CN109266707A - 一种制备聚唾液酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备聚唾液酸的方法，涉及聚唾液酸制备技术领域。该制备聚唾液酸的方法包括：在发酵过程中，往接种有产聚唾液酸菌的发酵培养基中添加对聚唾液酸具有吸附、络合或耦合能力的分离剂。该制备方法对聚唾液酸具有吸附、络合或耦合能力的分离剂，在发酵的过程中添加上述分离剂，使发酵液产生的聚唾液酸从发酵液中被吸附、络合或耦合，降低其在发酵液中的浓度，达到刺激菌体加速产生聚唾液酸的目的，实现聚唾液酸产量的增加。

Description

一种制备聚唾液酸的方法
技术领域
本发明涉及聚唾液酸制备技术领域，具体而言，涉及一种制备聚 唾液酸的方法。
背景技术
聚唾液酸(polysialic acid，PSA)是一类线性、均一多聚α2,8连接 唾液酸的独特碳水化合物，它主要通过典型的N-连接糖苷键附着在 脊椎动物神经系统神经黏附分子上。多聚唾液酸通过改变神经系统神 经黏附分子的黏附性调节神经细胞发育、神经导向以及突触形成，从 而在神经发育中起关键作用。
聚唾液酸经水解后可得到唾液酸寡糖和唾液酸单体，可用于进一 步制备功能性唾液酸寡糖的原料。聚唾液酸还可用作蛋白药物的缓释 材料和神经修复手术中的支架材料。蛋白质类药物已经成为现代生物 制药领域一个重要的组成部分。
现有的生产聚唾液酸的方法主要是采用发酵培养，从培养产物中 分离纯化得到聚唾液酸。但目前的发酵培养方法生产聚唾液酸的含量 低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本本发明的目的在于提供一种制备聚唾液酸的方法，采用该制备 方法可以提高发酵产物中的聚唾液酸含量。
本发明是这样实现的：
一种制备聚唾液酸的方法，其包括：在发酵过程中，往接种有产 聚唾液酸菌的发酵培养基中添加对聚唾液酸具有吸附、络合或耦合能 力的分离剂。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述分离剂为阳离子表 面活性剂、阳离子絮凝剂或树脂。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述阳离子表面活性剂 为十六烷基三甲基季铵溴化物、十八烷基二甲基苄基季铵氯化物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述阳离子表面活性剂 为十六烷基三甲基溴化铵。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述阳离子表面活性剂 为氯代十六烷基吡啶。
进一步地，在本发明地一些实施方式中，上述阳离子絮凝剂为阳 离子聚丙烯酰胺。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述树脂为大孔吸附树 脂，进一步地，上述大孔吸附树脂为(甲基)丙烯酰氧乙基三甲基氯 化铵与丙烯酰胺的共聚物(DMC-AM)。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在接种产上述聚唾液酸 菌后的第12～15h、第22～25h和第32～35h分三次添加上述分离剂。
在上述的三个时间段时添加分离剂，聚唾液酸积累速率最高，相 对吸附效率最高。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，每次上述分离剂的添加 量为1％-3％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述产聚唾液酸菌为大 肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在接种上述产聚唾液酸 菌时，上述发酵培养基含有：磷酸二氢钾8-12g/L，玉米浆干粉3-5g/L， 蛋白胨3-5g/L，酵母浸粉1.8-2.2g/L，葡萄糖28-32g/L。
生物反应过程的反应速率往往随着产物或某些副产物的积累而 受到抑制，在反应过程中及时地分离出这些产物能够解除抑制作用， 从而提高产物生物速率或使平衡能够解除抑制作用，从而提高产物生 产速率或使平衡向有利于产物生成方向转移，从而提高底物利用率和 产物产量。
本发明通过利用对聚唾液酸具有吸附、络合或耦合能力的分离 剂，在发酵的过程中添加上述分离剂，使发酵液产生的聚唾液酸从发 酵液中被吸附、络合或耦合，降低其在发酵液中的浓度，达到刺激菌 体加速产生聚唾液酸的目的，实现聚唾液酸产量的增加。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对 本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明 具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
取冻存的大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103(参考申 请号为201810458924.4的中国发明专利申请)，解冻后，接种于液体 LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液。该菌株于 2018年3月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％装液量的发酵培养 基的发酵罐中，
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
在发酵第15h，24h，35h添加1％CPC(氯代十六烷基吡啶)， 第42h放罐，取发酵液检测聚唾液酸含量,检测方法采用中国药典 2015年版中的唾液酸间苯二酚显色法，结果为：15h添加分离剂前后 分别为14.6g/L，5.3g/L；24h后添加前后13.3g/L，4.8g/L；35h添加 前后11.1g/L，3.7g/L，放罐8.9g/L。折合单罐产量34.1g/L。
4.聚唾液酸的纯化分离
放罐发酵液过1000目滤布，截流络合物，在40℃下加入浓度为 0.5M的NaCl，搅拌后离心取上清液，得到粗清夜；剩余发酵液过 200nm陶瓷膜除菌体，得到粗清夜；粗清液加热至70℃，离心，得 到清夜，加50％醋酸4℃结晶，得到聚唾液酸晶体，纯度93％。收率78％。
实施例2
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
取冻存的大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103，解冻后， 接种于液体LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％装液量的发酵培养 基的发酵罐中。
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
在发酵第12h，23h，33h添加3％DMC-AM，第42h放罐，取 发酵液检测聚唾液酸含量：15h添加分离剂前后分别为15.3g/L， 6.0g/L；24后添加前后13.9g/L，5.6g/L；35h添加前后13.4g/L，4.2g/L， 放罐10.1g/L。折合单罐产量36.9g/L。
4.聚唾液酸的纯化分离
放罐发酵液过1000目滤布，截流络合物，并酸化处理pH3～6， 得到粗清夜；剩余发酵液过200nm陶瓷膜除菌体，得到粗清夜；粗 清液加热至70℃，离心得到清夜，加50％醋酸4℃结晶，得到聚唾液 酸晶体，纯度92.3％。收率82％。
实施例3
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
取冻存的大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103，解冻后， 接种于液体LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％装液量的发酵培养 基的发酵罐中。
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
在发酵第14h，24h，32h添加2％CPAM(阳离子聚丙烯酰胺)， 第42h放罐，取发酵液检测聚唾液酸含量：14h添加分离剂前后分别 为14.5g/L，4.4g/L；24h后添加前后11.3g/L，5.2g/L；32h添加前后 12.2g/L，2.3g/L，放罐8.5g/L。折合单罐产量34.6g/L。
4.聚唾液酸的纯化分离
放罐发酵液过1000目滤布，截流络合物并酸化处理pH3～6，得 到粗清夜；剩余发酵液过200nm陶瓷膜除菌体，得到粗清夜；粗清 液加热至70℃，离心得到清夜，加50％醋酸4℃结晶，得到聚唾液酸 晶体，纯度94.6％。收率77％。
实施例4
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
购买的大肠杆菌K235，解冻后，接种于液体LB培养基，37℃， 220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％装液量的发酵培养 基的发酵罐中。
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
在发酵第15h，24h，35h添加2％DMC-AM，第42h放罐，取 发酵液检测聚唾液酸含量：15h添加分离剂前后分别为6.3g/L，1.0g/L； 24后添加前后7.1g/L，1.3g/L；35h添加前后5.8g/L，1.7g/L，放罐 2.1g/L。折合单罐产量17.3g/L。
对比例1
在发酵过程中不添加任何分离剂。
1.菌种活化
取冻存的大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103，解冻后， 接种于液体LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％装液量的发酵培养 基的发酵罐中。
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
42h放罐，取发酵液检测聚唾液酸含量：单罐产量20.6g/L。
4.分离纯化
发酵液酸化后过200nm陶瓷膜除菌体，得到粗清夜；粗清液加 热至70℃，离心得到清夜，加50％醋酸4℃结晶，得到聚唾液酸晶体， 纯度94.6％以上。收率77％。
对比例2
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
取冻存的大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103，解冻后， 接种于液体LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％
装液量的发酵培养基的发酵罐中，
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
在发酵第15h，24h，35h添加2％阴离子表面活性剂SDS，第 42h放罐，取发酵液检测聚唾液酸含量：15h添加分离剂前后分别为 12.2g/L，13.1g/L；24后添加前后14.1g/L，15.4g/L；35h添加前后 14.7g/L，14.3g/L。放罐14.0g/L，基本无络合效果，且SDS影响了生物量。折合单罐产量14g/L。
4.聚唾液酸的纯化分离
放罐发酵液过1000目滤布，酸化处理pH3～6，得到粗清夜；剩 余发酵液过200nm陶瓷膜除菌体，得到粗清夜；粗清液加热至70℃， 离心得到清夜，加50％醋酸4℃结晶，得到聚唾液酸晶体，纯度90％ 以上。收率70％。
对比例3
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
取冻存的大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103，解冻后， 接种于液体LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％
装液量的发酵培养基的发酵罐中，
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
在发酵第15h添加2％CPAM，第42h放罐，取发酵液检测聚唾 液酸含量：15h添加分离剂前后分别为15.8g/L，3.4g/L；放罐13.4g/L。 折合单罐产量25.8g/L。
对比例4
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
取冻存的大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103，解冻后， 接种于液体LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％
装液量的发酵培养基的发酵罐中，
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
在发酵第24h添加2％CPAM，第42h放罐，取发酵液检测聚唾 液酸含量：24h添加分离剂前后分别为17.1g/L，4.0g/L；放罐12.1g/L。 折合单罐产量25.2g/L。
对比例5
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
取冻存的大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103，解冻后， 接种于液体LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％
装液量的发酵培养基的发酵罐中，
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
在发酵第33h添加2％CPAM，第42h放罐，取发酵液检测聚唾 液酸含量：33h添加分离剂前后分别为18.8g/L，2.2g/L；放罐10.4g/L。 折合单罐产量26.6g/L。
对比例6
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
取冻存的大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103，解冻后， 接种于液体LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％
装液量的发酵培养基的发酵罐中，
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
在发酵第18h添加2％CPAM，第42h放罐，取发酵液检测聚唾 液酸含量：18h添加分离剂前后分别为15.7g/L，4.6g/L放罐12.9g/L。 折合单罐产量24g/L。
4.聚唾液酸的纯化分离
放罐发酵液过1000目滤布，截流络合物并酸化处理pH3～6，得 到粗清夜；剩余发酵液过200nm陶瓷膜除菌体，得到粗清夜；粗清 液加热至70℃，离心得到清夜，加50％醋酸4℃结晶得到聚唾酸晶体， 纯度90％以上。收率70％。
对比例7
本实施例提供的制备聚唾液酸的方法，具体如下：
1.菌种活化
购买的大肠杆菌K235，解冻后，接种于液体LB培养基，37℃， 220rpm，培养6h，得到一级种子液。
2.种子培养
取上述一级种子液接种再次接种至新鲜的液体LB培养基中， 35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液。
3.发酵
取二级种子液，按1％接种量，接种至含50％装液量的发酵培养 基的发酵罐中。
起始发酵条件200rpm，0.5vvm，随后发酵过程中调整通气量及 搅拌转速维持溶氧30％左右，底糖耗完后以12g/L.h的速率流加葡萄 糖。
42h放罐，取发酵液检测聚唾液酸含量：单罐产量12.6g/L。
4.聚唾液酸的纯化分离
放罐发酵液过1000目滤布，截流络合物并酸化处理pH3～6，得 到粗清夜；剩余发酵液过200nm陶瓷膜除菌体，得到粗清夜；粗清 液加热至70℃，离心得到清夜，加50％醋酸4℃结晶得到聚唾酸晶体， 纯度90％以上。收率70％。
表1上述实施例和对比例的聚唾液酸浓度
从表1可以看出，未经过去底物分离的最终聚唾液酸浓度(对比 例1)明显低于经过采用底物分离措施的聚唾液酸浓度(实施例1-3)； 此外，采用阴离子表面活性剂的不仅无络合效果反而影响生物量，造 成最终产物浓度偏低(对比例2)，其明显低于实施例1-3的聚唾液酸 浓度，由此可见，采用合适的分离剂例如CPC、DMC-AM或CPAM 可以提高最终聚唾液酸浓度。
此外，实施例1-3的最终聚唾液酸浓度均高于对比例3-6，实施 例4的最终聚唾液酸的浓度高于对比例7，说明，合适的时间点添加 分离剂是提高最终聚唾液酸浓度的有效措施。
另外，不同的菌株具有不同的产聚唾液酸能力，实施例1-3使用 的保藏编号为CCTCC No.M 2018103的产聚唾液酸菌株的聚唾液酸 浓度明显高于实施例4，且实施例1-3与对比例1、3-6最终聚唾液酸 的浓度提升比率大于实施例4与对比例7的最终聚唾液酸浓度的提升 比率。由此说明，本发明提供的制备聚唾液酸的方法适用于大肠杆菌 生产唾液酸，并且更适合用CCTCC No.M 2018103菌株来生产聚唾 液酸。
综上，本发明实施例利用对聚唾液酸具有吸附、络合或耦合能力 的分离剂(例如CPC、DMC-AM或CPAM)，在发酵的过程中在合 适的时间段分多次添加上述分离剂，使发酵液产生的聚唾液酸从发酵 液中被吸附、络合或耦合，实现了聚唾液酸产量的增加。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本 发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备聚唾液酸的方法，其特征在于，其包括：在发酵过程中，往接种有产聚唾液酸菌的发酵培养基中添加对聚唾液酸具有吸附、络合或耦合能力的分离剂。
2.根据权利要求1所述的制备聚唾液酸的方法，其特征在于，所述分离剂为阳离子表面活性剂、阳离子絮凝剂或树脂。
3.根据权利要求2所述的制备聚唾液酸的方法，其特征在于，所述阳离子表面活性剂为十六烷基三甲基季铵溴化物、十八烷基二甲基苄基季铵氯化物。
4.根据权利要求3所述的制备聚唾液酸的方法，其特征在于，所述阳离子表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、氯代十六烷基吡啶。
5.根据权利要求2所述的制备聚唾液酸的方法，其特征在于，所述阳离子絮凝剂为阳离子聚丙烯酰胺。
6.根据权利要求2所述的制备聚唾液酸的方法，其特征在于，所述树脂为(甲基)丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵与丙烯酰胺的共聚物。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备聚唾液酸的方法，其特征在于，在接种产所述聚唾液酸菌后的第12～15h、第22～25h和第32～35h分三次添加所述分离剂。
8.根据权利要求7所述的制备聚唾液酸的方法，其特征在于，每次所述分离剂的添加量为0.5-3％。
9.根据权利要求1-6任一项所述的制备聚唾液酸的方法，其特征在于，所述产聚唾液酸菌为大肠杆菌，保藏编号为CCTCC No.M 2018103。
10.根据权利要求1-6任一项所述的制备聚唾液酸的方法，其特征在于，在接种所述产聚唾液酸菌时，所述发酵培养基含有：磷酸二氢钾8-12g/L，玉米浆干粉3-5g/L，蛋白胨3-5g/L，酵母浸粉1.8-2.2g/L，葡萄糖28-32g/L。
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