，取滤液III。
S6.浓缩、离心：将步骤S5制得的滤液III经旋转蒸发仪70℃真空浓缩至聚唾液酸含量在70～100g/L之间，取浓缩液，向浓缩液中加5倍体积的无水乙醇，使纯化后的聚唾液酸沉淀析出，沉淀液经高速离心机12000转/分钟离心沉降，取沉淀在60℃常压条件下烘干得聚唾液酸。
在本实施例中，高效液相法检测聚唾液酸的纯度为96.1％，并且聚唾液酸提取纯化收率为72.61％。
实施例4、一种聚唾液酸的制备方法
一种聚唾液酸的制备方法，包括以下步骤：
S1.菌种发酵：与实施例1相同；
S2.过膜除菌体：将步骤S1制得的发酵液经膜孔径为400nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有聚唾液酸的膜清液；
S3.热处理：在步骤S2制得的膜清液加入氢氧化钠溶液，调节膜清液的pH值至11，倒入加热罐中，85℃水浴热处理1小时，使蛋白发生变性析出，制得热处理液；
S4.过滤、沉淀：在步骤S3制得的热处理液中加入20g/L的硅藻土，然后通过0.22um的单层压滤膜进行压滤，去除变性蛋白，取滤液I，滤液I通过截留量分子量为15000DA的有机膜超滤，加超纯水透析出盐分和小分子杂质，取滤液II，向滤液II中加入4倍体积的无水乙醇，得聚唾液酸粗品沉淀；
S5.溶解、脱色：将步骤S4制得的聚唾液酸粗品沉淀用去离子水溶解，加入0.5g/L的活性炭进行脱色获得脱色液，并且通过0.22um的单层压滤膜进行过滤去除活性炭，采用膜孔径为100nm的陶瓷膜对脱色液进行过滤，取滤液III。
S6.浓缩、离心：将步骤S5制得的滤液III经旋转蒸发仪70℃真空浓缩至聚唾液酸含量在70～100g/L之间，取浓缩液，向浓缩液中加4倍体积的无水乙醇，使纯化后的聚唾液酸沉淀析出，沉淀液经高速离心机8000～12000转/分钟离心沉降，取沉淀在60℃常压条件下烘干得聚唾液酸。
在本实施例中，高效液相法检测聚唾液酸的纯度为95.7％，并且聚唾液酸提取纯化收率为75.10％。
对比例1
与实施例1相似，对比例1区别仅在于，加入氢氧化钠溶液调节膜清液的pH值至13，其余参数和方法与实施例1相同。
在本对比例中，高效液相法检测聚唾液酸的纯度为97.7％，并且聚唾液酸提取纯化收率为75.51％。
对比例2
与实施例1相似，对比例2区别仅在于，不含有步骤S3，其余参数和方法与实施例1相同。
在本对比例中，高效液相法检测聚唾液酸的纯度为96.4％，并且聚唾液酸提取纯化收率为73.01％。
对比例3
与实施例1相似，对比例3区别仅在于，步骤S2和步骤S5中采用板框替换陶瓷膜，其余参数和方法与实施例1相同。
在本对比例中，高效液相法检测聚唾液酸的纯度为85.8％，并且聚唾液酸提取纯化收率为54.86％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种聚唾液酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.菌种发酵：将大肠杆菌进行发酵培养，得发酵液；
S2.过膜除菌体：将步骤S1制得的发酵液经陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有聚唾液酸的膜清液；
S3.热处理：在步骤S2制得的膜清液加入碱液，调节膜清液的pH值，水浴热处理制得热处理液；
S4.过滤、沉淀：在步骤S3制得的热处理液中加入硅藻土，然后通过单层压滤膜进行压滤，取滤液I，滤液I通过有机膜超滤，取滤液II，向滤液II中加入无水乙醇，得聚唾液酸粗品沉淀；
S5.溶解、脱色：将步骤S4制得的聚唾液酸粗品沉淀用去离子水溶解，加入活性炭进行脱色获得脱色液，采用陶瓷膜对脱色液进行过滤，取滤液III；
S6.浓缩、离心：将步骤S5制得的滤液III进行浓缩，取浓缩液，向浓缩液中加无水乙醇，然后离心，取沉淀烘干得聚唾液酸。
2.如权利要求1所述的聚唾液酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S1大肠杆菌进行发酵培养过程中，调整通气量和搅拌转速维持发酵溶氧量在30-40％。
3.如权利要求1所述的聚唾液酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S2和步骤S5中陶瓷膜的孔径为30～400nm。
4.如权利要求3所述的聚唾液酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中陶瓷膜的孔径为30nm。
5.如权利要求1所述的聚唾液酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中加入碱液调节膜清液的pH值为10-12。
6.如权利要求1所述的聚唾液酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中水浴温度为80-90℃，热处理0.5-1h。
7.如权利要求1所述的聚唾液酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中硅藻土在热处理液中的质量浓度为15～20g/L。
8.如权利要求1所述的聚唾液酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中滤液I通过截留量分子量为5000～10000DA的有机膜超滤。
9.如权利要求1所述的聚唾液酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中无水乙醇的加入量为滤液II体积的3-5倍，所述步骤S6中无水乙醇的加入量为浓缩液体积的3-5倍。
10.一种聚唾液酸制品，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的制备方法所制得。
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