JP2724588B2 - ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法 - Google Patents
ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法Info
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- JP2724588B2 JP2724588B2 JP63109530A JP10953088A JP2724588B2 JP 2724588 B2 JP2724588 B2 JP 2724588B2 JP 63109530 A JP63109530 A JP 63109530A JP 10953088 A JP10953088 A JP 10953088A JP 2724588 B2 JP2724588 B2 JP 2724588B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規なノイラミニダーゼ・アイソザイム及
びそれを用いるガングリオシド類の製造法に関する。
びそれを用いるガングリオシド類の製造法に関する。
従来技術とその課題 ガングリオシドは、シアル酸を含有するスフィンゴ糖
脂質群の総称であり、高等動物の脳特に神経系に存在す
ることが知られている。ガングリオシド類は、生体内に
おいて、神経機能や細胞の相互識別、分化、増殖、ガン
化、老化等に関与し、また細胞社会学的視点から、コレ
ラトキシン、ボツリヌス毒素等の細胞毒素、甲状腺ホル
モン等のペプチドホルモン、インターフェロン等の受容
体機能にあずかり、更に細胞表面の陰性電荷に寄与して
いるものと考えられる。実際、ウシの脳から抽出された
ガングリオシド類が、障害を受けた末梢神経の再生に促
進的に働き、特に、アルコール症の多発性神経炎や糖尿
病性ニューロパチーの治療薬として有用であることが報
告されている〔「医学と薬学」、第13巻、６号、1407〜
1412（1985）、［プラクティス」、４（４）、452〜456
（1987）、「医薬ジャーナル」、22（７）、55〜62（19
86）〕。
脂質群の総称であり、高等動物の脳特に神経系に存在す
ることが知られている。ガングリオシド類は、生体内に
おいて、神経機能や細胞の相互識別、分化、増殖、ガン
化、老化等に関与し、また細胞社会学的視点から、コレ
ラトキシン、ボツリヌス毒素等の細胞毒素、甲状腺ホル
モン等のペプチドホルモン、インターフェロン等の受容
体機能にあずかり、更に細胞表面の陰性電荷に寄与して
いるものと考えられる。実際、ウシの脳から抽出された
ガングリオシド類が、障害を受けた末梢神経の再生に促
進的に働き、特に、アルコール症の多発性神経炎や糖尿
病性ニューロパチーの治療薬として有用であることが報
告されている〔「医学と薬学」、第13巻、６号、1407〜
1412（1985）、［プラクティス」、４（４）、452〜456
（1987）、「医薬ジャーナル」、22（７）、55〜62（19
86）〕。
上述したように、ガングリオシド類は生体内において
種々の機能を有する重要な物質群であり、従って、各種
のガングリオシドを純粋に取出す方法の確立が望まれて
いる。従来、特定のガングリオシドを製造するに当って
は、種々のクロマトグラフィーを使用する方法が試みら
れているが、出発原料である牛脳等から抽出されたガン
グリオシド成分が、多種類のガングリオシドを微量ずつ
含むガングリオシド類の混合物であるため、繁雑な操作
を行なっても目的物を得るのが非常に困難であり、的確
な精製方法を見出されていない。また、化学的手法によ
ってガングリオシド類を合成する試みも成されている
が、工程が複雑であり、副反応が起り安く、副生物の分
離が困難である。
種々の機能を有する重要な物質群であり、従って、各種
のガングリオシドを純粋に取出す方法の確立が望まれて
いる。従来、特定のガングリオシドを製造するに当って
は、種々のクロマトグラフィーを使用する方法が試みら
れているが、出発原料である牛脳等から抽出されたガン
グリオシド成分が、多種類のガングリオシドを微量ずつ
含むガングリオシド類の混合物であるため、繁雑な操作
を行なっても目的物を得るのが非常に困難であり、的確
な精製方法を見出されていない。また、化学的手法によ
ってガングリオシド類を合成する試みも成されている
が、工程が複雑であり、副反応が起り安く、副生物の分
離が困難である。
一方、ノイラミニダーゼは、単独では、ガングリオシ
ド類には直接作用しないと考えられていた酵素であり、
実際、コール酸塩等の界面活性剤の存在下にガングリオ
シドGM1からアシアロガングリオシドGA1を生成するとい
う報告がなされているのみである〔斎藤正樹：代謝、1
6、761（1977）〕。しかも、ノイラミニダーゼにアイソ
ザイムが存在することは全く知られていない。
ド類には直接作用しないと考えられていた酵素であり、
実際、コール酸塩等の界面活性剤の存在下にガングリオ
シドGM1からアシアロガングリオシドGA1を生成するとい
う報告がなされているのみである〔斎藤正樹：代謝、1
6、761（1977）〕。しかも、ノイラミニダーゼにアイソ
ザイムが存在することは全く知られていない。
課題を解決するための手段 本発明者は、上記従来技術の課題に鑑みて鋭意研究を
重ねた結果、ガングリオシド類から特定のガングリオシ
ドを生成し得る、新規なノイラミニダーゼ・アイソザイ
ムを見い出し、本発明を完成した。
重ねた結果、ガングリオシド類から特定のガングリオシ
ドを生成し得る、新規なノイラミニダーゼ・アイソザイ
ムを見い出し、本発明を完成した。
即ち本発明は、 下記の理化学的性状を有するノイラミニダーゼ・アイ
ソザイムＳ 作用：ガングリオシド類から選択的にガングリオシドG
D1b及び／又はガングリオシドGM1を生成する。
ソザイムＳ 作用：ガングリオシド類から選択的にガングリオシドG
D1b及び／又はガングリオシドGM1を生成する。
分子量：約52000ダルトン（ゲル過クロマトグラフィ
ー及びSDS−PAGE電気泳動法による） 至適pH:3.8〜4.4（牛脳ガングリオシド類を基質とした
場合） 熱安定性:60℃以下、及び ガングリオシド類に、請求項のノイラミニダーゼ・
アイソザイムＳを作用させて、ガングリオシドGD1b及び
／又はガングリオシドGM1を選択的に得ることを特徴と
するガングリオシド類の製造法に係る。
ー及びSDS−PAGE電気泳動法による） 至適pH:3.8〜4.4（牛脳ガングリオシド類を基質とした
場合） 熱安定性:60℃以下、及び ガングリオシド類に、請求項のノイラミニダーゼ・
アイソザイムＳを作用させて、ガングリオシドGD1b及び
／又はガングリオシドGM1を選択的に得ることを特徴と
するガングリオシド類の製造法に係る。
本発明者は鋭意研究の結果、アースロバクター・ウレ
アファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）起源のノ
イラミニダーゼには新規なアイソザイムが存在し、該ア
イソザイムをガングリオシド類に作用させる場合には、
ガングリオシドGD1b（以下GD1bという）及び／又はガン
グリオシドGM1（以下GM1という）が高純度で収率良く且
つ選択的に得られることを見出した。また、本発明によ
れば、副生物が生成しないので、得られるGD1b及びGM1
を容易に精製できる。また、本酵素を用いる場合には、
従来使用されていた界面活性剤を使用する必要がない。
アファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）起源のノ
イラミニダーゼには新規なアイソザイムが存在し、該ア
イソザイムをガングリオシド類に作用させる場合には、
ガングリオシドGD1b（以下GD1bという）及び／又はガン
グリオシドGM1（以下GM1という）が高純度で収率良く且
つ選択的に得られることを見出した。また、本発明によ
れば、副生物が生成しないので、得られるGD1b及びGM1
を容易に精製できる。また、本酵素を用いる場合には、
従来使用されていた界面活性剤を使用する必要がない。
本発明ノイラミニダーゼ・アイソザイムＳ（以下単に
アイソザイムＳという）の活性測定は、ノイラミニダー
ゼの通常の活性測定方法と同様にして行なえばよい。例
えば、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー〔J.Biol.Chem.,234,1971（1959）〕等に記載のチオ
バルビツール酸法に従って行なえばよい。アイソザイム
Ｓの１単位は、37℃で１分間に１マイクロモルのＮ−ア
セチルノイラミン酸を生成する酵素量とする。
アイソザイムＳという）の活性測定は、ノイラミニダー
ゼの通常の活性測定方法と同様にして行なえばよい。例
えば、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー〔J.Biol.Chem.,234,1971（1959）〕等に記載のチオ
バルビツール酸法に従って行なえばよい。アイソザイム
Ｓの１単位は、37℃で１分間に１マイクロモルのＮ−ア
セチルノイラミン酸を生成する酵素量とする。
本発明アイソザイムＳの分子量測定に採用したゲル
過クロマトグラフィー及びSDS−PAGE電気泳動は、以下
のようにして行なった。
過クロマトグラフィー及びSDS−PAGE電気泳動は、以下
のようにして行なった。
〔ゲル過クロマトグラフィー〕 セファデックスG150（ファルマシア社製）を用いるゲ
ル過法によった。溶出液としては、50mMリン酸緩衝液
を用いた。
ル過法によった。溶出液としては、50mMリン酸緩衝液
を用いた。
U.K.Laemmli〔Nature,227,680（1970）〕の方法に従
い、SDS−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を
行なった。
い、SDS−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を
行なった。
また本発明アイソザイムＳの安定pH域は3.5〜10.0で
あり、また、作用適温は45〜55℃である。
あり、また、作用適温は45〜55℃である。
一方、アースロバクター・ウレアファシエンス起源の
ノイラミニダーゼはＩ及びIIに分離されており、その理
化学的性質は下記第１表の通りであるとされていた〔Y.
Uchida et al,J.Biochem.,86,425,（1979）〕。
ノイラミニダーゼはＩ及びIIに分離されており、その理
化学的性質は下記第１表の通りであるとされていた〔Y.
Uchida et al,J.Biochem.,86,425,（1979）〕。
上記したように、従来のノイラミニダーゼと本発明ア
イソザイムＳは理化学的性質を異にしている。従って、
本発明アイソザイムＳは、従来報告されているアースロ
バクター・ウレアファシエンス起源のノイラミニダーゼ
とは異なった分子種の酵素であることが判る。
イソザイムＳは理化学的性質を異にしている。従って、
本発明アイソザイムＳは、従来報告されているアースロ
バクター・ウレアファシエンス起源のノイラミニダーゼ
とは異なった分子種の酵素であることが判る。
本発明アイソザイムＳは、アースロバクター・ウレア
ファシエンスを培養し、得られる培養物から採取でき
る。
ファシエンスを培養し、得られる培養物から採取でき
る。
アースロバクター・ウレアファシエンスとしては公知
のものを用いることができ、その具体例としては、例え
ば、アースロバクター・ウレアファシエンスM1057株
（微工研条寄第1391号）等を挙げることができる。
のものを用いることができ、その具体例としては、例え
ば、アースロバクター・ウレアファシエンスM1057株
（微工研条寄第1391号）等を挙げることができる。
アースロバクター・ウレアファシエンスの培養は、通
常の液体培地及び固体培地のいずれを用いても実施でき
るが、通常液体培地を用いるのが有利である。また所望
酵素を生産するためには、振盪培養や通気撹拌培養等を
行なうのが好ましい。培地としては特に制限がなく、微
生物の培養に用いられる通常の栄養源等を含有する各種
の培地を使用できる。栄養源としては、例えば、ブドウ
糖、果糖、乳糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、
グリセロール等の糖質類、ピルビン酸、リンゴ酸、コハ
ク酸糖の有機酸類等の炭素源、ペプチド類、肉エキス、
酵母エキス、カザミノ酸、尿素、アンモニウム塩、硝酸
塩等の窒素源、リン、マグネシウム、カリウム、ナトリ
ウム等の無機塩類、硼素、銅、沃素、鉄、マンガン、亜
鉛、コバルト、モリブデン等の微量元素類、ビタミン類
等の微量成育因子等を例示できる。更に、例えば動物組
織抽出物又は浸出物等を含有する天然乃至半合成培地等
も使用できる。該培地の具体例としては、例えば、、ト
ッド・ヘウィット肉汁（Todd Hewitt Broth）やブレイ
ン・ハート・インフュージョン（Brain Heart Infusio
n）培地等の名称で市販されているもの等を例示でき
る。
常の液体培地及び固体培地のいずれを用いても実施でき
るが、通常液体培地を用いるのが有利である。また所望
酵素を生産するためには、振盪培養や通気撹拌培養等を
行なうのが好ましい。培地としては特に制限がなく、微
生物の培養に用いられる通常の栄養源等を含有する各種
の培地を使用できる。栄養源としては、例えば、ブドウ
糖、果糖、乳糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、
グリセロール等の糖質類、ピルビン酸、リンゴ酸、コハ
ク酸糖の有機酸類等の炭素源、ペプチド類、肉エキス、
酵母エキス、カザミノ酸、尿素、アンモニウム塩、硝酸
塩等の窒素源、リン、マグネシウム、カリウム、ナトリ
ウム等の無機塩類、硼素、銅、沃素、鉄、マンガン、亜
鉛、コバルト、モリブデン等の微量元素類、ビタミン類
等の微量成育因子等を例示できる。更に、例えば動物組
織抽出物又は浸出物等を含有する天然乃至半合成培地等
も使用できる。該培地の具体例としては、例えば、、ト
ッド・ヘウィット肉汁（Todd Hewitt Broth）やブレイ
ン・ハート・インフュージョン（Brain Heart Infusio
n）培地等の名称で市販されているもの等を例示でき
る。
培養条件としては、培養温度20〜40℃程度、好ましく
は25〜30℃程度、培養時間は10〜70時間程度とすればよ
い。
は25〜30℃程度、培養時間は10〜70時間程度とすればよ
い。
かくして得られるアースロバクター・ウレアファシエ
ンスの培養液から、公知の方法に従って本発明アイソザ
イムＳを採取することができる。例えば、培養液から菌
体を分離除去し、得られる清澄液に、硫安分画、アフィ
ニティクロマトグラフィー、必要に応じイオン交換クロ
マトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル過等
の精製操作を施せばよい。
ンスの培養液から、公知の方法に従って本発明アイソザ
イムＳを採取することができる。例えば、培養液から菌
体を分離除去し、得られる清澄液に、硫安分画、アフィ
ニティクロマトグラフィー、必要に応じイオン交換クロ
マトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル過等
の精製操作を施せばよい。
かくして得られる本発明アイソザイムＳをガングリオ
シド類に作用させることにより、GM1及びGD1bを選択的
に得ることができる。上記酵素反応は、ガングリオシド
類（基質）及び緩衝液、更に必要に応じて殺菌水を含む
反応液に、アイソザイムＳを添加することにより行なわ
れる。
シド類に作用させることにより、GM1及びGD1bを選択的
に得ることができる。上記酵素反応は、ガングリオシド
類（基質）及び緩衝液、更に必要に応じて殺菌水を含む
反応液に、アイソザイムＳを添加することにより行なわ
れる。
上記酵素反応において、主にGD1bを得ようとする場
合、その反応条件は以下の通りである。ガングリオシド
類としては特に制限されず公知のものが使用でき、その
具体例としては、例えば、ガングリオシドGT1b及び／又
はガングリオシドGQ1b、牛脳抽出ガングリオシド混合物
等を例示できる。ガングリオシド類の使用量は特に制限
されないが、通常反応液1mlあたり20mg以下、好ましく
は0.1〜3mg程度とすればよい。アイソザイムＳの使用量
も特に制限されないが、通常反応液1ml当り1mU以上、好
ましくは10〜500mU程度とすればよい。緩衝液としてはp
Hが３〜６程度の公知のものが使用でき、例えば、10〜2
00mM程度の酢酸緩衝液（pH3.5〜5.0）、Mcllvaine緩衝
液（pH3.5〜5.5）等を例示できる。反応温度は酵素が作
用し得る温度であれば特に制限されないが、通常30〜40
℃程度とすればよい。反応時間は基質濃度、反応温度等
により適宜選択すればよいが、例えば37℃の時には15分
〜５時間程度とすればよい。
合、その反応条件は以下の通りである。ガングリオシド
類としては特に制限されず公知のものが使用でき、その
具体例としては、例えば、ガングリオシドGT1b及び／又
はガングリオシドGQ1b、牛脳抽出ガングリオシド混合物
等を例示できる。ガングリオシド類の使用量は特に制限
されないが、通常反応液1mlあたり20mg以下、好ましく
は0.1〜3mg程度とすればよい。アイソザイムＳの使用量
も特に制限されないが、通常反応液1ml当り1mU以上、好
ましくは10〜500mU程度とすればよい。緩衝液としてはp
Hが３〜６程度の公知のものが使用でき、例えば、10〜2
00mM程度の酢酸緩衝液（pH3.5〜5.0）、Mcllvaine緩衝
液（pH3.5〜5.5）等を例示できる。反応温度は酵素が作
用し得る温度であれば特に制限されないが、通常30〜40
℃程度とすればよい。反応時間は基質濃度、反応温度等
により適宜選択すればよいが、例えば37℃の時には15分
〜５時間程度とすればよい。
また、上記酵素反応において、主にＧM1を得ようとす
る場合には、その反応条件は以下の通りである。ガング
リオシド類としては特に制限されず公知のものが使用で
き、その具体例としては、例えば、ガングリオシド
GD1a、GD1b、GT1a、GT1b及びGQ1bから選ばれた少くとも
１種、牛脳抽出ガングリオシド混合物等を例示できる。
ガングリオシド類の使用量は特に制限されないが、通常
反応液1mlあたり20mg以下、好ましくは0.05〜1mg程度と
すればよい。アイソザイムＳの使用量も特に制限されな
いが、通常反応液1ml当り3mU以上、好ましくは50mU程度
とすればよい。緩衝液及び反応温度はGD1bの場合と同様
の条件でよい。反応時間は基質濃度、反応温度等により
適宜選択すればよいが、例えば37℃の時には30分〜12時
間程度とすればよい。
る場合には、その反応条件は以下の通りである。ガング
リオシド類としては特に制限されず公知のものが使用で
き、その具体例としては、例えば、ガングリオシド
GD1a、GD1b、GT1a、GT1b及びGQ1bから選ばれた少くとも
１種、牛脳抽出ガングリオシド混合物等を例示できる。
ガングリオシド類の使用量は特に制限されないが、通常
反応液1mlあたり20mg以下、好ましくは0.05〜1mg程度と
すればよい。アイソザイムＳの使用量も特に制限されな
いが、通常反応液1ml当り3mU以上、好ましくは50mU程度
とすればよい。緩衝液及び反応温度はGD1bの場合と同様
の条件でよい。反応時間は基質濃度、反応温度等により
適宜選択すればよいが、例えば37℃の時には30分〜12時
間程度とすればよい。
上記酵素反応において、酵素量、反応温度、反応時間
等を適宜選択することにより、GM1及びGD1bを夫々単独
で若しくは混合物として得ることができる。
等を適宜選択することにより、GM1及びGD1bを夫々単独
で若しくは混合物として得ることができる。
反応液からGM1及びGD1bを精製するに当っては公知の
精製方法が採用できる。例えば、GM1又はGD1bを単独で
得た場合には、溶媒抽出した後、凍結乾燥等により精製
できる。また混合物として得た場合には、イオン交換樹
脂カラムなどを用いてGM1とGD1bとを分離し、次いで、
濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行うことにより精製できる。
精製方法が採用できる。例えば、GM1又はGD1bを単独で
得た場合には、溶媒抽出した後、凍結乾燥等により精製
できる。また混合物として得た場合には、イオン交換樹
脂カラムなどを用いてGM1とGD1bとを分離し、次いで、
濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行うことにより精製できる。
発明の効果 本発明に従い、本発明アイソザイムＳをガングリオシ
ド類に作用させる時には、従来合成又は精製が非常に困
難とされているガングリオシド類の中、ガングリオシド
GM1及び／又はガングリオシドGD1bを高純度で収率良く
且つ選択的に得ることができる。しかも副生物が生成し
ないので、得られるガングリオシドGM1及び／又はガン
グリオシドGD1bを容易に精製できる。また、本酵素を用
いる場合には、従来使用されていた界面活性剤を使用す
る必要がない。
ド類に作用させる時には、従来合成又は精製が非常に困
難とされているガングリオシド類の中、ガングリオシド
GM1及び／又はガングリオシドGD1bを高純度で収率良く
且つ選択的に得ることができる。しかも副生物が生成し
ないので、得られるガングリオシドGM1及び／又はガン
グリオシドGD1bを容易に精製できる。また、本酵素を用
いる場合には、従来使用されていた界面活性剤を使用す
る必要がない。
実 施 例 以下に参考例及び実施例を挙げ、本発明をより一層明
瞭なものとする。
瞭なものとする。
参考例１ ラクトース5.0g、リン酸第２アンモニウム2.0g、塩化
ナトリウム3.0g、リン酸第２カリウム1.0g、硫酸マグネ
シウム0.1g及び脱塩水1000mlを含む培地（pHを7.0に調
整）を、２容坂口フラスコにいれ、オートクレーブで
加熱滅菌した。
ナトリウム3.0g、リン酸第２カリウム1.0g、硫酸マグネ
シウム0.1g及び脱塩水1000mlを含む培地（pHを7.0に調
整）を、２容坂口フラスコにいれ、オートクレーブで
加熱滅菌した。
これに、アースロバクター・ウレアファシエンスM105
7株を接種し、28℃で24時間振盪培養を行ない、得られ
た培養液を遠心分離（10000rpm、10分）して培養上清を
得た。
7株を接種し、28℃で24時間振盪培養を行ない、得られ
た培養液を遠心分離（10000rpm、10分）して培養上清を
得た。
得られた培養上清に硫安を加え、硫安80％飽和で沈殿
する部分を採取し、これを少量の水に溶かし、10mM酢酸
緩衝液（pH4.5）で透析した。透析液を、可溶性デンプ
ンとコロミン酸を含む2N水酸化ナトリウム溶液にエピク
ロルヒドリンを加えて調製した、コロミン酸をリガンド
とするゲルを充填したカラムに痛塔してノイラミニダー
ゼを吸着させ、100mM酢酸緩衝液（pH4.5）で溶出した。
する部分を採取し、これを少量の水に溶かし、10mM酢酸
緩衝液（pH4.5）で透析した。透析液を、可溶性デンプ
ンとコロミン酸を含む2N水酸化ナトリウム溶液にエピク
ロルヒドリンを加えて調製した、コロミン酸をリガンド
とするゲルを充填したカラムに痛塔してノイラミニダー
ゼを吸着させ、100mM酢酸緩衝液（pH4.5）で溶出した。
次いで、ノイラミニダーゼ活性区分を硫安塩析し、脱
塩水で透析し、透析液をクロマトフォーカシングにより
３成分に分離した。クラマトフォーカシングは、透析液
を、25mMイミダゾール−HCl（pH7.4）で平衡化したポリ
バァッファー交換体充電カラムに通塔し、pH3.8に調整
したポリブァッファー74〔ファルマシア社製〕で溶出し
て行なった。
塩水で透析し、透析液をクロマトフォーカシングにより
３成分に分離した。クラマトフォーカシングは、透析液
を、25mMイミダゾール−HCl（pH7.4）で平衡化したポリ
バァッファー交換体充電カラムに通塔し、pH3.8に調整
したポリブァッファー74〔ファルマシア社製〕で溶出し
て行なった。
得られた３成分を個々に硫安塩析し、100mMリン酸緩
衝液（pH7.0）に溶解し、Ultrogel AcA44〔I.B.F.バイ
オテクニクス社製〕を用いてゲル過し、４成分を得
た。その中の１成分から、アイソザイムＳの650単位を
得た。
衝液（pH7.0）に溶解し、Ultrogel AcA44〔I.B.F.バイ
オテクニクス社製〕を用いてゲル過し、４成分を得
た。その中の１成分から、アイソザイムＳの650単位を
得た。
アイソザイムＳの酵素活性は、チオバルビツール酸法
に従い、以下のようにして行なった。
に従い、以下のようにして行なった。
即ち、酵素液0.1ml、0.4％Ｎ−アセチルノイラミンラ
クトース溶液0.05ml及び0.2M酢酸緩衝液（pH5.0）0.05m
lを、37℃で10分間反応させ、遊離したＮ−アセチルノ
イラミン酸をチオバルビツール酸法で定量した。アイソ
ザイムＳの１単位は、37℃で１分間に１マイクロモルの
Ｎ−アセチルノイラミン酸を生成する酵素量とした。
クトース溶液0.05ml及び0.2M酢酸緩衝液（pH5.0）0.05m
lを、37℃で10分間反応させ、遊離したＮ−アセチルノ
イラミン酸をチオバルビツール酸法で定量した。アイソ
ザイムＳの１単位は、37℃で１分間に１マイクロモルの
Ｎ−アセチルノイラミン酸を生成する酵素量とした。
実施例１ 0.4％ガングリオシドGT1b溶液1ml、40mM酢酸緩衝液
（pH4.0）1ml、アイソザイムＳ溶液1ml（0.3U/ml）及び
蒸留水1mlを、37℃で１時間反応させた後、反応液にク
ロロホルムを1/10容添加し、酵素反応を停止した。反応
液より、クロロホルム：メタノール（2:1）を用いて生
成したGD1bを抽出した後、凍結乾燥し、GD1b3.2mgを白
色粉末として得た。
（pH4.0）1ml、アイソザイムＳ溶液1ml（0.3U/ml）及び
蒸留水1mlを、37℃で１時間反応させた後、反応液にク
ロロホルムを1/10容添加し、酵素反応を停止した。反応
液より、クロロホルム：メタノール（2:1）を用いて生
成したGD1bを抽出した後、凍結乾燥し、GD1b3.2mgを白
色粉末として得た。
尚、GD1bの生成は、薄層クロマトグラフィーにより検
出及び確認した。
出及び確認した。
実施例２ ガングリオシド類として、牛脳抽出ガングリオシド混
合液1ml（ガングリオシド類10mgを含む）を使用する以
外は、実施例１と同様にして37℃で３時間反応を行なっ
た。生成したGD1bとGM1をイオン交換クロマトグラフィ
ー〔ファルマシア社製〕による分画及び分取し、夫々減
圧濃縮、脱塩処理及び凍結処理を施し、GD1b約2.8mg及
びGM1約4.7mgを白色粉末として得た。
合液1ml（ガングリオシド類10mgを含む）を使用する以
外は、実施例１と同様にして37℃で３時間反応を行なっ
た。生成したGD1bとGM1をイオン交換クロマトグラフィ
ー〔ファルマシア社製〕による分画及び分取し、夫々減
圧濃縮、脱塩処理及び凍結処理を施し、GD1b約2.8mg及
びGM1約4.7mgを白色粉末として得た。
実施例３ 0.2％ガングリオシドGD1b溶液1ml、40mM酢酸緩衝液
（pH4.0）1ml、アイソザイムＳ溶液1ml（3U/ml）及び殺
菌水1mlを、37℃で５時間反応させた後、反応液にクロ
ロホルムを1/10容添加し、酵素反応を停止した。反応液
より、クロロホルム：メタノール（2:1）を用いて生成
したGM1を抽出した後、凍結乾燥し、GM1約1.5mgを白色
粉末として得た。
（pH4.0）1ml、アイソザイムＳ溶液1ml（3U/ml）及び殺
菌水1mlを、37℃で５時間反応させた後、反応液にクロ
ロホルムを1/10容添加し、酵素反応を停止した。反応液
より、クロロホルム：メタノール（2:1）を用いて生成
したGM1を抽出した後、凍結乾燥し、GM1約1.5mgを白色
粉末として得た。
実施例４ ガングリオシド類としては、牛脳抽出ガングリオシド
混合液1ml（ガングリオシド類10mgを含む）を使用する
以外は、実施例３と同様にして反応を行なった。生成し
たGM1を実施例３と同様にして精製し、GM1約6.2mgを白
色粉末として得た。
混合液1ml（ガングリオシド類10mgを含む）を使用する
以外は、実施例３と同様にして反応を行なった。生成し
たGM1を実施例３と同様にして精製し、GM1約6.2mgを白
色粉末として得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:06）
Claims (2)
- 【請求項１】下記の理化学的性状を有するノイラミニダ
ーゼ・アイソザイムＳ 作用：ガングリオシド類から選択的にガングリオシドG
D1b及び／又はガングリオシドGM1を生成する。 分子量：約52000ダルトン（ゲル過クロマトグラフィ
ー及びSDS−PAGE電気泳動法による） 至適pH:3.8〜4.4（牛脳ガングリオシド類を基質とした
場合） 熱安定性:60℃以下 - 【請求項２】ガングリオシド類に、請求項のノイラミ
ニダーゼ・アイソザイムＳを作用させて、ガングリオシ
ドGD1b及び／又はガングリオシドGM1を選択的に得るこ
とを特徴とするガングリオシド類の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63109530A JP2724588B2 (ja) | 1988-05-02 | 1988-05-02 | ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法 |
| EP89911863A EP0451267B1 (en) | 1988-05-02 | 1989-10-30 | Process for preparing ganglioside gm1 |
| DE68923801T DE68923801T2 (de) | 1988-05-02 | 1989-10-30 | Verfahren zur herstellung von gangliosid gm1. |
| US07/679,087 US5296360A (en) | 1988-05-02 | 1989-10-30 | Process for producing ganglioside GM1 |
| PCT/JP1989/001118 WO1991006663A1 (en) | 1988-05-02 | 1989-10-30 | Process for preparing ganglioside g¿m1? |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63109530A JP2724588B2 (ja) | 1988-05-02 | 1988-05-02 | ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法 |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH01281082A JPH01281082A (ja) | 1989-11-13 |
| JP2724588B2 true JP2724588B2 (ja) | 1998-03-09 |
Family
ID=14512592
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63109530A Expired - Lifetime JP2724588B2 (ja) | 1988-05-02 | 1988-05-02 | ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5296360A (ja) |
| EP (1) | EP0451267B1 (ja) |
| JP (1) | JP2724588B2 (ja) |
| DE (1) | DE68923801T2 (ja) |
| WO (1) | WO1991006663A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE69122105T2 (de) * | 1991-11-05 | 1997-02-06 | Technochemical Corp S A | Verfahren zur Erlangen von Monosialogangliosiden |
| US5532141A (en) * | 1995-06-13 | 1996-07-02 | Holler; Larry D. | Process for obtaining ganglioside lipids |
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| US7943750B2 (en) | 2007-06-18 | 2011-05-17 | Laboratoire Medidom S.A. | Process for obtaining pure monosialoganglioside GM1 for medical use |
| RU2567661C2 (ru) | 2009-09-01 | 2015-11-10 | Лз Терапьютикс, Инк. | Способы выделения и очистки ганглиозидов |
| KR102039204B1 (ko) | 2012-01-20 | 2019-10-31 | 가넷 바이오쎄라퓨틱스 인크. | 강글리오시드 생산의 방법 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4071408A (en) * | 1976-11-01 | 1978-01-31 | Research Corporation | Neuraminidase |
| JPH07114695B2 (ja) * | 1986-06-16 | 1995-12-13 | 丸金醤油株式会社 | ノイラミニダ−ゼの製造法 |
-
1988
- 1988-05-02 JP JP63109530A patent/JP2724588B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-10-30 US US07/679,087 patent/US5296360A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-30 EP EP89911863A patent/EP0451267B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-30 WO PCT/JP1989/001118 patent/WO1991006663A1/ja active IP Right Grant
- 1989-10-30 DE DE68923801T patent/DE68923801T2/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６ Ｐ．１５７３−１５８５（１９７９） |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４（１６）Ｐ．７８４５−７８５４（１９７９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1991006663A1 (en) | 1991-05-16 |
| DE68923801D1 (de) | 1995-09-14 |
| JPH01281082A (ja) | 1989-11-13 |
| US5296360A (en) | 1994-03-22 |
| EP0451267A1 (en) | 1991-10-16 |
| EP0451267A4 (en) | 1993-04-28 |
| EP0451267B1 (en) | 1995-08-09 |
| DE68923801T2 (de) | 1995-12-07 |
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