RU2567661C2 - Способы выделения и очистки ганглиозидов - Google Patents
Способы выделения и очистки ганглиозидов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2567661C2 RU2567661C2 RU2012108200/10A RU2012108200A RU2567661C2 RU 2567661 C2 RU2567661 C2 RU 2567661C2 RU 2012108200/10 A RU2012108200/10 A RU 2012108200/10A RU 2012108200 A RU2012108200 A RU 2012108200A RU 2567661 C2 RU2567661 C2 RU 2567661C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- ganglioside
- tissue
- producing
- medium
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 title abstract description 21
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 14
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 109
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 56
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 21
- 201000008892 GM1 Gangliosidosis Diseases 0.000 claims description 18
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 18
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 claims description 16
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 claims description 16
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 16
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 16
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 14
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 8
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 7
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 7
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 7
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 7
- 201000008393 GM1 gangliosidosis type 1 Diseases 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 claims description 6
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000006163 transport media Substances 0.000 claims description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003198 cerebellar cortex Anatomy 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001159 caudate nucleus Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 3
- XBNDESPXQUOOBQ-LSMLZNGOSA-N (2r,3s)-4-[[(2s)-1-[[2-[[(2s)-1-[[2-[[(2r,3s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(1s)-1-[(3s,9ar)-1,4-dioxo-3,6,7,8,9,9a-hexahydro-2h-pyrido[1,2-a]pyrazin-3-yl]ethyl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-amino-1-oxobutan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]am Chemical compound CCC(C)CCCCC\C=C\CC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@H]([C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)[C@H]1C(=O)N2CCCC[C@@H]2C(=O)N1 XBNDESPXQUOOBQ-LSMLZNGOSA-N 0.000 claims description 2
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical group O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 108010079465 amphomycin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 101000652829 Neosartorya fumigata (strain ATCC MYA-4609 / Af293 / CBS 101355 / FGSC A1100) Exo-alpha-sialidase Proteins 0.000 claims 1
- 244000225942 Viola tricolor Species 0.000 claims 1
- 235000004031 Viola x wittrockiana Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 36
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 17
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 9
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 8
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 7
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 6
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 5
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 4
- 208000009796 Gangliosidoses Diseases 0.000 description 4
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 4
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 244000309464 bull Species 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 210000003811 finger Anatomy 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 201000006440 gangliosidosis Diseases 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 4
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 3
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 3
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006378 Catechol O-methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108020002739 Catechol O-methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 2
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 2
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 206010006100 Bradykinesia Diseases 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- -1 GDla Chemical class 0.000 description 1
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 1
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 1
- 102000007524 N-Acetylgalactosaminyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010046220 N-Acetylgalactosaminyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000012865 aseptic processing Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- WPIHMWBQRSAMDE-YCZTVTEBSA-N beta-D-galactosyl-(1->4)-beta-D-galactosyl-N-(pentacosanoyl)sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)[C@H](O)[C@H]1O)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC WPIHMWBQRSAMDE-YCZTVTEBSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- JRURYQJSLYLRLN-BJMVGYQFSA-N entacapone Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\C#N)=C\C1=CC(O)=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 JRURYQJSLYLRLN-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- 229960003337 entacapone Drugs 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000007472 neurodevelopment Effects 0.000 description 1
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000272 proprioceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003238 somatosensory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000003977 synaptic function Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003813 thumb Anatomy 0.000 description 1
- 229940043263 traditional drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1323—Adult fibroblasts
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Public Health (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Psychology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ выделения ганглиозида GM1 предусматривает получение тканей не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1; выделение из указанных тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1; экспансию указанных клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток; экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение указанного ганглиозида GM1 из указанной культуры, который может быть использован для лечения болезни Паркинсона и других неврологических заболеваний. Получение ганглиозида данным способом позволяет избежать возникновения прионных заболеваний при его дальнейшем использовании. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США 61/238775, поданной 1 сентября 2009 года, включенной в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Настоящая заявка является родственной заявке РСТ №_____, поданной 1 сентября 2010 года, на основании предварительных заявок на Патент США 61/238735, 61/238748 и 61/238726, каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] В настоящей заявке описаны способы выделения и очистки ганглиозидов, например моносиалоганглиозида (GM1).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Болезнь Паркинсона (БП) представляет собой медленно, но неуклонно прогрессирующее нейродегенеративное расстройство, приводящее к ухудшению с течением времени клинических симптомов. Клинические симптомы включают тремор, брадикинезию (замедление движения), ригидность мышц, нарушение осанки и равновесия, потерю автоматических движений и изменения речи. Несмотря на значительную изменчивость клинических симптомов у пациентов существующий арсенал препаратов против БП эффективно, хотя и временно, улучшает большинство основных признаков и симптомов болезни Паркинсона у большинства пациентов. Несмотря на временное облегчение симптомов благодаря традиционной лекарственной терапии, утрата функциональных способностей со временем усугубляется.
[0004] Появление терапии с использованием леводопы было связано с продлением выживаемости у пациентов с БП, хотя такая терапия не замедляет прогрессирование симптомов. Леводопа, метаболический предшественник дофамина (L-3,4-дигидроксифенилаланин), в настоящее время является единственным наиболее эффективным средством для лечения БП. Ингибиторы, вводимые совместно с леводопой для предотвращения катаболизации леводопы при пероральном введении, или ингибиторы катехол-O-метилтрансферазы (КОМТ), такие как толкапм (tolcapme) и энтакапон, таким образом, увеличивают период полужизни леводопы в плазме и процент леводопы, достигающей ЦНС. Остающаяся нерешенной проблема, связанная с терапией с использованием леводопы, заключается в том, что после длительного периода эффективности при лечении пациентов периоды эффективного ослабления симптомов с каждой дозой становятся все короче. Кроме того, с течением времени развивается дискинезия. Такие эффекты продолжительного применения леводопы являются результатом прогрессирующей дегенерации дофаминовой системы.
[0005] На сегодняшний день не выявлены лекарственные средства, которые бы окончательно замедляли или останавливали прогрессирование БП или существенно препятствовали неизбежному функциональному расстройству у пациентов, страдающих БП.
[0006] Существует острая потребность в лекарственных средствах, которые могли бы изменять клиническое течение, устранить двигательные или когнитивные нарушения, восстановить или улучшить функции оставшихся частей дофаминовой («ДА») системы или активировать компенсаторные механизмы. Ни для одного из агентов, изученных к настоящему времени, однако, не были получены убедительные доказательства его нейрозащитных свойств или влияния на ход болезни, и ни для одного из исследованных агентов не были доказаны его нейровосстанавливающие свойства.
[0007] Доклинические исследования in vitro и in vivo показали, что GM1 способен восстанавливать поврежденные ДА-нейроны, стимулировать выживаемость и восстановление дофаминэргических нейронов и прорастание функциональных дофаминэргических окончаний, повышать уровни ДА в полосатом теле и повышающе регулировать способность оставшихся нейронов синтезировать ДА. См., например, "GM1 Ganglioside in the Treatment of Parkinson's Disease," Schneider, Ann. N.Y.Acad. Sciences 845, 363-73 (Feb. 2006). Предварительные клинические исследования GM1 у пациентов с БП также показали клиническое улучшение у пациентов при краткосрочном применении GM1 и незначительное прогрессирование симптомов в подгруппе пациентов, в течение пяти лет применявших GM1, и последующее значительное прогрессирование симптомов после прекращения долгосрочного приема GM1.
[0008] Таким образом, потенциально плодотворный подход к лечению БП включает введение агентов, таких как GM1, которые могут стабилизировать поврежденные или умирающие ДА-нейроны, стимулировать прорастание новых дофаминергических волокон и окончаний, или усиливать действие оставшихся дофаминергических нейронов или стимулировать или поддерживать компенсаторные процессы.
[0009] GM1, являющийся моносиалоганглиозидом, представляет собой обычный компонент мембран нервных клеток и, как известно, модулирует ряд активностей поверхностей клеток и рецепторов, а также играет важную роль в нейрональной дифференцировке и развитии, фосфорилировании белков и в синаптической функции. В многочисленных доклинических исследованиях в результате длительной терапии с помощью GM1, направленной на различные типы поражений центральной нервной системы, происходило восстановление биохимических и поведенческих функций, и такое действие было особенно впечатляющим в поврежденной ДА системе.
[0010] До сих пор единственную применяемую в клинической практике форму GM1 получали из мозга быка. Ограниченное количество GM1, которое возможно получить из мозга, и расходы, связанные с технологией выделения GM1 из мозга, ограничивали разработку коммерческого продукта GM1. Кроме того, применение бычьего мозга в качестве источника GM1 вызывает обоснованные опасения относительно прионных заболеваний, таких как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота («коровье бешенство»).
[0011] Существует постоянная и неудовлетворенная потребность в создании новых и более совершенных способов выделения и очистки GM1, в частности способов с применением источников не бычьего происхождения.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] В настоящем изобретении предложены новые способы выделения и очистки ганглиозидов, например моносиалоганглиозида GM1, из источников не бычьего происхождения.
[0013] В настоящей заявке предложен способ выделения ганглиозида GM1 путем получения тканей не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1, включающий выделение из тканей клетки, продуцирующей ганглиозид GM1; экспансию клетки, продуцирующей GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток; экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение ганглиозида GM1 из культуры. Клетки, продуцирующие GM1, могут представлять собой нервные клетки. В другом аспекте клетки могут представлять собой клетки фибробластов. Упоминаемые в настоящей заявке клетки, продуцирующие GM1, представляют собой клетки, экспрессирующие GM1 либо на базальном уровне, либо на повышенном уровне, по сравнению с нормальными клетками.
[0014] В другом варианте реализации способ может включать выделение GM1 из нервных клеток, полученных из клеток фибробластов не от быка и не от свиньи, которые взяты у субъектов, страдающих GM1-ганглиозидозом I типа. Таким образом, GM1 не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (bovine spongiform encephalopathy, BSE).
[0015] В другом варианте реализации предложена композиция ганглиозида GM1, при этом композицию ганглиозида GM1 получают способом, описанным в настоящей заявке, включающим получение тканей, содержащих клетки, продуцирующие GM1, полученных не от быка и не от свиньи, выделение из указанных тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1, экспансию указанных клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток, экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение указанного ганглиозида GM1 из указанной культуры. Таким образом, GM1 по существу не содержит или не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE).
[0016] Дополнительные признаки будут понятны после прочтения нижеследующего подробного описания изобретения и Примеров.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0017] На Фигуре 1 представлена таблица, в которой приведены данные по экспансии клеток гиппокампа овцы в культуре с низким содержанием О2 в среде 1 типа, как описано в настоящей заявке.
[0018] На Фигуре 2 представлен линейный график кумулятивного удвоения популяции нервных клеток-предшественников гиппокампа.
[0019] На Фигуре 3 представлена таблица, в которой приведены данные по общему удвоению и выходу клеток гиппокампа в культуре с низким содержанием O2 в среде 1 типа, как описано в настоящей заявке.
[0020] На Фигуре 4 представлена таблица, в которой приведены данные по экспансии клеток фибробластов овцы в культуре с низким содержанием O2 в среде 1 типа, как описано в настоящей заявке.
[0021] На Фигуре 5 показан линейный график кумулятивного удвоения популяции клеток фибробластов овцы.
[0022] На Фигуре 6 представлена гистограмма, иллюстрирующая сравнение экспансии ткани легкого и эпидуральной соединительной ткани.
[0023] На Фигуре 7 представлена таблица, в которой приведено сравнение экспансии клеток фибробластов из ткани легкого и соединительной ткани.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0024] В настоящей заявке описаны новые способы очистки и выделения ганглиозида GM1 из клеток, полученных от овец, пораженных ганглиозидозом GM1, или клеток, полученных от людей, страдающих ганглиозидозом GM1, в качестве стабильных и возобновляемых источников GM1.
[0025] В настоящей заявке предложен способ выделения ганглиозида GM1 путем получения тканей не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1, который включает выделение из тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1; экспансию клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток; экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение ганглиозида GM1 из культуры. Клетки, продуцирующие GM1, могут представлять собой нервные клетки. В другом аспекте указанные клетки могут представлять собой клетки фибробластов. Упоминаемые в настоящей заявке клетки, продуцирующие GM1, представляют собой клетки, которые продуцируют GM1 в избытке либо на базовом уровне, либо на повышенном уровне, по сравнению с нормальными клетками. В частности, такие клетки могут быть получены от овец и/или людей, страдающих ганглиозидозом.
[0026] Ткани, из которых выделяют и получают клетки, включают полуовальный центр, кору мозжечка, гиппокамп, головку хвостатого ядра, лобную долю, теменную кору или стенки желудочков, субгранулярную зону или выстилку желудочков мозга. Способ по настоящему изобретению включает экспансию и культивирование любой комбинации клеток, полученных из указанных областей. Клетки, продуцирующие GM1, представляют собой клетки-фибробласты, полученные из эпидермальных тканей или ткани легкого, при этом клетки, продуцирующие GM1, включает клетки тканей ядра головного мозга или клетки-предшественники.
[0027] Другой аспект, описанный в настоящей заявке, включает способ получения тканей не бычьего и не свиного происхождения путем вырезания частей тканей;
помещения указанных тканей в транспортную среду, при этом такая среда может представлять собой модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, содержащую 4 мМ L-глутамин, 5-10%, 10-20% или 20-30% эмбриональной бычьей сыворотки, раствор неосновных аминокислот IX для среды MEM, пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин, амфомицин и гентамицин; и хранение тканей на холоде при температуре, достаточной для поддержания экспансии указанных клеток.
[0028] В одном из вариантов реализации изобретения нервные клетки получают из ткани головного мозга, характеризующейся сверхэкспрессией ганглиозида GM1, или получают из мозга, пораженного ганглиозидозом GM1. Нервные клетки могут характеризоваться недостатком β-галактозидазы, что приводит к сверхэкспрессии GM1, по сравнению с нормальными клетками. Нервные клетки, применяемые в указанном способе, могут иметь частичную активность а-нейраминидазы.
[0029] В другом варианте реализации способ может включать выделение GM1 из клеток фибробластов не бычьего и не свиного происхождения, полученных от людей, страдающих ганглиозидозом GM1 I типа. Таким образом, GM1 не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE). Термин примеси, способные вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), использованный в настоящей заявке, обозначает любую белковую биомолекулу, белок прион (PrP) или биомолекулу, которую можно обнаружить с помощью антител к белкам PrP. Как правило, коммерчески доступные источники GM1 получают от крупного рогатого скота, и они могут быть подвержены действию облучения для удаления возможных примесей, однако риск при терапевтическом применении такого источника сохраняется. Пример таких источников GM1 включает Sigma Aldrich.
[0030] В другом варианте реализации предложена композиция ганглиозида GM1, при этом указанную композицию ганглиозида GM1 получают способом, описанным в настоящей заявке, включающим получение тканей, не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1, выделение из указанных тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1, экспансию указанных клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток, экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение указанного ганглиозида GM1 из указанной культуры. Таким образом, ганглиозид GM1 не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE).
[0031] Настоящее изобретение предполагает применение клеток, полученных от овец, страдающих ганглиозидозом GM1, или клеток, полученных от людей, страдающих ганглиозидозом GM1, для получения коммерчески подходящего количества ганглиозида GM1 для применения для лечения болезни Паркинсона и других неврологических нарушений. Ганглиозиды можно вводить в отдельности или вместе со стандартными средствами медицинской помощи для пациентов, страдающих БП, или пациентов с другими типами нейродегенеративных заболеваний, включающих, но не ограничивающихся перечисленным, болезнь Гентингтона и т.п.
[0032] GM1 в отдельности или в комбинации с другими ганглиозидами можно вводить путем подкожной или внутривенной инъекции или с помощью назального или мукозального введения наряду с прочим. Также могут быть предусмотрены лекарственные формы пролонгированного действия, и ганглиозиды можно вводить с помощью составов с контролируемым высвобождением (липосомы, наночастицы, микросферы) для продления действия лекарственного средства. Они также могут быть конъюгированы с соответствующими транспортирующими молекулами для преодоления гематоэнцефалического барьера.
[0033] Овцы, страдающие ганглиозидозом GM1, а также процесс экстракции GM1 и других ганглиозидов из мозга таких животных описаны в патенте США №5532141, который включен в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Заболевание таких животных характеризуется дефицитом β-галактозидазной активности и частичной активностью а-нейраминидазы, в результате чего у животных в ткани головного мозга накапливается большое количество ганглиозида GM1 (до 40 раз больше, по сравнению со здоровыми животными). С учетом оптимизированного способа выделения, по оценкам, из мозга одной овцы, страдающей ганглиозидозом, можно получить 1-2 грамма GM1. Кроме того, по оценкам из 1 кг мозга пораженных ганглиозидозом животных можно получить примерно 15 г GM1. Для сравнения, из 1 кг мозга свиньи, по оценкам, можно получить 250 мг GM1. Однако даже при таком повышенном уровне экспрессии в год понадобится несколько сотен тысяч овец для получения GM1 в коммерческих количествах.
[0034] С применением клеточных технологий GM1 можно получить из нескольких потенциальных источников, полученных от овец с ганглиозидозом GM1. Например, можно осуществить выращивание и экспансию предшественников нервных клеток, довести их до нейронального фенотипа, оптимизировать их рост и развитие (и, возможно, даже продукцию GM1 с помощью различных манипуляций, включающих, но не ограничивающихся перечисленными, ингибирование продукции ганглиозидов В-серии (например, путем ингибирования GD3-синтазы) и остановку пути биосинтеза ганглиозидов А-серии на GM1, в результате чего экспрессия ганглиозидов будет сдвинута преимущественно в сторону GM1), а затем можно выделить GM1 из культивируемых нервных клеток, в дополнение к GM1, выделенному клетками в культуральную среду. Дополнительные варианты могут быть направлены на усиление выделения ганглиозидов клетками и дальнейшую оптимизацию отбора ганглиозидов из культивируемых клеток. В качестве альтернативы или в сочетании с общей схемой, описанной выше, в культуре можно выращивать фибробласты или гепатоциты и применять их в качестве источников GM1.
[0035] Клетки, применяемые в настоящем способе, могут быть получены из тканей головного мозга, включающих, но не ограничивающихся указанными, полуовальный центр, кору мозжечка, гиппокамп, хвостатое ядро, кору головного мозга, стенки желудочков или их комбинации.
[0036] Другим потенциальным источником GM1 являются фибробласты (или гепатоциты) пациентов, страдающих ганглиозидозом GM1 I типа (детским). У пациентов, страдающих ганглиозидозом GM1 I типа, как правило, количество β-галактозидазы в клетках составляет менее 1% от нормы, и, следовательно, их клетки продуцируют на высоком уровне ганглиозид GM1. Нормальные человеческие фибробласты могут содержать примерно 0,7 нмоль GM1 на мг белка. Фибробласты страдающих ганглиозидозом GM1 могут содержать до 2,58 нмоль GM1 на мг белка. Количество GM1, полученное из культивируемых фибробластов человека, страдающего ганглиозидозом GM1, может быть оптимизировано с помощью оптимальных параметров для роста клеток, условий культивирования и питательных веществ, а также определения оптимального времени для сбора клеток для экстракции GM1. Кроме того, можно осуществить скрининг многочисленных образцов от доноров-пациентов, страдающих ганглиозидозом GM1 I типа, для поиска клеточных линий с оптимальным накоплением GM1 в связи с недостатком β-галактозидазы в различной степени, которая будет отличаться от пациента к пациенту. Кроме того, можно также применять гепатоциты указанного пациента в качестве альтернативного или дополнительного клеточного источника клеток GM1.
[0037] После получения клеток от страдающих ганглиозидозом овец существует несколько возможных путей для дальнейшего увеличения выхода GM1 из таких клеток. Один из способов заключается в обработке клеток низкой концентрацией хлорохина, слабого основания, что приводит к заметному накоплению GM1 в эндосомах и на поверхности клеток (Yuyama et al., 2006). Другим способом является обработка клеток сиалидазой (нейраминидазой), которая преобразует все основные сложные ганглиозиды мозга (например, GDla, GDlb и GTlb) в GM1 в интактных клетках (Schauer, et al., 1980). Другой способ заключается в применении неферментативного способа с применением Dowex-50W-H + для катализа высокоселективной избирательной десиализации полисиалированных ганглиозидов ряда ганглио-N-тетраозы с преимущественным образованием GM1 (Schengrund and Kovac, 1999). С помощью таких способов можно увеличить количество GM1, получаемого из клеток и мембран, а также увеличить количество GM1, выделяемого в среду и восстановленного из среды.
[0038] Дополнительные возможные средства для продуцирования ганглиозида GM1 с помощью клеточных технологий могут включать программирование свойств клеток с помощью мультиплексных генно-инженерных подходов и ускоренной эволюции для стимулирования выработки ганглиозида GM1 у Е.coli. С использованием мультиплексного автоматизированного инжиниринга генома (multiplex automated genome engineering «MAGE») можно спроектировать путь биосинтеза GM1 в E.coli для сверхпродуцирования ганглиозида GM1. Например, можно одновременно вносить изменения в различные участки генома для модификации биосинтеза GM1, при этом экспрессия некоторых соответствующих генов будет отрегулирована оптимальным образом, а экспрессия некоторых других генов будет подавлена или исключена с целью оптимизации продуцирования GM1 и подавления продуцирования других ганглиозидов. Е.coli может быть модифицирована с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, при этом гены, ответственные за синтез ганглиозида, встроены в геном E.coli с помощью стандартных способов, известных в данной области техники. К примеру, стандартные способы включают выделение плазмидной ДНК, модифицированной таким образом, что она обуславливает экспрессию GM1-синтазы, для продуцирования GM1 в культуре. Другие гены, продуцирующие ганглиозиды, включают GD3-синтазу.
[0039] Клетки Е.coli можно выращивать при определенных условиях, при которых вещества-предшественники доступны в среде при необходимости, такие как синтетический лактозилцерамид (LacCer, растительный источник) и сиаловая кислота (доступна из источников неживотного происхождения или может иметь синтетическую природу). Ферментативная активность (например, сиалилтрансфераза, N-ацетил-галактозаминилтрансфераза, галактозилтрансфераза) также может регулироваться с помощью способа MAGE, при этом могут быть предусмотрены активаторы (гуанозинтрифосфат для активации трансферазы фермента), а также N-ацетилгалактозамин и галактозы (сахара, которые преобразуются в их соответствующие нуклеотидные производные, служащие в качестве доноров сахара).
[0040] В настоящее время GM1 выделяют из мозга быка или свиньи, что представляет собой низкопродуктивный и дорогостоящий способ. Настоящее изобретение позволяет обеспечить безопасное и эффективное продуцирование ганглиозида GM1 в клеточной системе. Изобретение также предусматривает первый коммерческий источник ганглиозида GM1 человека. Другие виды ганглиозидов, помимо GM1, также можно получать с помощью данной технологии, и GM1 и другие ганглиозиды можно применять для лечения широкого спектра неврологических нарушений, таких как болезнь Паркинсона.
[0041] Описан типичный способ выделения, отделения и очистки ганглиозидов мозга, который включает: исчерпывающее экстрагирование тканей мозга с помощью буфера с тетрагидрофураном или другими растворителями, которые известны в данной области техники; разделение экстракта сначала с помощью этилового эфира, а затем с дистиллированной водой, диализ полученной водной фазы, и хроматографии диализованного раствора на колонке с силикагелем. Остаток после исчерпывающего экстрагирования содержит все гликопротеины мозга. Последующие процедуры включают экстракцию хлороформом.
ПРИМЕРЫ
[0042] Пример 1
[0043] Получали ткани мозга овцы, включающие следующие источники тканей: полуовальный центр, кору мозжечка, гиппокамп, хвостатое ядро, кору головного мозга, (например, лобную, теменную) и стенки желудочков.
[0044] Каждую ткань обрабатывали в отдельности следующим способом: промывали каждый тип ткани буферным раствором PIPES; каждую ткань расщепляли с помощью смеси ферментов папаин/ДНКаза I/диспаза (нейтральная протеаза) с использованием антибиотиков/антимикотиков, нейтрализовали ферменты и пропускали диссоциированные клетки через клеточный фильтр; клетки центрифугировали и ресуспендировали в среде DMEM/F12/N2, содержащей 5% ФБС с антибиотиками/антимикотиками; клетки подсчитывали, после чего их высевали в колбы, покрытые фибронектином: а. на среду 1 типа: DMEM/F12/N2, содержащую 5% ФБС, содержащую антибиотики/антимикотики, с добавленим 10 нг/мл bFGF (основного фактора роста фибробластов) и 20 нг/мл EGF (эпидермального фактора роста). Среда Neurocult Proliferation-A; клетки на среде каждого типа выращивали при 37°С в камере с повышенной влажностью при низком содержании O2 и при высоком содержании О2 для сравнения.
| Экспансия клеток, полученных из тканей мозга овцы. Сводная таблица | ||
| Культуры при низком содержании О2 - среда 1 типа | ||
| Общее число удвоений / Последний пассаж (Р)№ | ||
| полуовальный центр | 16.1/Р.2 | 2 |
| копа головного мозга | 13.8/Р.2 | 2 |
| гиппокамп | 21.1/Р.3 | 3 |
| головка хвостатого ядра | 8.9/Р.1 | |
| лобная - теменная копа | 2.1 /P.1 | |
| стенка желудочка | 6.8/P.l | |
| Культуры при высоком содержании O2 - среда 1 типа | ||
| Общее число удвоений/ Последний пассаж (Р)№ | ||
| полуовальный центр | Р.0 | |
| копа головного мозга | Р.0 | |
| гиппокамп | Р.0 | |
| головка хвостатого ядра | Р.0 | |
| лобная - теменная кора | Р.0 | |
| стенка желудочка | Р.0 | |
| ТАБЛИЦА 1 | ||
[0045] В Таблице 1, представленной выше, описана пролиферация и экспансия клеток при различных условиях роста. Следует отметить, что культуры, выращенные в среде Neurocult Proliferation-A, характеризовались не очень хорошим ростом, таким образом, небольшое количество клеток, собранных при пассаже Р.О, замораживали, и прекращали их культивирование.
[0046] Пример 2
[0047] Ткани овечьего происхождения для выделения фибробластов, включали следующие источники: легкие (левое и правое легкие вместе) и эпидуральную соединительную ткань. Каждую из тканей обрабатывали в отдельности следующим способом: промывали каждый тип ткани буферным раствором PIPES; каждую ткань расщепляли с помощью коллагеназы/гиалуронидазы в среде DMEM с антибиотиками/антимикотиками, нейтрализовали ферменты в среде DMEM, содержащей 10% ФБС, и пропускали диссоциированные клетки через клеточный фильтр; клетки центрифугировали и ресуспендировали в FGM-2, содержащем антибиотики/антимикотики. Клетки подсчитывали и затем высевали в колбы, а оставшиеся ткани - на чашки со средой FGM-2. Клетки выращивали при 37°С во влажной камере только при низком содержании O2.
| Сводная таблица экспансии овечьих фибробластов | |
| Общее число удвоений / Число пассажей (Р)# | |
| Легкие | 20/Р.2 |
| Эпидуральная соединительная ткань | 7,2/P.1 |
| Таблица 1.0 | |
[0048] Пример 3
[0049] Ферментативное расщепление. Образцы получали в различных центрифужных пробирках, пронумерованных 1-10, вынимали из коробки для транспортировки, протирали и помещали в штатив для пробирок 50 мл. Делали снимок каждой пробирки. Каждую пробирку опрыскивали этанолом, протирали еще раз и затем переносили в бокс с биозащитой для асептической обработки. Транспортную среду из каждой пробирки тщательно аспирировали с помощью чистой пипетки на 10 мл и сбрасывали в контейнер для отходов. В каждую пробирку наливали с избытком раствор PIPES (40 мл), крышки заменяли и пробирки аккуратно переворачивали горлом вниз и обратно несколько раз, чтобы смыть остатки транспортной среды в тканях. Затем среду отбирали с помощью пипетки на 10 мл и сбрасывали в контейнер для отходов.
[0050] В пробирки, содержащие ткани мозга, добавляли по двадцать миллилитров среды для ферментативного расщепления тканей мозга и каждую пробирку помечали номером от 1 до 6. Такая введенная нумерация в дальнейшем позволяла соотнести каждый номер с конкретной тканью мозга. Двадцать мл раствора коллагеназы/гиалуронидазы (IX) добавляли в каждую пробирку, содержащую ткани органов. С помощью стерильных пипеток на 25 мл и 50 мл, стерильных щипцов и скальпеля ткани из каждой пробирки переносили в стерильную чашку диаметром 10 см, погружали в среду для ферментативного расщепления и измельчали на небольшие кусочки. Содержимое каждой чашки (кусочки ткани и среду для ферментативного расщепления) отбирали пипеткой на 25 мл или 50 мл и возвращали в соответствующие пробирки, закрывали их крышкой и все помещали в инкубатор при 37°С на 45 минут. Через 45 минут пробирки с сохранением стерильности переносили обратно в ламинарный бокс и содержимое каждой из пробирок измельчали с помощью стерильных пипеток на 25 мл и 10 мл соответственно. Крышки заменяли и пробирки помещали обратно в штатив и помещали в инкубатор при 37° на 15 минут. После инкубации пробирки с сохранением стерильности переносили в бокс. В каждую из 10 пробирок добавляли двадцать пять миллилитров среды для нейтрализации, пробирки закрывали крышками и каждую из них переворачивали несколько раз для перемешивания. Пробирки центрифугировали в течение 10 минут при 200 g для осаждения клеток оставшихся кусочков ткани. Пробирки переносили с сохранением стерильности в бокс, аккуратно отбирали супернатант из каждой пробирки, удостоверившись, что не происходило засасывание любых кусочков тканей или клеток. К пробиркам, содержащим участки головного мозга 1-6, добавляли 40 мл среды 1 типа, ресуспендировали в ней клетки и оставшиеся куски тканей. Содержащиеся в пробирках ткани легких, эпидуральную соединительную ткань и костную соединительную ткань ресуспендировали в 40 мл среды для роста фибробластов FGM-2. Каждую из 10 пробирок с ресуспендированными клетками и тканями пропускали через клеточный фильтр 40 мкм в новые маркированные пробирки 50 мл. Для каждой пробирки определяли число и жизнеспособность клеток.
[0051] Условия культивирования при низком содержании O2. Клетки из шести различных областей мозга высевали при плотности 100000/см2 в шесть покрытых фибронектином колб Т80 в 15 мл среды 1 типа или 15 мл среды 2 типа (среда Neurocult Proliferation-A) и инкубировали во влажной камере 37°С при пониженном давлении кислорода (4% О2, 5% CO2, сбалансированным азотом). Каждые два дня 50% питательной среды заменяли свежей средой. Культура была неоднородной. Колониеобразующие клетки вначале составляли меньшинство, но через несколько дней клетки стали формировать колонии и расти. Культуры пассажа 0 собирали на 9 день. Количество клеток на выходе см. в Таблице 1.0.
[0052] Клетки пассажа 1 высевали при плотности 100 клеток/см2 в две колбы Т225 см2, покрытые фибронектином в 36 мл среды 1 типа и среды 2 типа для каждой из шести областей. Культуру подпитывали 100% свежей средой на 5-й день. В ходе этого пассажа культура была все еще неоднородной, но значительно более выровненной, и в ней было представлено больше колониеобразующих клеток, и клетки росли быстрее, чем в ходе предыдущего пассажа. На 6 день делали снимки культуры при 4х, 100х, 200х увеличении. Культуры собирали на 6 день.
[0053] Клетки 2 пассажа высевали при плотности 100 клеток/см2 в две колбы Т225 см2, покрытые фибронектином, в 36 мл среды 1 типа и среды 2 типа для каждой из шести областей. Культуру подпитывали 100% свежей средой на 5-й день. Однородность культур составляла более 90%. Культуры собирали на 6 день. Все культуры, поддерживаемые в среде 2 типа, останавливались в росте и переставали делиться. Культуры, поддерживаемые в среде 1 типа (т.е., гиппокампальные клетки-предшественники) в дальнейшем субкультивировали до шестого пассажа (см. ниже).
[0054] Клетки 3 пассажа высевали при плотности 100 клеток/см2 в две колбы Т225 см2, покрытые фибронектином в 36 мл среды 1 типа. Культуру подпитывали 100% свежей средой на 5-й день. В этом пассаже культура оказалась однородной. На 6 день делали снимки культуры при 4х, 100х, 200х увеличении. Культуры собирали на 6 день.
[0055] Клетки 4 пассажа высевали при плотности 100 клеток/см2 в две колбы Т225 см2, покрытые фибронектином в 36 мл среды 1 типа. Культуру подпитывали 100% свежей средой FGM-2 на 5-й день. На 6 день делали снимики культуры при 4х, 100х, 200х увеличении. Культуры собирали на 6 день.
[0056] Фибробласты. После ферментативного переваривания клетки легких овцы рассевали при плотности 100000/см2, и клетки эпидуральной соединительной ткани рассевали при плотности 50000 /см2 в среду FGM-2. Культуру подпитывали 50% свежей средой FGM-2 каждые 2 дня и пассаж 0 собирали на 5-й день. Обе культуры пересевали при низкой плотности, а остатки замораживали и консервировали.
[0057] Фибробласты эпидуральной ткани и легких 1 пассажа рассевали при плотности 100/см2 в среду FGM-2 в колбы Т225 см2. Культуру подпитывали 100% свежей средой FGM-2 на 5-й день и собирали на 7 день. Культуры клеток легких пересевали, а остатки замораживали и консервировали. Эпидуральные фибробласты замораживали и консервировали.
[0058] Фибробласты легких 2 пассажа рассевали при плотности 100/см2 в колбы Т225 см2 со средой FGM-2. Культуру подпитывали 100% свежей средой FGM-2 на 4-й день, поскольку она была плотной, затем собирали на 5-й день. Культуры пересевали, а остатки замораживали и консервировали.
[0059] Фибробласты легких 3 пассажа рассевали при плотности 100/см2 в колбы Т225 см2 co средой FGM-2. Культуру подпитывали 100% свежей средой FGM-2 на 5-й день, и собирали культуры на 6 день. Культуры пересевали, а остатки замораживали и консервировали.
[0060] Условия с высоким содержанием О2 (стандартный способ). Клетки из каждой из шести областей рассевали в четыре Т25 см2 и одну Т80 см2 колбы (все были покрыты фибронектином) при плотности 100000/см2 в 5 мл и 13 мл соответственно, среды 1 типа и среды 2 типа, и инкубировали во влажной камере при 37°С при 18% O2 и 5% CO2 (стандартные условия). Культуру подпитывали соответствующей средой на 5-й день, затем собирали культуры через 24 часа на 6 день. На 6 день делали снимки культуры при 4х, 100х, 200х увеличении на перед их отбором. Клетки из всех областей подсчитывали, затем замораживали и консервировали.
[0061] Транспортная среда. Среда, применяемая для хранения тканей после вскрытия и во время транспортировки. Компоненты: DMEM с высоким содержанием глюкозы (Invitrogen), 4 мм L-глютамин (Hyclone), 20% эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone); раствор неосновных кислот MEM, IX (Invitrogen, каталожный №11140, 100Х р-р, лот №672555); пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (Stem Cell Technologies, Inc, каталожный №, 100Х раствор, лот №); гентамицин (50 мкг/мл).
[0062] Среда для ферментативного расщепления
[0063] Мозг: DMEM:F12 в отношении 1:1 с высоким содержанием глюкозы: 4 мм L-глютамин, диспаза (1 ед./мл) (Roche, каталожный №04942086001); ДНКаза (250 ед./мл) (Invitrogen, каталожный №18047-019), папаин (2,5 ед./мл) (Sigma, каталожный №76218), пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (Stem Cell Technologies, Inc. каталожный №, 100Х раствор, лот №); гентамицин (50 мкг/мл).
[0064] Легкие, эпидуральная ткань и кости: среда DMEM с высоким содержанием глюкозы: 4 мм L-глютамин, коллагеназа (300 ед./мл)/гиалуронидаза (100 ед./мл) (Stem Cell Technologies); гиалуронидаза (Stem Cell Technologies), пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (Stem Cell Technologies, Inc.), гентамицин (50 мкг/мл).
[0065] 4. Среда для культивирования тканей мозга:
[0066] а). Среда 1 типа. 1:1 DMEM:F12 с высоким содержанием глюкозы; 4 мм L-глютамин, жидкая добавка N2 Supplement (100Х) (Invitrogen), пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (технологии стволовых клеток, Inc.), гентамицин (50 мкг/мл), 20 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (rh EGF) (Stem Cell Technologies), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (rh bFGF) (Stem Cell Technologies).
[0067] b). Среда 2 типа: Среда для пролиферации Newocult NS-A Proliferation Media. Основная среда Newocult NS-A (человека), 450 мл (Stem Cell Technologies); добавки для среды Neurocult NS-A (человека), 50 мл (Stem Cell Technologies), пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (мкг/мл), Ampho (/мл) (Stem Cell Technologies, Inc), гентамицин (50 мкг/мл), 20 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (rh EGF) (Stem Cell Technologies), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (rh bFGF) (Stem Cell Technologies).
[0068] Пример 4
[0069] В клинических испытаниях лечения пациентов с болезнью Паркинсона с помощью GM1 все функциональные оценки (на начальном уровне и при всех последующих посещениях) проводили утром перед первым приемом лекарственного средства для лечения болезни Паркинсона и через не менее чем 12 часов после приема предыдущей дозы препарата (этот период на практике обозначается как «off» - период) Все пациенты были исследованы в ходе трех отдельных осмотров (в пределах двух недель) на начальное проявление следующих функциональных характеристик: (1) оценка по Унифицированной шкале оценки симптомов болезни Паркинсона ("Unified Parkinson's Disease Rating Scale, UPDRS"), независимо главным и вторым экспертами (2) время выполнения: 20 пронации/супинации кисти, 20 касаний пятка-носок, 20 касаний большой-указательный палец, время, за которое большой палец касается остальных пальцев 10 раз, время, за которое пациент проходит 20 метров с максимальной скоростью, разворачивается и возвращается в исходную точку, простые оценки времени реакции (3) проверка сенсомоторной интеграции, в ходе которой пациенту необходимо выполнить конкретные движения, основанные только на соматосенсорной и проприоцептивной обратной связи. Исследование проводили в ходе регулярных посещений в течение четырех месяцев.
[0070] Определяли средний балл, характеризующий начальное состояние каждого пациента, и сравнивали с ним балльные оценки при лечении. Основным показателем эффективности было изменение двигательного компонента системы UPDRS, стандартного клинического инструмента оценки. У группы, получающей лечение с помощью GM1 (n=22), наблюдали значительное улучшение двигательных показателей по системе UPDRS (среднее улучшение 5,05 пунктов на четвертую неделю и 7,53 пункта на 16 неделю), тогда как средние показатели для группы, получающей плацебо, оставались в основном неизменными в течение 16 недельного лечения. Величина лечебного эффекта к четвертой неделе (-5,95±1,12), восьмой неделе (-5,61±1,39), 12-й неделе (-5,37±1,30) и 16-й неделе (-6,79±1,24) была статистически значимой (ANCOVA, p<0,0002). Вторичная оценка двигательной функции показала, что хотя обе группы делали схожее количество ошибок на начальном уровне в заданиях по сенсомоторной интеграции (GM1=5,3±2,3; Плацебо = 5,4±31), пациенты, получающие лечение с помощью GM1, допускали значительно меньше ошибок после 16 недель лечения (0,7±0,8 ошибки), по сравнению с пациентами, получавшими плацебо (5,1±3,1 ошибки, р=0,0001). Группа пациентов, получавших GM1, также значительно быстрее выполняла задания на двигательную активность на время (например, пронация/супинация (р=0,0001), касание пятка/носок (р=0,0008), касание пальцев (р=0,0001), последовательное касание пальцев (р=0,0001), и ходьбу (р=0,02) на 16 неделе, по сравнению с исходными показателями, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо. В конце 5 лет открытого применения GM1 пациенты имели более низкие показатели двигательной активности согласно UPDRS и проявляли меньше затруднений в ходе «off» - периода в повседневной активности, в сравнении с предварительно рандомизированными показателями на начальном уровне.
[0071] После завершения исследования начального состояния пациентам внутривенно вводили либо 1000 мг ганглиозида GM1 или плацебо (то есть, растворитель без GM1) в растворе 50 мл стерильного раствора Рингера. Пациентов обучили самостоятельно осуществлять подкожную инъекцию и отправляли их на домашнее лечение с четырехнедельным запасом ганглиозида GM1 (100 мг GM1 в 2,0 мл растворителе на ампулу) или плацебо, поставляемых в одинаковых флаконах по 2,0 мл. Пациенты были проинструктированы вводить содержимое двух ампул в день: одну утром и одну вечером (общая суточная доза составляла 200 мг GM1). Сопутствующие лекарственные препараты оставались неизменными.
[0072] Хотя настоящее описание ссылается на конкретные примеры вариантов реализации, специалистам в данной области будет понятно, что могут быть внесены различные изменения, и соответствующие эквиваленты могут заменять элементы вариантов реализации изобретения, не выходя за пределы объема настоящего изобретения. Кроме того, многие модификации могут быть осуществлены для того, чтобы конкретная ситуация или вещество соответствовало сути изобретения, оставаясь в пределах сути настоящего изобретения. Кроме того, в чертежах и описании раскрыты примеры вариантов реализации, и, несмотря на использование специальных условий, они представлены исключительно в общем и описательным смысле, если не указано иное, а не с целью ограничения, и, таким образом, они не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения. Кроме того, как очевидно специалисту в данной области, определенные этапы способов, рассмотренных в настоящей заявке, могут следовать в другом порядке или этапы могут быть объединены. Таким образом, предполагается, что прилагаемая формула изобретения не ограничена конкретными вариантами реализации, описанными в настоящей заявке.
[0073] Каждая из заявок и патентов, упоминаемых в настоящем описании, а также каждый документ или источник, упоминаемый в каждой из заявок и патентов (в том числе в ходе делопроизводства по каждому выданному патенту, "упоминаемые в заявке документы"), и каждая из заявок РСТ и зарубежных заявок или патентов соответствующих и/или испрашивающих приоритет по любой из таких указанных заявок и патентов, и каждый из документов, процитированный или упомянутый в каждом из процитированных в заявке документов, в явной форме включены в настоящую заявку посредством ссылок в полном объеме. В целом, документы или ссылки процитированы в настоящем описании либо в списке процитированных источников перед Формулой изобретения, либо в самом тексте; и каждый из таких документов и справочных материалов («процитированные в настоящей заявке источники»), а также каждый документ или упоминаемый источник в каждом из упоминаемых в настоящей заявке источников (в том числе любая техническая документация от производителя, инструкции и т.д.) включены в явной форме в настоящую заявку посредством ссылки.
Ссылки
1 Neeta S. Roy, et al. 2000. J Neurosci 59:321-31.
2 (Philip H. Schwartz, et al. 2003. J Neurosci; 74:838-51.
Claims (16)
1. Способ выделения ганглиозида GM1, включающий: получение тканей не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1; выделение из указанных тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1; экспансию указанных клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток; экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение указанного ганглиозида GM1 из указанной культуры.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки, продуцирующие GM1, представляют собой нервные клетки.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой фибробласты.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные ткани получают из полуовального центра, коры мозжечка, гиппокампа, головки хвостатого ядра, лобной доли, теменной коры или стенки желудочка, субгранулярной зоны или выстилки желудочков мозга, или любой их комбинации.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки, продуцирующие GM, представляют собой фибробласты, полученные из эпидермальных тканей или ткани легких.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки, продуцирующие GM1, включают клетки тканей ядра головного мозга.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки, продуцирующие GM1, включают клетки-предшественники.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что получение тканей не бычьего и не свиного происхождения включает вырезание частей тканей, помещение указанных тканей в транспортную среду, при этом указанная среда включает модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM) с высоким уровнем глюкозы, 4 мМ L-глутамин, 5-10%, 10-20% или 20-30% эмбриональной бычьей сыворотки, раствор неосновных аминокислот IX для среды MEM, пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин, амфомицин и гентамицин, и хранение указанных тканей на холоде при температуре, достаточной для поддержания экспансии указанных клеток.
9. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанные нервные клетки получены из ткани головного мозга со сверхэкспрессией ганглиозида GM1.
10. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанные нервные клетки получены из головного мозга, пораженного ганглиозидозом GM1.
11. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанные нервные клетки характеризуются недостатком β-галактозидазы.
12. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанные нервные клетки характеризуются частичной активностью α-нейраминидазы.
13. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанные нервные клетки получены из клеток фибробластов человека, взятых у субъектов с ганглиозидозом GM1 I типа.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный GM1 не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE).
15. Продукт на основе ганглиозида GM1 для лечения болезни Паркинсона и других неврологических заболеваний, полученный по способу, включающему получение тканей не бычьего и не свиного происхождения, содержащих клетки, продуцирующие GM1; выделение из указанных тканей клеток, продуцирующих ганглиозид GM1; экспансию указанных клеток, продуцирующих GM1, в культуре при подходящих условиях, способствующих экспансии указанных клеток; экспрессию ганглиозида GM1 в культуре при подходящих условиях; выделение указанного ганглиозида GM1 из указанной культуры.
16. Продукт на основе ганглиозида GM1 по п.15, отличающийся тем, что указанный GM1 не содержит примесей, способных вызвать губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23877509P | 2009-09-01 | 2009-09-01 | |
| US61/238,775 | 2009-09-01 | ||
| PCT/US2010/047522 WO2011028795A2 (en) | 2009-09-01 | 2010-09-01 | Methods for extraction and purification of gangliosides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012108200A RU2012108200A (ru) | 2013-10-10 |
| RU2567661C2 true RU2567661C2 (ru) | 2015-11-10 |
Family
ID=43649942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012108200/10A RU2567661C2 (ru) | 2009-09-01 | 2010-09-01 | Способы выделения и очистки ганглиозидов |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9394558B2 (ru) |
| EP (1) | EP2473615B1 (ru) |
| JP (1) | JP5836951B2 (ru) |
| KR (1) | KR20120062762A (ru) |
| CN (1) | CN102575275A (ru) |
| AU (1) | AU2010289600B2 (ru) |
| BR (1) | BR112012004689A2 (ru) |
| CA (1) | CA2772876C (ru) |
| DK (1) | DK2473615T3 (ru) |
| ES (1) | ES2581523T3 (ru) |
| NZ (1) | NZ598668A (ru) |
| RU (1) | RU2567661C2 (ru) |
| WO (1) | WO2011028795A2 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2581523T3 (es) | 2009-09-01 | 2016-09-06 | Lz Therapeutics, Inc. | Producción en cultivo celular (no bovino, no porcino) de GM1 |
| US9556467B2 (en) * | 2012-01-20 | 2017-01-31 | Garnet Bio Therapeutics, Inc. | Methods of ganglioside production |
| EP2968378A4 (en) * | 2013-03-15 | 2016-08-31 | Garnet Biotherapeutics Inc | GANGLIOSIDE COMPOSITIONS |
| WO2016035934A1 (ko) * | 2014-09-05 | 2016-03-10 | 한국생명공학연구원 | Gm1 강글리오시드증의 인간 세포 모델 및 이의 용도 |
| WO2020146886A1 (en) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | GlycoScience Research, Inc. | Treatment of neurodegenerative disease with ovine gm1 gangliosidosis gm1 ganglioside |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1113743A1 (ru) * | 1982-02-05 | 1984-09-15 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | Способ получени ганглиозидов |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1199116B (it) | 1984-07-03 | 1988-12-30 | Fidia Farmaceutici | Derivati di gangliosidi |
| JP2724588B2 (ja) | 1988-05-02 | 1998-03-09 | 丸金醤油株式会社 | ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法 |
| US5922773A (en) | 1992-12-04 | 1999-07-13 | The Children's Medical Center Corp. | Glaucoma treatment |
| CU22420A1 (es) | 1993-12-29 | 1996-01-31 | Centro Inmunologia Molecular | Composicion vacunal para el desarrollo de una respuesta contra gangliosidos n glicolilados y su uso para el tratamiento del cancer |
| JP3615798B2 (ja) | 1994-09-30 | 2005-02-02 | 雪印乳業株式会社 | ガングリオシドの製造法 |
| US5635504A (en) | 1995-06-07 | 1997-06-03 | Bristol-Myers Squibb Co. | Diazepine containing dual action inhibitors |
| US5532141A (en) * | 1995-06-13 | 1996-07-02 | Holler; Larry D. | Process for obtaining ganglioside lipids |
| AU718171B2 (en) * | 1996-07-19 | 2000-04-06 | Takara Bio Inc. | Methods for producing sphingolipids and sphingolipid derivatives |
| US6410046B1 (en) | 1996-11-19 | 2002-06-25 | Intrabrain International Nv | Administering pharmaceuticals to the mammalian central nervous system |
| US6555371B1 (en) | 1997-07-09 | 2003-04-29 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Sialyltransferase and DNA encoding the same |
| AU744303B2 (en) * | 1997-12-01 | 2002-02-21 | Neose Technologies, Inc. | Enzymatic synthesis of gangliosides |
| WO2003054544A2 (de) | 2001-12-21 | 2003-07-03 | Viscum Ag | Verfahren zur bestimmung der responsivität eines individuums für mistellektin |
| IL154318A (en) | 2003-02-06 | 2010-05-31 | Sarah Herzog Memorial Hospital | Pharmaceutical compositions for the treatment of movement disorders |
| WO2004083387A2 (en) | 2003-03-13 | 2004-09-30 | Corixa Corporation | Anti-ganglioside antibodies and methods of use |
| US7851451B2 (en) | 2004-03-12 | 2010-12-14 | Mti Meta Tech Inc. | Formulations for mediating inflammatory bowel disorders |
| KR20070007908A (ko) | 2004-05-07 | 2007-01-16 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 당뇨병의 미세혈관 합병증의 치료 표적으로서의 ｇｍ３신타제 |
| DE602005025391D1 (de) | 2004-11-01 | 2011-01-27 | Seo Hong Yoo | Verfahren und zusammensetzungen zur verringerung der neurodegeneration bei amyotrophischer lateralsklerose |
| WO2007006157A1 (en) | 2005-07-14 | 2007-01-18 | The University Of British Columbia | Neuroprotective modulation of nmda receptor subtype activities |
| IL172175A0 (en) | 2005-11-24 | 2011-08-01 | Hadasit Med Res Service | Beta glycolipids as immuno-modulators |
| WO2008033754A2 (en) | 2006-09-11 | 2008-03-20 | Duke University | Xanthine derivatives in methods and compositions for the treatment of vascular depression |
| EP1902733A1 (en) | 2006-09-19 | 2008-03-26 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Combination of a NMDA-receptor ligand and a compound with 5-HT6 receptor affinity |
| US7943750B2 (en) | 2007-06-18 | 2011-05-17 | Laboratoire Medidom S.A. | Process for obtaining pure monosialoganglioside GM1 for medical use |
| WO2011028797A2 (en) | 2009-09-01 | 2011-03-10 | Lazarus Therapeutics, Inc. | Treatment of glaucoma and other retinopathies with gangliosides |
| ES2581523T3 (es) | 2009-09-01 | 2016-09-06 | Lz Therapeutics, Inc. | Producción en cultivo celular (no bovino, no porcino) de GM1 |
| EP2473174A4 (en) | 2009-09-01 | 2014-02-26 | Lz Therapeutics Inc | TRANSMUCOSAL GANGLIOSIDE FORMULATIONS |
| US9556467B2 (en) | 2012-01-20 | 2017-01-31 | Garnet Bio Therapeutics, Inc. | Methods of ganglioside production |
| EP2968378A4 (en) | 2013-03-15 | 2016-08-31 | Garnet Biotherapeutics Inc | GANGLIOSIDE COMPOSITIONS |
-
2010
- 2010-09-01 ES ES10814423.9T patent/ES2581523T3/es active Active
- 2010-09-01 CA CA2772876A patent/CA2772876C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-01 CN CN2010800407713A patent/CN102575275A/zh active Pending
- 2010-09-01 BR BR112012004689A patent/BR112012004689A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-09-01 WO PCT/US2010/047522 patent/WO2011028795A2/en active Application Filing
- 2010-09-01 JP JP2012528008A patent/JP5836951B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-01 AU AU2010289600A patent/AU2010289600B2/en not_active Ceased
- 2010-09-01 RU RU2012108200/10A patent/RU2567661C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-09-01 DK DK10814423.9T patent/DK2473615T3/en active
- 2010-09-01 KR KR1020127006366A patent/KR20120062762A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-09-01 NZ NZ598668A patent/NZ598668A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-09-01 EP EP10814423.9A patent/EP2473615B1/en active Active
-
2012
- 2012-02-28 US US13/407,067 patent/US9394558B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1113743A1 (ru) * | 1982-02-05 | 1984-09-15 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | Способ получени ганглиозидов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ROBERT W. LEDEEN ET AL, Gangliosides as neurotrophic agent: studies on the mechanism of action, Acta Neurobiol Exp., Vol.50, 1990, pages 439-449. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9394558B2 (en) | 2016-07-19 |
| AU2010289600B2 (en) | 2015-03-19 |
| EP2473615A4 (en) | 2013-05-15 |
| CA2772876C (en) | 2019-01-15 |
| DK2473615T3 (en) | 2016-07-25 |
| NZ598668A (en) | 2014-07-25 |
| WO2011028795A3 (en) | 2011-07-21 |
| CA2772876A1 (en) | 2011-03-10 |
| RU2012108200A (ru) | 2013-10-10 |
| EP2473615B1 (en) | 2016-04-06 |
| WO2011028795A2 (en) | 2011-03-10 |
| US20120220763A1 (en) | 2012-08-30 |
| EP2473615A2 (en) | 2012-07-11 |
| JP5836951B2 (ja) | 2015-12-24 |
| CN102575275A (zh) | 2012-07-11 |
| KR20120062762A (ko) | 2012-06-14 |
| ES2581523T3 (es) | 2016-09-06 |
| AU2010289600A1 (en) | 2012-04-05 |
| BR112012004689A2 (pt) | 2019-09-24 |
| JP2013503635A (ja) | 2013-02-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2567661C2 (ru) | Способы выделения и очистки ганглиозидов | |
| JP2022084697A (ja) | 神経変性を治療するための方法及び組成物 | |
| EP1423504B1 (en) | Compositions and methods for isolation, propagation, and differentiation of non-embryonic human stem cells and uses thereof | |
| EP2099901B1 (en) | Use of a composition contaning human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells | |
| US10870830B2 (en) | Method for culturing differentiation-promoting and -sustaining spheroid form of tonsil-derived stem cells | |
| CN113728091B (zh) | 用于促进干细胞来源外泌体产生和增加干性的组合物 | |
| CN113046309B (zh) | 悬浮培养脑类器官的培养基及其应用 | |
| US7635591B2 (en) | Method for differentiating mesenchymal stem cell into neural cell and pharmaceutical composition containing the neural cell for neurodegenerative disease | |
| JP2021072789A (ja) | 幹細胞材料およびその製造方法 | |
| KR20080049917A (ko) | 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물 | |
| KR20230109119A (ko) | 줄기세포능을 증대시키기 위한 조성물 및 이의 용도 | |
| JPWO2020012991A1 (ja) | 間葉系幹細胞及び神経障害治療剤 | |
| CN101361745A (zh) | S1p在制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡药物上的应用 | |
| CN111479576A (zh) | 作为单胺产生促进剂的包含间充质干细胞的医药组合物 | |
| US20230138160A1 (en) | Composition for ciliogenesis promotion, containing, as active ingredient, mesenchymal stem cell or mesenchymal stem cell culture solution | |
| KR20130039467A (ko) | 태반의 양막 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화시키는 방법 | |
| Class | Patent application title: COMPOSITIONS AND METHODS FOR ISOLATION, PROPAGATION, AND DIFFERENTIATION OF HUMAN STEM CELLS AND USES THEREOF Inventors: Toomas Neuman (Santa Monica, CA, US) Michel Levesque (Beverly Hills, CA, US) Assignees: LEVESQUE BIOSCIENCES, INC. | |
| UA112927C2 (uk) | Спосіб лікування хвороби паркінсона препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин | |
| KR20110118084A (ko) | 고막조직에서 유래된 다분화능 성체줄기세포, 이의 제조방법 및 이로부터 분화된 세포 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200902 |