ES2581523T3 - Producción en cultivo celular (no bovino, no porcino) de GM1 - Google Patents
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Abstract
Un método de producción basado en cultivo celular de gangliósido GM1 aislado que comprende las etapas de: a) obtener células productoras de GM1 derivadas de tejido que no es bovino ni porcino, b) expandir las células productoras de GM1 de la etapa (a) en cultivo, c) expresar gangliósido GM1 en las células productoras de GM1 de la etapa (b), y d) aislar gangliósido GM1 expresado en la etapa (c); en el que las células productoras de GM1 son células neurales, células de fibroblasto, células de tejido del núcleo cerebral o células progenitoras.
Description
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DESCRIPCION
Produccion en cultivo celular (no bovino, no porcino) de GM1 Campo
En el presente documento estan descritos metodos de produccion basados en cultivo celular de gangliosido GM1 aislado a partir de tejido que no es bovino ni porcino.
Antecedentes
La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo lento pero constantemente progresivo, que da lugar a un empeoramiento con el tiempo de los sintomas clinicos. Sintomas clinicos incluyen temblor, bradiquinesia (movimiento ralentizado), musculos rigidos, postura y equilibrio deteriorados, perdida de movimientos automaticos, y cambios en el lenguaje. Si bien existe variabilidad clinica considerable entre pacientes el armamento actual de farmacos anti-PD mejora de forma efectiva, si bien temporalmente, la mayor parte de los signos y sintomas de Parkinson en la mayoria de los pacientes. A pesar de las mejoras sintomaticas transitorias de las terapias con farmaco tradicionales, la discapacidad funcional empeora con el tiempo.
El advenimiento de terapia con levodopa se ha asociado con una prolongacion de la supervivencia en pacientes con PD si bien esta terapia no ralentiza la progresion de los sintomas. Levodopa, un precursor metabolico de dopamina (L-3, 4-dihidroxifenilalanina), es en la actualidad el agente mas efectivo en el tratamiento de PD. Administrado junto con levodopa para evitar la catabolizacion de levodopa administrada por via oral se encuentran los inhibidores de catecol-O-metiltransferasa (COMT) tales como tolcapme y entracapone; por tanto, se aumenta la vida media en plasma y el porcentaje de levodopa que alcanza el CNS. Un problema continuo con la terapia de levodopa es que tras un prolongado periodo de eficacia en pacientes la efectividad en la reduccion de los sintomas dura menos tras cada dosis. Adicionalmente con el tiempo tiene lugar la disquinesia. Estos efectos de uso continuado de levodopa son una consecuencia de la degeneracion progresiva por dopamina.
No se ha identificado aun farmaco que ralentice o detenga de forma definitiva la progresion de PD o prevenga de forma sustancial el declive funcional inevitable en pacientes con PD.
Son seriamente necesarios farmacos que puedan modificar la progresion clinica, remediar los deficits motores o cognitivos, restablecer o mejorar la funcion de partes residuales del sistema de dopamina (“DA”) o activar mecanismos compensatorios. No obstante, no hay agente estudiado hasta la fecha que haya dado evidencia convincente de neuroproteccion o modificacion de la enfermedad y no hay estudio de agente como un agente neurorestaurativo.
Estudios in vitro e in vivo preclinicos han demostrado que GM1 rescata neuronas de DA danadas, estimula la supervivencia y reparacion de neuronas dopaminergicas y rebrota terminales dopaminergicas funcionales, aumenta niveles de DA en el nucleo estriado y sobreregula la capacidad sintetica de DA de neuronas residuales. Vease, por ejemplo, "GM1 Ganglioside in the Treatment of Parkinson's Disease," Schneider, Ann. N.Y. Acad. Sciences 845, 363-73 (feb. 2006). Estudios clinicos preliminares de GM1 en pacientes con PD tambien mostraron mejoras clinicas en pacientes con uso a corto plazo de FM1 y progresion minima de sintomas en un subgrupo de pacientes tras cinco anos de uso de GM1 seguido de progresion significativa de sintomas tras interrupcion de uso de GM1 a largo plazo.
Por lo tanto un enfoque potencialmente fructifero para el tratamiento de PD consiste en la administracion de agentes tales como GM1, que puedan estabilizar neuronas DA danadas o moribundas, estimulen el rebrote de nuevas fibras y terminales dopaminergicos, o mejoren la funcion de neuronas dopaminergicas residuales o estimulen o mantengan los procesos compensatorios.
GM1, un monosialogangliosido, es un constituyente normal de las membranas celulares del nervio, y es conocido por modular un numero de actividades de la superficie celular y del receptor asi como tambien jugar papeles importantes en diferenciacion y desarrollo neuronal, fosforilacion de proteina, y funcion sinaptica. En numerosos estudios preclinicos el tratamiento cronico con GM1 tras diferentes tipos de lesiones para el sistema nervioso central ha dado lugar a la recuperacion bioquimica y comportacional y estos efectos han sido particularmente visibles en el sistema DA danado.
Hasta ahora la unica forma de GM1 usado clinicamente se ha derivado de cerebro bovino. La cantidad limitada de GM1 obtenida por cerebro y el coste asociado con procedimientos de extraccion del cerebro han limitado su desarrollo como un producto comercial. Ademas, el uso de cerebro de vaca como una fuente de GM1 da lugar a inquietudes justificables sobre enfermedades de priones tales como encefalopatia espongiforme bovina (“enfermedad de las vacas locas”).
Persiste una necesidad continua y no satisfecha de nuevos y mejores metodos para la extraccion y purificacion de GM1, en particular metodos que usen fuentes no bovinas.
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El documento EP 2011799 describe un proceso para obtener GM1 que comprende la separacion de una mezcla lipidica usando cromatografia en columna de intercambio ionico.
La patente de Estados Unidos n° 5.532.141 describe que GM1 se puede aislar de cerebro complete de oveja de oveja aquejada de gangliosidosis.
Ledeen y col. Acta Neurobiol Exp. 50: 439-449 (1990) describe la adicion de GM1 “administrada exogeneamente” a una variedad de sistemas de cultivo neuronales para estudiar los efectos neuritogenicos y/o neuronotropicos en las celulas.
Ladisch y col. Cancer Research 43: 3808-3813 (1983) describe la sintesis de gangliosidos por celulas de linfoma YAC-1. GM1 se expresa entre otros gangliosidos y la muestra se lleva a cromatografia de capa delgada (TLC). Sin embargo, las diversas bandas de gangliosido nunca se aislan del gel de TLC.
Sumario
Se proporciona en el presente documento un metodo de aislamiento de gangliosido GM1 mediante la preparacion de tejidos no bovino y no porcinos que comprenden celulas productoras de GM1 que incluye el aislamiento de tejidos de la celula que produce gangliosido GM1; expansion de celula productora de GM1 en cultivo en condiciones adecuadas para facilitar la expansion de dichas celulas; expresar la expresion de gangliosido GM1 en cultivo bajo condiciones adecuadas; aislamiento de gangliosido GM1 del cultivo. Las celulas que producen GM1 son celulas neurales, celulas de fibroblasto, celulas de tejido de nucleo cerebral, o celulas progenitoras. Tal como se usa en el presente documento celulas productoras de GM1 son celulas que expresan GM1 bien basalmente o en un nivel elevado en comparacion con celulas normales.
En otra realizacion el metodo puede comprender el aislamiento de GM1 de celula neural que se deriva de celulas de fibroblasto no bovinas y no porcinas cosechadas en sujetos con GM1-gangliosidosis tipo I. Por tanto la GM1 esta libre de contaminantes de BSE.
En otra realizacion se proporciona un metodo de preparacion de una composicion de gangliosido GM1 en el que la composicion de gangliosido GM1 se produce mediante el proceso descrito en el presente documento que comprende la preparacion de tejidos no bovinos y no porcinos que comprenden celulas productoras de GM1 como se definio anteriormente; aislamiento de dichos tejidos de la celula que produce gangliosido GM1; expansion de dicha celula productora de GM1 en cultivo bajo condiciones adecuadas para facilitar la expansion de dichas celulas; expresar la expresion de gangliosido GM1 en cultivo bajo condiciones adecuadas; y aislamiento de dicho gangliosido GM1 de dicho cultivo. Por tanto, el gangliosido GM1 esta sustancialmente libre de o libre de contaminantes de BSE.
Se pueden entender caracteristicas adicionales haciendo referencia a la siguiente descripcion detallada y ejemplos.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 ilustra una tabla que enumera las estadisticas de expansion de celulas de hipocampo de oveja en cultivo con bajo contenido de O2 en medio tipo 1 como se describe en el presente documento.
La figura 2 ilustra un grafico lineal de doblamientos de poblacion acumulativa de celulas progenitoras neurales del hipocampo.
La figura 3 ilustra una tabla que enumera doblamientos totales y rendimientos de celulas de hipocampo en cultivo de bajo contenido en O2 en medio tipo 1 como se describe en el presente documento.
La figura 4 ilustra una tabla que enumera las estadisticas de expansion de celulas de fibroblasto de oveja en cultivo de bajo contenido de O2 en medio tipo 1 como se describe en el presente documento.
La figura 5 ilustra un grafico lineal de doblamientos de poblaciones acumulativas de celulas de fibroblasto de oveja. La figura 6 ilustra un grafico de barras que ilustra expansion de tejido de pulmon frente a tejido conectivo epidural.
La figura 7 ilustra una tabla que enumera la expansion de tejido de pulmon de fibroblasto frente a tejido conectivo. Descripcion detallada
Se describen en el presente documento nuevos metodos para la purificacion y extraccion de gangliosido GM1 de celulas derivadas de oveja aquejada con gangliosidosis GM1 o de celulas derivadas de pacientes humanos con gangliosidosis GM1 como fuentes estables y renovables de GM1.
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Se proporciona en el presente documento un metodo de aislamiento de gangliosido GM1 mediante preparacion de tejidos no bovinos ni porcinos que comprenden celulas productoras de GM1 que incluye el aislamiento de tejidos de celulas de produccion de gangliosido GM1; expansion de celula productora de GM1 en cultivo bajo condiciones adecuadas para facilitar la expansion de dichas celulas; expresar la expresion de gangliosido GM1 en cultivo bajo condiciones adecuadas; aislamiento de gangliosido GM1 del cultivo. Las celulas de produccion de GM1 son celulas neurales, celulas de fibroblasto, celulas de tejido de nucleo cerebral, o celulas progenitoras. Como se usa en el presente documento, las celulas productoras de GM1 son celulas sobreproductoras que expresan GM1 a un nivel elevado en comparacion con celulas normales. En particular tales celulas se pueden derivar de oveja y/o humanos aquejados de gangliosidosis.
Los tejidos de los que se aislan y se preparan las celulas incluyen el centro semioval, cortex del cerebelo, hipocampo, nucleo caudado, lobulo frontal, cortex parietal, o pared ventricular, zona subgranular o regiones de revestimiento ventricular del cerebro. Cualquier combinacion de celulas extraidas de estas regiones diferentes se puede expandir y cultivar en el presente metodo. Las celulas productoras de GM son celulas de fibroblasto derivadas de tejidos epidermicos o tejido de pulmon, donde las celulas productoras de GM1 incluyen celulas de tejido de nucleo cerebral o celulas progenitoras.
Tambien se describe un metodo de preparacion de tejidos no bovinos o no porcinos mediante escision de porciones de tejidos; fijacion de dichos tejidos en un medio de transporte, donde el medio puede ser DMEM con alto contenido en glucosa; L-glutamina 4 mM, 5-10%, 10-20%, o suero bovino fetal al 20-30%, solucion IX de aminoacidos no esenciales MEM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina; amfomicina, y gentamicina; y tejidos refrigerantes a una temperatura suficiente para mantener la expansion de dichas celulas.
En una realizacion la celula neural se deriva de un tejido cerebral donde se sobreexpresa gangliosido GM1, o se deriva de un cerebro afectado por gangliosidosis GM1. Las celulas neurales pueden presentar una deficiencia en p- galactosidasa que conducen a sobreexpresion en GM1 en comparacion con lo normal. Las celulas neurales usadas en el metodo pueden presentar actividad de a-neuraminidasa parcial.
En otra realizacion el metodo puede comprender el aislamiento de GM1 de celulas de fibroblasto no bovino y no porcino cosechadas en sujetos humanos con gangliosidosis GM1 tipo 1. Por lo tanto el GM1 esta libre de contaminantes BSE. Contaminantes BSE como se usa en el presente documento significa cualquier proteina de biomolecula, proteina de prion (PrP) o cualquier biomolecula que se puede detectar mediante anticuerpos en proteinas PrP. De forma tipica fuentes comercialmente disponibles de GM1 son de origen bovino y se puede encontrar en forma irradiada para eliminar posibles contaminantes, sin embargo se mantiene el riesgo terapeutico de una fuente de este tipo. Tales fuentes de GM1 tipicas incluyen Sigma Aldrich.
En otra realizacion se proporciona un metodo de preparacion de una composicion de gangliosido GM1 en la que la composicion de gangliosido GM1 se produce mediante el proceso descrito en el presente documento que comprende preparacion de tejidos no bovino y no porcinos que compenden celulas productoras de GM1; aislamiento de dichos tejidos de la celula que produce gangliosido GM1; expansion de dicha celula productora de GM1 en cultivo bajo condiciones adecuadas para facilitar la expansion de dichas celulas; expresar la expresion de gangliosido GM1 en cultivo bajo condiciones adecuadas; y aislamiento de dicho gangliosido GM1 de dicho cultivo. Por lo tanto el gangliosido GM1 esta sustancialmente libre de o libre de contaminantes BSE.
Esta invencion implica el uso de celulas derivadas de oveja aquejada de gangliosidosis GM1 o celulas derivadas de humanos con gangliosidosis GM1 para obtener, mediante cultivo celular, cantidades comercialmente viables de gangliosido GM1 para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson y otros trastornos neurologicos. Los gangliosidos se pueden administrar solos o junto con cuidados medicos convencionales para pacientes PD, o pacientes con otros tipos de enfermedades neurodegenerativas incluyendo, pero sin limitarse a esta, enfermedad de Huntington, etc.)
Se puede administrar GM1 solo o en combinacion con otros gangliosidos por inyeccion por via subcutanea o por via intravenosa o por administracion nasal o mucosal, entre otras. Esto puede incluir tambien formas de dosificacion de accion prolongada y se pueden administrar gangliosidos usando formulaciones de liberacion controlada (liposomas, nanoparticulas, microesferas) para prolongar la actividad del farmaco. Estas se pueden conjugar tambien en moleculas transportadoras apropiadas con el fin de cruzar la barrera cerebral sanguinea.
En la patente de Estados Unidos n° 5.532.141 se describen ovejas aquejadas de gangliosidosis GM1 y la extraccion de GM1 y otros gangliosidos del cerebro de tales animales. La enfermedad en estos animales se caracteriza por una deficiencia en la actividad de la p-galactosidasa y actividad de a-neuraminidasa parcial, que da lugar a animales con acumulacion de grandes cantidades de gangliosido GM1 en tejido cerebral (aumento de hasta 40 veces en comparacion con animales no afectados). Con procedimientos de extraccion optimizados se estima que un unico cerebro de oveja con gangliosidosis daria de 1-2 gramos de GM1. Se estima adicionalmente que 1 kg de cerebro afectado daria aproximadamente 15 g de GM1. En comparacion, 1 kg de cerebro de porcino se estima que da 250 mg de GM1. Sin embargo incluso a estos niveles mayores de expresion serian necesarias varios cientos de ovejas al ano para obtener cantidades comerciales de GM1.
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Con el uso de tecnicas celulares se puede obtener GM1 de diversas fuentes potenciales derivadas de oveja con gangliosidosis GM1. Por ejemplo, se puede cultivar y expandir celulas precursoras neurales, conducirlas hacia un fenotipo neuronal, optimizar su crecimiento y desarrollo (y quizas incluso la produccion de GM1 usando diversas manipulaciones, incluyendo pero sin limitarse a esta la inhibicion de la produccion de gangliosido serie B (por ejemplo, mediante inhibicion de la GD3 sintasa) y mantenimiento de la ruta biosintetica para gangliosidos serie A en GM1, dirigiendo de esta forma mas produccion de gangliosido hacia GM1) y luego extraer GM1 de celulas neurales cultivadas asi como tambien GM1 desprendido por celulas al medio. Se pueden realizar tambien otras alteraciones para mejorar el desprendimiento de gangliosido y optimizar adicionalmente la coleccion de gangliosido de celulas cultivadas. De forma alternativa o en combinacion con el esquema general descrito anteriormente, se pueden cultivar tambien fibroblastos o hepatocitos en cultivo y usarse como fuentes de GM1.
Se pueden derivar celulas usadas en el presente metodo de tejidos cerebrales incluyendo, pero sin limitarse a estos, centro semioval, cortex del cerebelo, hipocampo, nucleo caudado, cortex cerebral, pared ventricular o una combinacion de los mismos.
Otra fuente potencial de GM1 son fibroblastos (o hepatocitos) de pacientes con gangliosidosis GM1 de tipo I (infantil). Pacientes con gangliosidosis GM1 de tipo I tienden a presentar menos del 1% de la cantidad normal de p- galactosidasa en sus celulas y por tanto sus celulas tienden a producir niveles muy altos de gangliosido GM1. Fibroblastos humanos normales pueden contener aproximadamente 0,7 nmoles de GM1/mg de proteina. Fibroblastos de gangliosidosis GM1 pueden contener hasta 2,85 nmoles de GM1/mg de proteina. La cantidad de GM1 obtenida de fibroblastos con gangliosidosis GM1 humana cultivada se optimizara usando parametros de crecimiento celular, condiciones de cultivo y alimentacion optimas, y determinando el tiempo optimo para cosechar celulas para extraccion de GM1. De forma adicional se tamizaran numerosas muestras de donantes pacientes de GM1 de tipo I para encontrar lineas celulares que presenten acumulacion de GM1 optima debido a la severidad de falta de p-galactosidasa, lo que diferira de un paciente a otro. De forma adicional se pueden usar hepatocitos de los mismos pacientes como una fuente celular alternativa o complementaria de GM1.
Una vez que se tienen las celulas de oveja con gangliosidosis hay diversos caminos posibles para mejorar adicionalmente el rendimiento en GM1 de estas celulas. Un metodo seria tratar las celulas con bajas concentraciones de cloroquina, una base debil, que provocara una acumulacion marcada de GM1 en endosomas y sobre la superficie de las celulas (Yuyama y col., 2006). Otro metodo seria tratar las celulas con sialidasa (neuraminidasa) que las transformara todos los gangliosidos de complejo mayor del cerebro (ej., GD1a, GD1b, y GT1b) en GM1 sobre celulas intactas (Schauer, y col, 1980). Otro metodo seria el uso de un metodo no enzimatico que Dowex-50W-H+ para catalizar la desialilacion de alta selectividad de gangliosidos de la serie ganglio-N-tetraosa polisialados dando GM1 primario (Schengrund y Kovac, 1999). Usando estos metodos es posible recuperar mayores cantidades de GM1 de celulas y membranas asi como tambien aumentar la cantidad de GM1 desprendida y recuperada del medio.
Se describe adicionalmente que un medio potencial adicional para la produccion de gangliosido GM1 mediante tecnicas basadas en celulas puede incluir programacion de celulas con ingenieria de genoma multiple y evolucion acelerada para inducir E. coli a producir gangliosido GM1. Con el uso de ingenieria de genoma multiple automatizado (“MAGE”), uno puede disenar la ruta biosintetica para GM1 en E. coli con el fin de sobreproducir gangliosido GM1. Por ejemplo, uno puede modificar de forma simultanea muchas localizaciones genomicas para modificar la biosintesis de GM1 con ciertos genes relevantes que presentan expresion sintonizada optimamente y ser inhibidos u omitidos ciertos genes con el fin de optimizar la produccion de GM1 e inhibir la produccion de otros gangliosidos. E. coli puede ser modificado por metodos conocidos por los especialistas en la tecnica con lo que se incorporan genes de gangliosido en el sistema de E. coli mediante metodos convencionales como se conoce en la tecnica. A modo de ejemplo metodos convencionales incluyen aislamiento de ADN plasmido que se ha modificado para expresar GM1 sintasa para producir GM1 en cultivo. Otros genes que producen gangliosido incluyen GD3 sintasa.
E. coli se puede cultivar en condiciones especificas en las que se encuentran disponibles sustancias precursoras en el medio, segun sea necesario, tal como lactosilceramida sintetica (LacCer, Fuente de planta) y acido sialico (disponible de fuente no animal o se puede sintetizar). Se puede sintonizar perfectamente la actividad enzimatica (por ejemplo, sialiltransferasa, N-acetilgalactosaminiltransferasa, galactosiltransferasa) mediante el proceso MAGE, y se puede proporcionar activador (trifosfato de guanosina para activacion del enzima transferasa), asi como tambien N-acetilgalactosamina y galactosa (los azucares necesarios para ser transformados en sus derivados nucleotido con el fin de servir como donantes de azucar).
GM1 se extrae en la actualidad de cerebro bovino o porcino, lo que es un proceso caro de bajo rendimiento. La invencion actual proporcionaria una produccion de gangliosido GM1 segura y eficiente a base de celulas. Proporcionaria tambien la primera fuente comercial de gangliosido GM1 humano. Con esta tecnica se pueden producir tambien otras especies de gangliosido ademas de GM1, y el GM1 y otros gangliosidos pueden presentar usos en una amplia variedad de trastornos neurologicos tales como la enfermedad de Parkinson.
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Ejemplos
EJEMPLO 1
Se recibio tejidos de cerebro ovino, que incluyen las siguientes fuentes de tejido: centro semioval; cortex del cerebelo; hipocampo, nucleo caudato, cortex cerebral (ex., frontal, parietal), y paredes ventriculares.
Todos los tejidos fueron procesados individualmente mediante el siguiente metodo: se lavo cada tipo de tejido con solucion tampon de PIPES; se digirio cada tejido en un coctel de Papain/DNase I/Dispase (proteasa neutra) con antibioticos/antimicoticos, se neutralizaron las enzimas y se pasaron celulas disociadas a traves de un filtro celular; se centrifugaron las celulas y se resuspendieron en DMEM/F12/N2 que contiene FBS al 5% que contiene antibioticos/antimicoticos; se enumeraron las celulas, luego se sembraron en matraces recubiertos de fibronectina2 en: medio tipo n° 1: DMEM/F12/N2 que contiene FBS al 5% que contiene antibioticos/antimicoticos; suplementado con 10 ng/ml de bFGF y 20 ng/ml de EGF. Medio Neurocult Proliferation-A; se cultivaron celulas en cada tipo de medio en un incubador humidificado a 37° C con bajo nivel de O2 y alto nivel de O2 para comparacion.
Tabla 1
- Tabla resumen de expansion de celulas derivadas de tejido cerebral de oveja
- Cultivos de bajo contenido en O2 - tipo de medio n° 1
- Doblamientos totales / N° de ultimo paso
- Centro semioval
- 16.1/P.2
- Cortex del cerebelo
- 13.8/P.2
- Hipocampo
- 21.1/P.3
- Nucleo caudado
- 8.9/P.1
- Cortex frontal - parietal
- 2.1/P.1
- Pared ventricular
- 6.8/P.1
- Centro semioval
- P.0
- Cortex del cerebelo
- P.0
- Hipocampo
- P.0
- Nucleo caudado
- P.0
- Cortex frontal - parietal
- P.0
- Pared ventricular
- P.0
La tabla 1 anterior describe la proliferacion y expansion de celulas en diversas condiciones de cultivo. Se observa que cultivos cultivados en Neurocult Proliferation-A no crecian bien de modo que se congelaban el pequeno numero de celulas cosechadas en P.0 y no se expandian mas.
EJEMPLO 2
Tejidos ovinos recibidos de aislamiento de fibroblasto, que incluyen las siguientes fuentes de tejido: pulmon (se reunieron pulmones izquierdo y derecho), y tejido conectivo epidural.
Todos los tejidos fueron procesados individualmente, usando los siguientes metodos: se lava cada tipo de tejido con solucion tampon PIPES. Se digiere cada tejido en colagenasa/hialuranidasa en DMEM con antibioticos/antimicoticos, se neutralizan los enzimas en DMEM que contiene FBS al 10% y se pasan celulas disociadas a traves de un filtro de celulas. Se centrifugaron y se resuspendieron las celulas en FGM-2 que contiene antibioticos/antimicoticos. Se enumeraron las celulas luego se sembraron en matraces y los tejidos restantes se disponen en discos en medio FGM-2. Se cultivaron celulas en un incubador humidificado a 37° C con bajo contenido en O2.
- Tabla resumen de expansion de fibroblasto de oveja
- Doblamientos totales / N° de ultimo paso
- Pulmon
- 20/P.2
- Tejido conectivo epidural
- 7.2/P.1
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EJEMPLO 3
Digestion. Se recibieron muestras en diversos tubos de centrifuga, se etiquetaron 1-10, y se retiraron de la caja de expedicion, se limpiaron y se dispusieron en una rejilla de tubos de 50 ml. Se tomaron imagenes de cada tubo. Cada tubo se pulverizo con etanol, se lavo de nuevo, y luego se transfirio a la cabina de bioseguridad para procesamiento aseptico. Se aspiro cuidadosamente el medio de transporte de cada tubo usando una pipeta de 10 ml limpia y se desecha a un recipiente de residuos. Se transfirio la solucion PIPES en exceso (40 ml) a cada tubo, se sustituyo el tapon y se invirtieron agilmente los tubos y de nuevo se lavan varias veces del medio de transporte residual de los tejidos. Esto se aspiro luego usando una pipeta de 10 ml y se desecha a un recipiente de residuos.
Se transfirio veinte mililitros de medio de digestion cerebral a tubos que contienen tejido cerebral y se etiqueto cada tuvo con 1 a 6. Se preparo una clave para identificar posteriormente la zona del cerebro asociada con cada numero. Se transfirio veinte mililitros de solucion de colagenasa/hialuronidasa (1x) a cada uno de los tubos que contienen tejidos de otros organos. Con el uso de una pipeta esteril de 25 ml y de 50 ml, pinzas y escalpelo esteriles, se transfirio tejidos de cada tubo a un disco de 10 cm esteril, se bana en medio de digestion y se pica en secciones muy pequenas. Se pipeteo los contenidos de cada disco (piezas de tejido y medio de digestion) con una pipeta de 25 ml o 50 ml y se transfirio de nuevo al tubo apropiado, se tapa y se dispusieron todos en el incubador a 37° C durante 45 minutos. Despues de 45 minutos se transfirieron de nuevos los tubos a la campana y se trituro cada uno usando una pipeta esteril de 25 ml y 10 ml, respectivamente. Los tapones fueron reemplazados y se dispusieron de nuevo los tubos en la rejilla de tubos en el incubador a 37° C durante 15 minutos. Tras la incubacion se transfirieron asepticamente los tubos a la campana. Se transfirio veinticinco mililitros de medio de neutralizacion a cada uno de los 10 tubos, se taparon y se invirtieron varias veces cada uno de ellos para mezclarse. Se centrifugaron los tubos durante 10 minutos a 200g para agregar las celulas y quedaron los fragmentos de tejidos. Los tubos se transfirieron asepticamente en la campana y se aspiro cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo, asegurando que no se aspirase pieza alguna de tejido o celulas. Los tubos que contienen regiones cerebrales 1-6 recibieron 40 ml de medio tipo n° 1 para resuspender las celulas y dejar las piezas de tejido. Tubos que contienen pulmon, tejido conectivo epidural y tejido conectivo oseo se resuspendieron en 40 ml de medio de crecimiento de fibroblasto FGM- 2. Cada uno de los 10 tubos con celulas resuspendidas y tejidos se pipetearon a traves de un filtro celular de 40 pm y a los nuevos tubos de 50 ml etiquetados. Se llevo a cabo un conteo y viabilidad en cada tubo.
Condiciones de expansion con bajo nivel de O2. Se sembraron celulas de seis regiones diferentes del cerebro a 100.000 cm2 en seis matraces T80 recubiertos con fibronectina en 15 ml de medio tipo n° 1 o 15 ml de medio tipo n° 2 (medio Neurocult Proliferation-A) y se incubaron en un incubador humidificado a 37° C con baja tension de oxigeno (O2 al 4%, CO2 al 5% y se equilibra con nitrogeno). Cada dos dias se reemplaza el 50% del medio de cultivo con medio fresco. Los cultivos no eran homogeneos. Las celulas formadoras de colonia eran la minoria de las celulas presentes al principio, pero despues de unos dias estas celulas comenzaron a forma colonias y a crecer. Se cosecharon cultivos de paso 0 en el dia 9. Vease la tabla 1.0 para rendimientos.
Se sembraron celulas del paso 1 a 100 celulas/cm2 en dos matraces recubiertos con fibronectina de T225 cm2 en 36 ml de medio tipo n° 1 y de medio tipo n° 2 para cada una de las seis regiones. Se alimentaron los cultivos con 100% de medio fresco en el dia 5. Los cultivos permanecieron no homogeneos durante este paso pero se limpiaron de forma significativa y hay muchas mas celulas formadoras de colonias al principio en este paso y estas celulas crecieron mas rapidamente que en el paso previo. Se capturaron imagenes a 4x, 100x, 200x en el dia 6. Se cosecharon cultivos en el dia 6.
Se sembraron celulas del paso 2 a 100 celulas/cm2 en dos matraces recubiertos con fibronectina de T225 cm2 en 36 ml de medio tipo n° 1 y de medio tipo n° 2 para cada una de las seis regiones. Se alimentaron los cultivos con 100% de medio fresco en el dia 5. Los cultivos permanecieron > 90% homogeneos. Se cosecharon los cultivos en el dia 6. Todos los cultivos mantenidos en medio tipo n° 2 se congelaron luego y no se expandieron mas. El cultivo mantenido en medio tipo n° 1 (es decir, progenitores neurales de hipocampo) se subcultivaron luego en el paso seis (a continuacion).
Se sembraron celulas del paso 3 a 100 celulas/cm2 en dos matraces recubiertos con fibronectina de T225 cm2 en 36 ml de medio tipo n° 1. Se alimentaron los cultivos con 100% de medio fresco en el dia 5. Los cultivos parecieron ser homogeneos en este paso. Se tomaron imagenes a 4x, 100x, 200x en el dia 6. Se cosecharon los cultivos en el dia 6.
Se sembraron celulas del paso 4 a 100 celulas/cm2 en dos matraces recubiertos con fibronectina de T225 cm2 en 36 ml de medio tipo n° 1. Se alimentaron los cultivos con 100% de medio fresco en el dia 5. Se tomaron imagenes a 4x, 100x, 200x en el dia 6. Se cosecharon los cultivos en el dia 6.
Fibroblastos. Se sembraron celulas de la digestion de pulmones de oveja a 100.000/cm2 y se sembraron tejido conectivo epidural a 50.000/cm2 en medio FGM-2. Se alimentaron cultivos con 50% de medio fresco cada 2 dias y se cosecho el paso 0 en el dia 5. Ambos cultivos se pasaron a menor densidad y los restos se congelaron y se conservaron.
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Se sembraron fibroblastos epidurales y de pulmon del paso 1 a 100/cm2 en medio FGM-2 en matraces T225cm2. Se alimentaron cultivos con 100% de medio FGM-2 fresco en el dfa 5 y se cosecharon en el dfa 7. Se pasaron cultivos de pulmon y se congelo y conservo el resto. Se congelaron y conservaron todos los fibroblastos epidurales.
Se sembraron fibroblastos de pulmon del paso 2 a 100/cm2 en medio FGM-2 en matraces T225 cm2. Se alimentaron los cultivos con 100% de medio FGM-2 fresco en el dfa 4 debido a que son pesados luego se cosecharon en el dfa 5. Se pasaron cultivos y el resto se congelo y conservo.
Se sembraron fibroblastos de pulmon del paso 3 a 100/cm2 en medio FGM-2 en matraces T225 cm2. Se alimentaron los cultivos con 100% de medio FGM-2 fresco en el dfa 5 y se cosecharon en el dfa 6. Se pasaron cultivos y el resto se congelo y conservo.
Condiciones de alto contenido en O? (metodo estandar). Se sembraron celulas de cada una de las seis regiones en cuatro matraces T25 cm2 y uno T80 cm2 (todos recubiertos con fibronectina) a 100.000/cm2 en 5 ml y 13 ml, respectivamente, de medio tipo n° 1 y medio tipo n° 2 y se incubaron en un incubador humidificado a 37° C con O2 al 18%, CO2 al 5% (condiciones estandar). Se alimentaron los cultivos con su respectivo medio en el dfa 5 luego se cosecharon 24 horas despues en el dfa 6. Se tomaron imagenes a 4x, 100x, 200x en el dfa 6 antes de la cosecha. Se contaron celulas de todas las regiones luego se congelaron y se conservaron.
Medio de transporte. Medio usado para almacenamiento de tejidos post-mortem y durante el transito. Componentes: DMEM de alto contenido en glucosa (Invitrogen); L-glutamina 4 mM (Hyclone); suero bovino fetal al 20% (Hyclone); solucion de aminoacidos no esenciales MEM, 1X (Invitrogen, catalogo n° 11140, 100X Soln., Lote n° 672555); penicilina (100 U/ml), estreptomicina (pg/ml), Ampho (pg/ml) (Stem Cell Technologies, Inc., catalogo n°, 100X Solution, Lote n°); gentamicina (50 pg/ml).
Medio de digestion
Cerebro: DMEM:F12 1:1 con alto contenido en glucosa: L-glutamina 4 mM; Dispasa (1 U/ml) (Roche, catalogo n° 04942086001); DNasa (250 U/ml) (Invitrogen, catalogo n° 18047-019); papafna (2,5 U/ml) (Sigma, Catalogo n° 76218); penicilina (100 U/ml), estreptomicina (pg/ml), Ampho (pg/ml) (Stem Cell Technologies, Inc., catalogo n°, 100X Solution); gentamicina (50 pg/ml) (Sigma);
Pulmon, epidural y hueso: DMEM de alto contenido en glucosa: L-glutamina 4 mM; colagenasa (300 U/ml)/hialuronidasa (100 U/ml) (Stem Cell Technologies); hialuronidasa (Stem Cell Technologies); penicilina (100 U/ml), estreptomicina (pg/ml), Ampho (pg/ml) (Stem Cell Technologies, Inc.); gentamicina (50 pg/ml).
Medio de cultivo. Cerebro:
a. Medio tipo n° 1. DMEM:F12 1:1 de alto contenido en glucosa; L-glutamina 4 mM; suplemento N2 (100X) lfquido (Invitrogen); penicilina (100 U/ml), estreptomicina (pg/ml), Ampho (pg/ml) (Stem Cell Technologies, Inc.,); gentamicina (50 pg/ml); factor de crecimiento epidermico, humano, recombinante 20 ng/ml (rh EGF) (Stem Cell Technologies); factor de crecimiento de fibroblasto basico, humano, recombinante 10 ng/ml (rh bFGF) (Stem Cell Technologies).
b. Medio de tipo n° 2: medio de proliferacion Neurocult NS-A. Medio basal Neurocult NS-A (humano), 450 ml (Stem Cell Technologies); suplementos de proliferacion Neurocult NS-A (humano), 50 ml (Stem Cell Technologies); penicilina (100 U/ml), estreptomicina (pg/ml), Ampho (pg/ml) (Stem Cell Technologies, Inc.,); gentamicina (50 pg/ml); factor de crecimiento epidermico, humano, recombinante 20 ng/ml (rh EGF) (Stem Cell Technologies); factor de crecimiento de fibroblasto basico, humano, recombinante 10 ng/ml (rh bFGF) (Stem Cell Technologies).
EJEMPLO 4
En un ensayo clfnico de tratamiento de pacientes con enfermedad de Parkinson con GM1, todas las valoraciones funcionales (durante el basal y todas las visitas subsiguientes) tuvieron lugar en la manana antes de que el paciente tome la primera dosis de medicacion anti-Parkinson y al menos 12 horas desde la dosis previa de medicacion (considerada que es un periodo definido en la practica como “off”). Todos los pacientes fueron ensayados en tres ocasiones por separado (dentro de un periodo de dos semanas) para la evaluacion basal en las siguientes medidas funcionales: (1) escala de valoracion unificada para la enfermedad de Parkinson ("UPDRS"), evaluado independientemente por un evaluador principal y un evaluador secundario; (2) tiempo de ejecucion: 20 pronaciones/supinaciones de las manos; 20 taconeos; 20 golpeteos con dedos pulgar e fndice; tiempo hasta tocar el pulgar secuencialmente con otros dedos 10 veces; tiempo para caminar 20 pies tan rapido como sea posible, girarse, y volver al punto de partida; valoracion del tiempo de reaccion simple; (3) ensayo de integracion sensorimotor en el que el paciente necesita producir movimientos especfficos basados solo en retroalimentacion somatosensorial y proprioceptiva. El ensayo se llevo a cabo en cuatro visitas consecutivas en el mes.
Se calculo una valoracion basal media para cada paciente y se uso para comparacion con valoraciones de
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tratamiento. La medida de eficacia principal fue el cambio en el componente motor de la UPDRS, una herramienta de evaluacion clinica convencional. El grupo tratado con GM1 (N = 22) mostro mejoras significativas en valoraciones motoras de UPDRS (mejora media de 5,05 puntos en la semana cuatro y 7,53 puntos en la semana 16) mientras que las valoraciones medias para el grupo tratado con placebo no cambiaron esencialmente en las 16 semanas de tratamiento. Los tamanos del efecto de tratamiento en la semana cuatro (-5,95 ± 1,12), semana ocho (-5,61 ± 1,39), semana 12 (-5,37 ± 1,30) y semana 16 (-6,79 ± 1,24) fueron estadisticamente significativos (ANCOVA, p < 0,0002). Las evaluaciones secundarias de la funcion motora mostraron que mientras ambos grupos cometian un numero similar de errores en la tarea de integracion sensorimotora en el basal (GM1 = 5,3 ± 2,3; placebo = 5,4 ± 3,1), pacientes tratados con GM1 cometieron significativamente menos errores tras 16 semanas de tratamiento (0,7 errores ± 0,8) que pacientes no tratados con placebo (5,1 errores ± 3,1, p = 0,0001). El grupo tratado con GM1 tambien llevo a cabo las tareas motoras previstas (es decir, pronacion/supinacion (p= 0,0001), taconeo (p = 0,0008), golpeteo con dedos (p = 0,0001), golpeteo con dedos secuencial (p = 0,0001), y caminar (p = 2,02) significativamente mas rapido en la semana 16, en comparacion con el basal, que los pacientes que fueron tratados con placebo. Al final de los 5 anos de uso abierto de GM1, los pacientes presentaban valoraciones motoras por UPDRS inferiores y se reportaron menos problemas con sus actividades en periodo “off” de la vida diaria que en el basal pre-aleatorizacion.
Una vez se complete el ensayo de la linea base los pacientes recibieron una infusion intravenosa de 1,000 mg de gangliosido GM1 o bien placebo (es decir, diluyente sin GM1) en 50 ml de solucion de Ringer esteril. Los pacientes fueron adiestrados para autoadministrarse una inyeccion subcutanea y se asentaron en el hogar con un suministro para cuatro semanas de gangliosido GM1 (100 mg de GM1 en 2,0 ml de vehiculo/vial) o bien placebo, proporcionados en viales de 2,0 ml identicos. Los pacientes fueron instruidos para administrar los contenidos de dos viales al dia, uno en la manana y otro en la tarde (dosis diaria total = 200 mg de GM1. Se mantuvieron constantes medicaciones concomitantes.
Referencias
1 Neeta S. Roy, y col. 2000. J Neurosci 59:321 -31.
2 Philip H. Schwartz, y col. 2003. J Neurosci; 74:838-51.
Claims (12)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un metodo de produccion basado en cultivo celular de gangliosido GM1 aislado que comprende las etapas de:a) obtener celulas productoras de GM1 derivadas de tejido que no es bovino ni porcino,b) expandir las celulas productoras de GM1 de la etapa (a) en cultivo,c) expresar gangliosido GM1 en las celulas productoras de GM1 de la etapa (b), yd) aislar gangliosido GM1 expresado en la etapa (c);en el que las celulas productoras de GM1 son celulas neurales, celulas de fibroblasto, celulas de tejido del nucleo cerebral o celulas progenitoras.
- 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las celulas productoras de GM1 de la etapa (a) sobreexpresan GM1.
- 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que las celulas productoras de GM1 se obtienen de tejido afectado con gangliosidosis GM1.
- 4. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, en el que dicho GM1 esta libre de contaminantes BSE.
- 5. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, en el que la etapa de expresion (c) comprende poner en contacto las celulas productoras de GM1 con bajas concentraciones de cloroquina.
- 6. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, en el que la etapa de expansion (b) se lleva a cabo usando condiciones de expansion de O2 inferiores.
- 7. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, en el que las celulas productoras de GM1 se derivan de tejidos de oveja o de humano.
- 8. Un metodo de preparacion de una composicion que comprende GM1 aislado que comprende las etapas de:a) obtener celulas productoras de GM1 derivadas de tejido que no es bovino ni porcino,b) expandir las celulas productoras de GM1 de la etapa (a) en cultivo,c) expresar gangliosido GM1 en las celulas productoras de GM1 de la etapa (b), yd) aislar gangliosido GM1 expresado en la etapa (c);en el que las celulas productoras de GM1 son celulas neurales, celulas de fibroblasto, celulas de tejido de nucleo cerebral, o celulas progenitoras.
- 9. El metodo de la reivindicacion 8 en el que las celulas productoras de GM1 son celulas humanas.
- 10. El metodo de la reivindicacion 8 o 9, en el que la composicion es una composicion farmaceutica.
- 11. El metodo de la reivindicacion 10, en el que la composicion farmaceutica es adecuada para administracion por la siguientes rutas de administracion: subcutanea, inyeccion, inyeccion intravenosa, administracion nasal y administracion mucosal.
- 12. El metodo de la reivindicacion 10 u 11, en el que la composicion farmaceutica es para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson y otros trastornos neurologicos.
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