CN114621892B - 高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用 - Google Patents

高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用。本发明通过离子束注入诱变结合高通量筛选获得高产聚唾液酸的大肠杆菌突变株。该大肠杆菌突变株具备较高的合成能力，无论是采用此菌株直接生产聚唾液酸或者是产物水解后生产唾液酸单体都能够给产能带来较大提升。另外，利用该株大肠杆菌在进一步的工程化改造时，由于其本身具备较大的PSA合成通路，保证了后续改造中CMP‑SA的供应源，从而为更好运用该菌株表达多种SA相关产品提供坚实的基础。

Description

高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用。
背景技术
聚唾液酸(PSA)及唾液酸(SA)的主要发酵来源为大肠杆菌，目前国内聚唾液酸、唾液酸领域产业化程度不高，主要原因之一为大肠杆菌的生产能力限制。
CN111733092A中公开的菌株经过发酵调控后，聚唾液酸产率可达10g/L的高纯多聚唾液酸；CN112553120B中公开的菌株在3L发酵罐培养33h后，聚唾液酸最高产量能够达到19.3g/L；CN110093293A中公开的菌株在5L发酵罐培养72h后，最终聚唾液酸的产量为16.1g/L。大肠杆菌的聚唾液酸生产能力有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种高产聚唾液酸的大肠杆菌Escherichia coli SA-EC21-SA12I，其是经过离子束注入诱变选育获得的高产聚唾液酸的菌株。该菌株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO：M 20211274，保藏日期2021年10月14日。
通过全基因组测序血清型分析，菌体抗原(O)为O1，鞭毛抗原(H)为H7，非常见O157等致病性血清型。
第二方面，本发明提供所述大肠杆菌在发酵生产聚唾液酸中的应用。
第三方面，本发明提供所述大肠杆菌在发酵生产唾液酸中的应用。
第四方面，本发明提供一种聚唾液酸的发酵生产方法，其是以所述大肠杆菌SA-EC21-SA12I作为发酵菌种。
该方法包括以下步骤：
A、种子液的制备；
B、发酵培养；
C、从发酵液中回收聚唾液酸。
步骤B所用发酵培养基为：磷酸二氢钾5-12g/L，玉米浆干粉3-6g/L，葡萄糖10-35g/L，硫酸镁0.1-2g/L，硫酸铵2-6g/L维生素溶液0.1-5mL/L和微量元素溶液0.1-5mL/L。
优选地，微量元素溶液组成为：FeSO4·7H2O 30-80g/L，MnCl2·H2O 5-10g/L，CuCl2·2H2O 0.1-1g/L，ZnSO4·7H2O 1-10g/L；维生素溶液组成为：硫胺素0.1-1g/L，泛酸钙1-5g/L，生物素0.001-1g/L，氯化钴0.01-1g/L。
优选地，步骤B的发酵条件为：发酵罐装液量30-70％。将种子液按0.1-10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，起始发酵条件为30-37℃，0.1-1vvm，发酵过程中维持溶氧15-70％，发酵过程中通过流加葡萄糖溶液控制发酵液残糖在1～10g/L，用氨水控制pH5.8-7.4，发酵30-100h。
步骤A包括：
一级种子液的制备：挑取活化后的单菌落接种于LB液体培养基中，30-37℃培养得到一级种子液；
二级或多级种子液的制备：将一级种子液以0.1-10％的接种量接种于LB液体培养基中(如摇瓶装液量25ml/250ml)，30-37℃培养得到二级种子液；或者，逐级培养得到多级种子液。
对于种子液的培养，可根据实际需要判断培养终点，例如可以根据菌液OD值达到0.2-1.0时停止种子液的培养，进行下一步的放大。
步骤C包括：过膜除菌体：将发酵液截留菌体后，得到含有聚唾液酸的膜清液；
所得聚唾液酸膜清液采用CN109627269B公开的方法可以得到唾液酸单体。
聚唾液酸膜清液采用以下方法能够得到聚唾液酸：
pH调节、过滤：调节膜清液的pH至碱性，采用30-50nm的膜过滤，得到滤液I；
过滤、沉淀：滤液I通过截留量分子量为5000-10000Da的膜超滤，透析后得到滤液II；向滤液II中加入3-5倍体积的乙醇，沉淀得到聚唾液酸粗品；
溶解、脱色：将聚唾液酸粗品沉淀溶解后，脱色后，得到滤液III；
浓缩、离心：将滤液III浓缩，取浓缩液，向浓缩液中加入3-5倍体积的乙醇，使聚唾液酸沉淀析出，收集沉淀烘干即得聚唾液酸成品。
其中截留菌体的操作包括但不限于陶瓷膜过滤、离心等步骤；脱色步骤包括但不限于活性炭脱色、大孔树脂脱色；浓缩的操作包括但不限于蒸发浓缩、离心农速、膜浓缩，烘干操作包括但不限于真空干燥、冷冻干燥、微薄干燥。
在一个具体的实施方式中步骤C包括：
C1、过膜除菌体：将发酵液经膜孔径为30-400nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有聚唾液酸的膜清液；
C2、pH调节、过滤：调节膜清液的pH至8-12，采用30-50nm的陶瓷膜过滤，得到滤液I；
C3、过滤、沉淀：滤液I通过截留量分子量为5000-10000Da的膜超滤，透析后得到滤液II；向滤液II中加入3-5倍体积的无水乙醇，使聚唾液酸沉淀析出，得到聚唾液酸粗品；
C4、溶解、脱色：将聚唾液酸粗品沉淀用去离子水溶解，加入活性炭进行脱色得到脱色液，去除活性炭后，得到滤液III；
C5、浓缩、离心：将滤液III经旋转蒸发仪70℃真空浓缩至聚唾液酸含量为70-100g/L；取浓缩液，向浓缩液中加入3-5倍体积的无水乙醇，使聚唾液酸沉淀析出，离心，沉淀烘干即得聚唾液酸成品。
采用步骤C可回收得到纯度较高的聚唾液酸。高效液相色谱法检测成品中聚唾液酸的纯度约为98％。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明通过离子束注入诱变结合高通量筛选获得高产聚唾液酸的大肠杆菌突变株。菌体抗原(O)为O1，鞭毛抗原(H)为H7，非常见O157等致病性血清型，其安全性能够保证。
(二)大肠杆菌SA-EC21-SA12I发酵38h后聚唾液酸产量达到30g/L以上，聚唾液酸合成速率达到0.8g/L·h以上，无论是采用此菌株直接生产聚唾液酸或者是产物水解后生产唾液酸单体都能够给产能带来较大提升。
(三)当利用大肠杆菌SA-EC21-SA12I进行唾液酸单体的制备、蛋白结合物等产品的多种工程化改造时，由于其本身具备较大的PSA合成通路，保证了后续改造中CMP-SA的供应源，从而为更好地应用该菌株表达多种SA相关产品提供坚实的基础。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1高产聚唾液酸的大肠杆菌的获得
1、菌种筛选方法(诱变可采取等离子束注入)
(1)以大肠埃希氏菌保藏编号CCTCC NO：M 2018103(参见CN108588152B)作为诱变出发菌株。
(2)进行等离子体注入诱变。
1、悬浮液制备
(1)从-80℃冰箱中取出甘油管保藏的出发菌种，待融化后，用接种环蘸取一环划线于LB平板，37℃培养16h。
(2)挑取单菌落接种至LB培养基，37℃、250rpm培养6h。
(3)对步骤(2)培养液进行镜检(要求未染菌)，然后按1％接种量接种到50mL LB培养基/250mL三角瓶中，37℃、250rpm培养5～6h。
(4)准备4支10mL的无菌离心管，各加入上述步骤(3)的培养液5mL，6000rpm离心10min，弃去上清液；
(5)每管各加入5mL的无菌水，涡旋振荡混悬，4000rpm离心10min，弃去上清液；
(6)每管各加入5mL的无菌水，涡旋振荡混悬，制成菌悬液，备用。
2、诱变筛选
(1)将菌悬液涂布于无菌平皿，在超净台中以无菌空气风干备用。
(2)在中国科学院离子束生物工程学重点实验室氮离子注入装置上进行。N+离子源注入注入能量15keV，注入剂量10×1014ion/cm2，以5s脉冲式注入，间隔20s，合计注入15s，靶室真空度约10-3Pa。将涂布平皿放于注入机靶台上进行离子束注入。
(3)诱变结束后以2mL无菌水洗脱，梯度稀释后，涂布于含有初筛培养基的平板上，37℃培养24h。
(4)挑选变色圈大的单菌落经二级种子活化，5％接种于复筛发酵培养基保存。
(5)将初筛得到的菌株接种于含种子培养基的24孔板(装液量3mL/10mL)中，每株菌做3个平行，37℃、250r/min培养12h。种子液按4％转接到含发酵培养基的24孔板(装液量3mL/10mL)中，37℃、150r/min培养48h。将产生的PSA(聚唾液酸)水解成SA(唾液酸)，通过测定SA含量确定PSA产量。
最终筛选得到一株高产聚唾液酸的大肠杆菌SA-EC21-SA12I，该菌株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 20211274，通过全基因组测序血清型分析，菌体抗原(O)为O1，鞭毛抗原(H)为H7，非常见O157等致病性血清型。
以大肠杆菌突变株SA-EC21-SA12I为聚唾液酸发酵菌株，进行100L罐发酵，发酵培养基为磷酸二氢钾5g/L，玉米浆干粉4g/L，硫酸镁1.0g/L，硫酸铵4g/L，葡萄糖20g/L，维生素溶液1mL/L和微量元素溶液1mL/L。微量元素溶液组成为：FeSO4·7H2O 50g/L，MnCl2·H2O8.5g/L，CuCl2·2H2O 0.85g/L，ZnSO4·7H2O 9g/L；维生素溶液组成为：硫胺素0.5g/L，泛酸钙3.2g/L，生物素0.006g/L，氯化钴0.15g/L；装液量50％。起始发酵条件：37℃，200rpm，0.5-1vvm，随后发酵过程中调整溶氧量，其中6-10h，溶氧量降至70％，10-15h，溶氧量降至50％，之后溶氧维持在30％左右，底糖耗完后以开始流加葡萄糖，控制残糖在6±2g/L，发酵过程pH全程利用25％氨水控制在6.6左右，发酵38h，得到聚唾液酸。
聚唾液酸含量的检测方法如下：将发酵液离心去除菌体，清液稀释，各取2mL稀释后清液与0.1mol/L的稀盐酸混合，密闭混匀于85℃水浴3h，反应结束后冷却，用HPLC检测。
高效液相色谱(HPLC)检测法：岛津Lc-15c；检测柱Bio-Rad AMINEX HPX 87HOrganic Analysis Column(300mm×7.8mm)；柱温60℃；流动相5mmol硫酸水溶液，流速0.6mL/min；检测波长210nm。结果见表1。
表1
测定原始菌株发酵液中聚唾液酸含量在14.3g/L左右，PSA合成速率为0.38g/L·h。诱变菌株SA-EC21-SA12I发酵液中聚唾液酸的含量为31.1g/L，PSA合成速率为0.84g/L·h。
诱变菌株比同等条件下出发菌株的产量及合成速率提高近二倍以上。
实施例2菌株SA-EC21-SA12I产聚唾液酸
进行100L罐发酵，发酵培养基为磷酸二氢钾7g/L，玉米浆干粉10g/L，维生素溶液1ml/L，硫酸镁1.0g/L，葡萄糖30g/L，维生素溶液1mL/L和微量元素溶液1mL/L。微量元素溶液组成为：FeSO4·7H2O 50g/L，MnSO4·H2O 7g/L，CuSO4·5H2O 1.25g/L，ZnSO4·7H2O 9g/L；维生素溶液组成为：硫胺素0.5g/L，泛酸钙3.2g/L，生物素0.006g/L。装液量50％。起始发酵条件：37℃，500rpm，通气量2vvm，发酵0-20h时使用氨水控制发酵罐内pH为7.2，发酵20h后控制发酵罐内pH为6.4。底糖耗完后，以12g/L·h的速率补加75％的一水葡萄糖，维持7h，然后以8g/L·h的速率补加75％的一水葡萄糖，至发酵结束；流加葡萄糖后，调整转速为200rpm，通气量调整为1vvm。发酵38h后，得到聚唾液酸含量为30.0g/L，PSA合成速率为0.79g/L·h。
实施例3聚唾液酸的制备方法
本实施例提供一种聚唾液酸的制备方法，包括以下步骤：
1、菌种发酵：取-80℃冻存的高产聚唾液酸大肠杆菌SA-EC21-SA12I，解冻后，用接种环取一环涂布于含有固体培养基的培养皿中，37℃培养12h。取单菌落接种于液体LB培养基中，220rpm，37℃培养12h，形成一级种子液，再将一级种子液以1％的接种量接种于LB培养基中，220rpm，37℃培养6h，形成二级种子液；取二级种子液，按照1％的接种量接种至含50％装液量的发酵培养基的发酵罐中，起始发酵条件：37℃，200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以开始流加葡萄糖，控制残糖在3g/L，发酵过程中用25～28％氨水控制pH在6.4左右，发酵38h，得到发酵液，发酵液中PSA含量为31.0g/L。
2、过膜除菌体：将步骤1所得发酵液经膜孔径为30nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有聚唾液酸的膜清液。
3、pH调节、过滤：向步骤2制得的膜清液中加入氢氧化钠溶液，调节膜清液的pH至11，采用30nm的陶瓷膜过滤，得到滤液I。
4、过滤、沉淀：滤液I通过截留量分子量为8000Da的有机膜超滤，加超纯水透析出盐分和小分子杂质，取滤液II，向滤液II中加入4倍体积的无水乙醇，得聚唾液酸粗品沉淀。
5、溶解、脱色：将步骤4制得的聚唾液酸粗品沉淀用去离子水溶解，加入0.25g/L的活性炭进行脱色获得脱色液，并且通过0.22μm的单层压滤膜进行过滤去除活性炭，采用膜孔径为30nm的陶瓷膜对脱色液进行过滤，取滤液III。
6、浓缩、离心：将步骤5制得的滤液III经旋转蒸发仪70℃真空浓缩至聚唾液酸含量在70-100g/L之间，取浓缩液，向浓缩液中加4倍体积的无水乙醇，使纯化后的聚唾液酸沉淀析出，沉淀液经高速离心机10000rpm离心沉降，取沉淀在60℃常压条件下烘干得聚唾液酸。
本实施例中，高效液相法检测聚唾液酸的纯度为98％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.高产聚唾液酸的大肠杆菌Escherichia coli SA-EC21-SA12Ⅰ，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M 20211274。
2.权利要求1所述大肠杆菌在制备聚唾液酸中的应用。
3.权利要求1所述大肠杆菌在制备唾液酸中的应用。
4.聚唾液酸的发酵生产方法，其特征在于，以权利要求1所述的大肠杆菌作为发酵菌种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、种子液的制备；
B、发酵培养；
C、从发酵液中回收聚唾液酸；
其中，步骤B所用发酵培养基为：磷酸二氢钾5-12g/L，玉米浆干粉3-6g/L，葡萄糖10-35g/L，硫酸镁0.1-2g/L，硫酸铵2-6g/L维生素溶液0.1-5mL/L和微量元素溶液0.1-5mL/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，微量元素溶液组成为：FeSO4·7H2O 30-80g/L，MnCl2·H2O 5-10g/L，CuCl2·2H2O 0.1-1g/L，ZnSO4·7H2O 1-10g/L；维生素溶液组成为：硫胺素0.1-1g/L，泛酸钙1-5g/L，生物素0.001-1g/L，氯化钴0.01-1g/L。
7.根据权利要求5述的方法，其特征在于，步骤B的发酵条件为：发酵罐装液量30-70％，将种子液按0.1-10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，起始发酵条件为30-37℃，0.1-1vvm，发酵过程中维持溶氧15-70％，发酵过程中通过流加葡萄糖溶液控制发酵液残糖在1～10g/L，用氨水控制pH5.8-7.4，发酵30-100h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤A包括：
一级种子液的制备：挑取活化后的单菌落接种于LB液体培养基中，30-37℃培养得到一级种子液；
二级或多级种子液的制备：将一级种子液以0.1-10％的接种量接种于LB液体培养基中，30-37℃培养得到二级种子液；或者，逐级培养得到多级种子液。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤C包括：过膜除菌体：将发酵液截留菌体后，得到含有聚唾液酸的膜清液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤C还包括：pH调节、过滤：调节膜清液的pH至碱性，采用30-50nm的陶瓷膜过滤，得到滤液I；
过滤、沉淀：滤液I通过截留量分子量为5000-10000Da的膜超滤，透析后得到滤液II；向滤液II中加入3-5倍体积的乙醇，沉淀得到聚唾液酸粗品；
溶解、脱色：将聚唾液酸粗品沉淀溶解后，脱色后得到滤液III；
浓缩、离心：将滤液III浓缩，取浓缩液，向浓缩液中加入3-5倍体积的乙醇，使聚唾液酸沉淀析出，收集沉淀烘干即得聚唾液酸成品。
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