JPH07114695B2 - ノイラミニダ−ゼの製造法 - Google Patents
ノイラミニダ−ゼの製造法Info
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- JPH07114695B2 JPH07114695B2 JP61139896A JP13989686A JPH07114695B2 JP H07114695 B2 JPH07114695 B2 JP H07114695B2 JP 61139896 A JP61139896 A JP 61139896A JP 13989686 A JP13989686 A JP 13989686A JP H07114695 B2 JPH07114695 B2 JP H07114695B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ノイラミニダーゼの製造方法、詳しくは誘導
物資の不存在下にノイラミニダーゼ生産能を発現する新
規な変異株、即ち、アースロバクター・ウレアファシエ
ンスM1057（Arthrobacter ureafaciens M1057）株の、
培養によるノイラミニダーゼの製造方法に関する。
物資の不存在下にノイラミニダーゼ生産能を発現する新
規な変異株、即ち、アースロバクター・ウレアファシエ
ンスM1057（Arthrobacter ureafaciens M1057）株の、
培養によるノイラミニダーゼの製造方法に関する。
従来の技術 ノイラミニダーゼ（neuraminidase）は、別名シアリダ
ーゼ（sialidase）とも呼ばれ、国際生化学連合酵素委
員会の酵素番号EC.3.2.1.18に分類され、系統名ではＮ
−アセチルノイラミネート・グリコヒドラーゼ（Ｎ−ac
etylneuraminate glycohydrase）と呼ばれる酵素であ
る。本酵素は、生体の重要な成分である種々のシアル酸
含有複合糖質等に作用して、シアル酸を切断、遊離させ
る働きを有する。
ーゼ（sialidase）とも呼ばれ、国際生化学連合酵素委
員会の酵素番号EC.3.2.1.18に分類され、系統名ではＮ
−アセチルノイラミネート・グリコヒドラーゼ（Ｎ−ac
etylneuraminate glycohydrase）と呼ばれる酵素であ
る。本酵素は、生体の重要な成分である種々のシアル酸
含有複合糖質等に作用して、シアル酸を切断、遊離させ
る働きを有する。
上記ノイラミニダーゼの供給源としては、従来コレラ
菌、ガス壊疽菌、肺炎菌、ジフテリア菌等の病原性細菌
が主流を占めていたが、本発明者らの研究開発により、
アースロバクター（Arthrobacter）属その他の数種の属
に属する非病原性細菌から、感染の危険を伴うことな
く、上記酵素を工業的規模で製造する技術が先に確立さ
れた〔特公昭50−11991号公報、特許第801089号及び特
公昭52−39917号公報、特許第914556号参照〕。
菌、ガス壊疽菌、肺炎菌、ジフテリア菌等の病原性細菌
が主流を占めていたが、本発明者らの研究開発により、
アースロバクター（Arthrobacter）属その他の数種の属
に属する非病原性細菌から、感染の危険を伴うことな
く、上記酵素を工業的規模で製造する技術が先に確立さ
れた〔特公昭50−11991号公報、特許第801089号及び特
公昭52−39917号公報、特許第914556号参照〕。
しかしながら、上記本発明者らが先に開発した本酵素の
製造技術では、コロミン酸等の誘導物質を培地に存在さ
せることが必要で、この誘導物質の不存在下では、目的
とする酵素は到底工業的規模で生産できないものであっ
た。即ち、上記先に開発した技術に利用される微生物
は、いずれもコロミン酸等の誘導物質の不存在下ではノ
イラミニダーゼ生産能を実質的に発現しないものであっ
た。しかるに上記コロミン酸等は、通常その調製に繁雑
な操作等を要し且つ高価なものであり、その入手が容易
でない不利があった。
製造技術では、コロミン酸等の誘導物質を培地に存在さ
せることが必要で、この誘導物質の不存在下では、目的
とする酵素は到底工業的規模で生産できないものであっ
た。即ち、上記先に開発した技術に利用される微生物
は、いずれもコロミン酸等の誘導物質の不存在下ではノ
イラミニダーゼ生産能を実質的に発現しないものであっ
た。しかるに上記コロミン酸等は、通常その調製に繁雑
な操作等を要し且つ高価なものであり、その入手が容易
でない不利があった。
発明が解決しようとする問題点 本発明は、上記技術の最大の欠点とするコロミン酸等の
利用を必須とする点を解消し、該コロミン酸等を利用せ
ずとも、工業的規模で大量のノイラミニダーゼを製造で
きる技術を開発することを目的とする。
利用を必須とする点を解消し、該コロミン酸等を利用せ
ずとも、工業的規模で大量のノイラミニダーゼを製造で
きる技術を開発することを目的とする。
本発明者らは、上記目的から、更に鋭意研究を重ねた結
果、先に開発した技術に利用するアースロバクター属に
属する微生物を、変異処理して得られる変異株の内に、
コロミン酸等の誘導物質の無添加培地において、目的酵
素を著量生産できる微生物が存在し、即ち、上記変異処
理により誘導物質不存在下でのノイラミニダーゼ生産能
を付与された変異微生物が創製され、該変異微生物の培
養によるときには、上記目的が達成されることを見出し
た。本発明は、この知見に基づいて完成されたものであ
る。
果、先に開発した技術に利用するアースロバクター属に
属する微生物を、変異処理して得られる変異株の内に、
コロミン酸等の誘導物質の無添加培地において、目的酵
素を著量生産できる微生物が存在し、即ち、上記変異処
理により誘導物質不存在下でのノイラミニダーゼ生産能
を付与された変異微生物が創製され、該変異微生物の培
養によるときには、上記目的が達成されることを見出し
た。本発明は、この知見に基づいて完成されたものであ
る。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、誘導物質の不存在下に、アースロバク
ター・ウレアファシエンスM1057（以下これを単に「変
異株」ということがある）を培養して、培養物よりノイ
ラミニダーゼを採取することを特徴とするノイラミニダ
ーゼの製造法が提供される。
ター・ウレアファシエンスM1057（以下これを単に「変
異株」ということがある）を培養して、培養物よりノイ
ラミニダーゼを採取することを特徴とするノイラミニダ
ーゼの製造法が提供される。
本明細書において、誘導物質とは、先に開発したアース
ロバクター属細菌その他の細菌の培養の際、培地に添加
することによって、之等細菌にノイラミニダーゼ生産性
を付与する物質をいう。該誘導物質にはコロミン酸を初
めとして、その関連化合物、例えばシアル酸、結合型シ
アル酸を含有するガングリオシド、シアロムコ多糖類等
やマンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン等のシアル
酸分解物等が包含される。
ロバクター属細菌その他の細菌の培養の際、培地に添加
することによって、之等細菌にノイラミニダーゼ生産性
を付与する物質をいう。該誘導物質にはコロミン酸を初
めとして、その関連化合物、例えばシアル酸、結合型シ
アル酸を含有するガングリオシド、シアロムコ多糖類等
やマンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン等のシアル
酸分解物等が包含される。
本発明方法によれば、上記変異株の利用に基づいて、そ
の調製に繁雑な操作を要ししかも高価で、その利用に不
利が伴われるコロミン酸等の誘導物質の使用を回避し
て、通常の微生物の培養に用いられる培地中で、著量の
目的とするノイラミニダーゼを産生、蓄積させることが
でき、従って、該酵素を工業的規模で大量に且つ容易に
製造することができる。
の調製に繁雑な操作を要ししかも高価で、その利用に不
利が伴われるコロミン酸等の誘導物質の使用を回避し
て、通常の微生物の培養に用いられる培地中で、著量の
目的とするノイラミニダーゼを産生、蓄積させることが
でき、従って、該酵素を工業的規模で大量に且つ容易に
製造することができる。
本発明方法においては、アースロバクター ウレアファ
シエンスATCC7562を親株として化学的突然変異誘起剤処
理により得られた、アースロバクター ウレアファシエンスM1057を用いることが重要である。
該M1057株は、より具体的には、以下の変異処理手段を
採用して得られる。即ち、親株を、まず、ペプトン1.0
％（重量％、以下同じ）、酵母エキス0.5％及びグルコ
ース0.1％を含有し、pHを約7.2に調節したＬ培地に−白
金耳植菌し、30℃で振盪培養し、中期対数期で集菌し、
生理食塩水で洗浄後、約５×108細胞/ml前後になるよう
に生理食塩水に懸濁させて細胞懸濁液を調製する。次に
上記で調製した懸濁液に、最終濃度が約50〜200μg/ml
となるようにニトロソグアニジンを添加し、約30℃前後
で約30〜120分間軽く振盪処理を施した後、遠心分離に
より菌体を集め、これを生理食塩水で洗浄後、生理食塩
水に懸濁させる。上記懸濁液の一部を取って、これを通
常の生育培地、例えばペプトン0.5％、酵母エキス0.5％
及び寒天2.0％からなる固体培地（以下これを「YPA培
地」と呼ぶ）に塗りつけ、これを約30℃前後で培養して
コロニーを形成させ、形成された各コロニーを、YPA培
地から寒天を除いた培地（「YP培地」）に移し代え、更
に約30℃前後で一夜振盪培養する。上記により得られる
培養液を遠心分離後、上澄液について、常法に従いノイ
ラミニダーゼ活性を測定して、著量の目的酵素生産能を
有する菌株を選択する。
シエンスATCC7562を親株として化学的突然変異誘起剤処
理により得られた、アースロバクター ウレアファシエンスM1057を用いることが重要である。
該M1057株は、より具体的には、以下の変異処理手段を
採用して得られる。即ち、親株を、まず、ペプトン1.0
％（重量％、以下同じ）、酵母エキス0.5％及びグルコ
ース0.1％を含有し、pHを約7.2に調節したＬ培地に−白
金耳植菌し、30℃で振盪培養し、中期対数期で集菌し、
生理食塩水で洗浄後、約５×108細胞/ml前後になるよう
に生理食塩水に懸濁させて細胞懸濁液を調製する。次に
上記で調製した懸濁液に、最終濃度が約50〜200μg/ml
となるようにニトロソグアニジンを添加し、約30℃前後
で約30〜120分間軽く振盪処理を施した後、遠心分離に
より菌体を集め、これを生理食塩水で洗浄後、生理食塩
水に懸濁させる。上記懸濁液の一部を取って、これを通
常の生育培地、例えばペプトン0.5％、酵母エキス0.5％
及び寒天2.0％からなる固体培地（以下これを「YPA培
地」と呼ぶ）に塗りつけ、これを約30℃前後で培養して
コロニーを形成させ、形成された各コロニーを、YPA培
地から寒天を除いた培地（「YP培地」）に移し代え、更
に約30℃前後で一夜振盪培養する。上記により得られる
培養液を遠心分離後、上澄液について、常法に従いノイ
ラミニダーゼ活性を測定して、著量の目的酵素生産能を
有する菌株を選択する。
かくして、選択された菌株のひとつとしてM1057株を取
得する。該株は、親株と対比して誘導物質の非存在下に
著量のノイラミニダーゼ産生能を有する点において、際
立つた相違が認められる以外に、その菌学的性質は親株
と同一の特徴を有しており、これはアースロバクター属
に属する変異株と同定される。
得する。該株は、親株と対比して誘導物質の非存在下に
著量のノイラミニダーゼ産生能を有する点において、際
立つた相違が認められる以外に、その菌学的性質は親株
と同一の特徴を有しており、これはアースロバクター属
に属する変異株と同定される。
上記M1057株は、通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に、アースロバクター ウレアファシエンス（Ar
throbacter ureafaciens）M1057として寄託されてお
り、その受託番号は「微工研菌寄託第8804号、FERM Ｐ
−8804」である。
研究所に、アースロバクター ウレアファシエンス（Ar
throbacter ureafaciens）M1057として寄託されてお
り、その受託番号は「微工研菌寄託第8804号、FERM Ｐ
−8804」である。
本発明方法は、上記のごとくして得られるアースロバク
ター属に属する変異株を、培養することにより実施され
る。
ター属に属する変異株を、培養することにより実施され
る。
この培養は、通常の液体培地及び固体培地のいずれを用
いても実施できるが、通常液体培地を用いるのが有利で
ある。また所望酵素を量産するためには、振盪培養や通
気攪拌培養等を行なうのが好ましい。上記培養に当り培
地としては、特に制限はなく、微生物の培養に一般に用
いられている栄養源等を含有する各種の培地がいずれも
利用できる。該栄養源としては、例えばブドウ糖、果
糖、乳糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリセ
ロール等の糖質類、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等
の有機酸類等の炭素源、ペプチド類、肉エキス、酵母エ
キス、カザミノ酸、尿素、アンモニウム塩、硝酸塩等の
窒素源等を例示できる。また培地には上記炭素源及び窒
素源の他、例えばリン、マグネシウム、カリウム、ナト
リウム等の無機塩類、ホウ素、銅、ヨウ素、鉄、マンガ
ン、亜鉛、コバルト、モリブデン等の微量元素類及び酵
母エキス、ビタミン類等の微量生育因子等を適宜添加使
用することもできる。更に上記培地としては、例えば動
物組織抽出物又は浸出物等を含有する天然培地乃至半合
成培地等も使用することができる。之等天然乃至半合成
培地の具体例としては、例えばトッド・ヘウイット肉汁
（Todd Hewitt Broth）やブレイン・ハート・インフュ
ージョン（Brain Heart Infusion）培地等の名称で市
販されているものを例示できる。
いても実施できるが、通常液体培地を用いるのが有利で
ある。また所望酵素を量産するためには、振盪培養や通
気攪拌培養等を行なうのが好ましい。上記培養に当り培
地としては、特に制限はなく、微生物の培養に一般に用
いられている栄養源等を含有する各種の培地がいずれも
利用できる。該栄養源としては、例えばブドウ糖、果
糖、乳糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリセ
ロール等の糖質類、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等
の有機酸類等の炭素源、ペプチド類、肉エキス、酵母エ
キス、カザミノ酸、尿素、アンモニウム塩、硝酸塩等の
窒素源等を例示できる。また培地には上記炭素源及び窒
素源の他、例えばリン、マグネシウム、カリウム、ナト
リウム等の無機塩類、ホウ素、銅、ヨウ素、鉄、マンガ
ン、亜鉛、コバルト、モリブデン等の微量元素類及び酵
母エキス、ビタミン類等の微量生育因子等を適宜添加使
用することもできる。更に上記培地としては、例えば動
物組織抽出物又は浸出物等を含有する天然培地乃至半合
成培地等も使用することができる。之等天然乃至半合成
培地の具体例としては、例えばトッド・ヘウイット肉汁
（Todd Hewitt Broth）やブレイン・ハート・インフュ
ージョン（Brain Heart Infusion）培地等の名称で市
販されているものを例示できる。
上記各種培地を利用した変異株の培養条件としては、培
養温度約20〜40℃、好ましくは約25〜30℃とするのがよ
く、培養開始後約15〜70時間の間に、ノイラミニダーゼ
活性が最高に達する。従ってこの時期に培養を停止して
培養液から所望のノイラミニダーゼを採取すればよい。
この培養液からの目的酵素の採取は、通常の方法に従
い、例えば培養液から菌体を分離除去した後、清澄液に
硫安塩析法、カラムクロマトグラフイー等の精製操作を
施すことにより実施でき、かくして精製ノイラミニダー
ゼを取得できる。
養温度約20〜40℃、好ましくは約25〜30℃とするのがよ
く、培養開始後約15〜70時間の間に、ノイラミニダーゼ
活性が最高に達する。従ってこの時期に培養を停止して
培養液から所望のノイラミニダーゼを採取すればよい。
この培養液からの目的酵素の採取は、通常の方法に従
い、例えば培養液から菌体を分離除去した後、清澄液に
硫安塩析法、カラムクロマトグラフイー等の精製操作を
施すことにより実施でき、かくして精製ノイラミニダー
ゼを取得できる。
実施例 以下、実施例を挙げて本発明方法を更に詳しく説明す
る。
る。
尚、各例におけるノイラミニダーゼ活性は、以下の方法
により測定した。即ち、酵素試料液0.1ml、0.4％Ｎ−ア
セチルノイラミンラクトース（ベーリンガーマンハイム
山之内社製）溶液0.05ml及び0.2M酢酸緩衝液（pH5.0）
0.05mlの合計0.2mlを、37℃で10分間反応させて、遊離
したＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）の量を、チ
オバルビツール酸法〔L.Warren,J.Biol.Chem.,234,1971
（1959）〕により定量した。
により測定した。即ち、酵素試料液0.1ml、0.4％Ｎ−ア
セチルノイラミンラクトース（ベーリンガーマンハイム
山之内社製）溶液0.05ml及び0.2M酢酸緩衝液（pH5.0）
0.05mlの合計0.2mlを、37℃で10分間反応させて、遊離
したＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）の量を、チ
オバルビツール酸法〔L.Warren,J.Biol.Chem.,234,1971
（1959）〕により定量した。
ノイラミニダーゼ活性の１単位とは、上記反応条件下で
１分間に１μモルのＮ−アセチルノイラミン酸を遊離す
る酵素量を言う。
１分間に１μモルのＮ−アセチルノイラミン酸を遊離す
る酵素量を言う。
実施例１ ラクトース0.5g、リン酸第二アンモニウム0.2g、塩化ナ
トリウム0.3g、リン酸第二カリウム0.1g、硫酸マグネシ
ウム0.01g及び水100mlを、500ml容三角フラスコに入
れ、pHを7.0に調節し、加熱滅菌して培養液を作成し
た。
トリウム0.3g、リン酸第二カリウム0.1g、硫酸マグネシ
ウム0.01g及び水100mlを、500ml容三角フラスコに入
れ、pHを7.0に調節し、加熱滅菌して培養液を作成し
た。
上記培養液にアースロバクター ウレアファシエンスM1
057株（微工研菌寄託第8804号）を接種し、28℃にて24
時間振盪培養を行ない、培養液（105ml）を得た。
057株（微工研菌寄託第8804号）を接種し、28℃にて24
時間振盪培養を行ない、培養液（105ml）を得た。
得られた粗酵素液1ml当りのノイラミニダーゼ活性は、
2.8単位であった。
2.8単位であった。
次いで、上記で得られた培養液100mlを、硫安で塩析
し、30〜90％飽和区分（飽和度はオズボーン法で表示、
以下同じ）を、少量の水に溶かし、10mM酢酸緩衝液（pH
4.5）に対して透析した。
し、30〜90％飽和区分（飽和度はオズボーン法で表示、
以下同じ）を、少量の水に溶かし、10mM酢酸緩衝液（pH
4.5）に対して透析した。
また、可溶性澱粉とコロミン酸とを2N苛性ソーダに溶か
し、これにエピクロルヒドリンを加えて調製したコロミ
ン酸をリガンドとするゲルをカラムに充填し、該カラム
に上記透析液を通して吸着させ、これを100mM酢酸緩衝
液（pH4.5）にて溶出させて、精製ノイラミニダーゼ27
3.8単位を得た（収率97.8％）。
し、これにエピクロルヒドリンを加えて調製したコロミ
ン酸をリガンドとするゲルをカラムに充填し、該カラム
に上記透析液を通して吸着させ、これを100mM酢酸緩衝
液（pH4.5）にて溶出させて、精製ノイラミニダーゼ27
3.8単位を得た（収率97.8％）。
かくして得られたノイラミニダーゼ精製標品中には、プ
ロテアーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、
ホスホリパーゼＣ及びグリコシダーゼ類の混在は認めら
れなかった。
ロテアーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、
ホスホリパーゼＣ及びグリコシダーゼ類の混在は認めら
れなかった。
比較例１ 実施例１において、変異株M1057に代えて、その親株で
あるオースロバクター ウレアフアシエンスATCC7562株
を用い、同様にして培養して得られた酵素活性を測定し
た。その結果、培養液1ml値の酵素活性は0.002単位であ
った。
あるオースロバクター ウレアフアシエンスATCC7562株
を用い、同様にして培養して得られた酵素活性を測定し
た。その結果、培養液1ml値の酵素活性は0.002単位であ
った。
尚、この親株は、コロミン酸添加培地、即ちコロミン酸
0.5g、リン酸第二アンモニウム0.2g、塩化ナトリウム0.
3g、リン酸第二カリウム0.1g、硫酸マグネシウム0.01g
及び水100mlからなり、pHを7.0に調節し、加熱滅菌して
調製した培地での培養によれば、培養液1ml当り3.2の酵
素活性を示した。
0.5g、リン酸第二アンモニウム0.2g、塩化ナトリウム0.
3g、リン酸第二カリウム0.1g、硫酸マグネシウム0.01g
及び水100mlからなり、pHを7.0に調節し、加熱滅菌して
調製した培地での培養によれば、培養液1ml当り3.2の酵
素活性を示した。
実施例２ ペプトン1.0g、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％及び水100m
lを500ml容三角フラスコに入れ、pH6.5になるように苛
性ソーダで調節し、加熱滅菌した培養液に、実施例１と
同一のアースロバクター ウレアファシエンスM1057株
を接種し、30℃にて24時間振盪培養を行なった。得られ
た培養液を粗酵素液とした。
lを500ml容三角フラスコに入れ、pH6.5になるように苛
性ソーダで調節し、加熱滅菌した培養液に、実施例１と
同一のアースロバクター ウレアファシエンスM1057株
を接種し、30℃にて24時間振盪培養を行なった。得られ
た培養液を粗酵素液とした。
この液のノイラミニダーゼ活性は、3.0単位であった。
この透析液を、実施例１と同様にしてアフイニテイカラ
ムに吸着させ、同様に溶出を行なって、292.2単位のノ
イラミニダーゼを得た（収率97.4％）。得られたノイラ
ミニダーゼ精製標品中には、実施例１と同様に夾雑酵素
の混在は全く認められなかった。
ムに吸着させ、同様に溶出を行なって、292.2単位のノ
イラミニダーゼを得た（収率97.4％）。得られたノイラ
ミニダーゼ精製標品中には、実施例１と同様に夾雑酵素
の混在は全く認められなかった。
Claims (1)
- 【請求項１】誘導物質の不存在下に、アースロバクター
・ウレアファシエンスM1057を培養して、培養物よりノ
イラミニターゼを採取することを特徴とするノイラミニ
ダーゼの製造法。
Priority Applications (5)
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