CN115554317A

CN115554317A - 一种用于治疗肿瘤的药物组合物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115554317A
Application number: CN202110740353.5A
Authority: CN
Inventors: 唐凌峰
Original assignee: Shenzhen Maitang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Maitang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2023-01-03

Abstract

本发明提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，该药物组合物包括分离的具有生理活性的线粒体作为活性成分。同时，本发明还公开了包括上述药物组合物的试剂盒。本发明的另一方面公开了分离的线粒体在制备用于治疗肿瘤的药物、药物组合物或试剂盒中的应用，以及一种治疗肿瘤的方法。本发明设置不同给药方式（如腹腔注射IP、肌肉注射IM、皮下注射SC）、给药剂量，移植活性线粒体和灭活线粒体对肿瘤小鼠进行治疗，发现移植自体或异体来源的活性线粒体能够延长小鼠生存期达30‑50%，具有显著的治疗效果。

Description

一种用于治疗肿瘤的药物组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种用于治疗肿瘤的药物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

癌症习惯上是作为恶性肿瘤的俗称，是当代威胁人类生命健康的主要疾病之一。据统计2018年全球新发癌症例数1810万，死亡例数960万，死亡率高达53%。目前认可度比较高的癌症死因有以下几种：1. 病菌感染。癌症患者往往营养不良，而且在接受化疗或放疗后，导致机体免疫力下降，使体内原本不致病的细菌等微生物变为致病菌，导致不可控制的感染而死亡。2. 器官衰竭。癌症患者因为长期营养不良导致多器官功能衰竭而死。3. 重要脏器的损伤。如果肿瘤原发在大脑等重要脏器上，或者由于恶性肿瘤的转移，癌细胞直接侵袭并对大脑或者呼吸和循环系统等造成损伤，可直接导致死亡。

而本发明人认为，癌症的死因除了肿瘤直接原位影响脏器的功能结构外，最直接的死因是机体重要脏器能量供应不足引起的。癌细胞生长和分裂迅速，高水平的代谢活动需要消耗大量的能量。由于肿瘤细胞消耗过多能量，导致正常细胞内能量供应不足，最终导致死亡。

线粒体作为真核细胞进行有氧呼吸的主要细胞器，是提供能量的主要场所。线粒体起源于15亿年前的古细菌，因此具有类似于细胞内细菌的“感染能力”。分离的线粒体在体外和细胞共培养时，线粒体可以高效地进入细胞内。基于此，本发明人从机体供能的角度出发，直接给癌症患者提供外源的健康的线粒体，线粒体可转移到正常细胞，恢复机体的正常能量水平。

发明内容

具体的，本发明提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包括分离的具有生理活性的线粒体作为活性成分。根据本发明的药物组合物通过注射等方式进入癌症患者体内的非肿瘤细胞，直接恢复患者机体的供能水平，延长患者的生存期，从而达到治疗的目的。

在根据本发明的药物组合物中，所述线粒体的来源为自体、同种异体或异种异体及其组合。

在一些具体实施例中，所述线粒体的来源为同种异体。在另一些具体实施例中，所述线粒体的来源为自体或异种异体及其组合。

在一些实施例中，所述线粒体是由细胞或组织中分离提取的。其中，所述细胞或组织可以是非人哺乳动物（如小鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛以及高等灵长类动物）的细胞或组织，也可以是人体的细胞或组织。

细胞可以是选自体细胞、生殖细胞、干细胞及其组合中的任何一种。例如，线粒体可以是从体细胞、生殖细胞或干细胞获得的线粒体。此外，线粒体可以是从线粒体生物活性正常的细胞获得的正常线粒体。另外，线粒体可以是体外培养的线粒体。

组织包括但不限于心、肝、脾、肾、脑及其组合。在一些具体实施例中，所述线粒体是由心、肝、脾、肾及其组合的组织中提取分离的。

在一些实施例中，根据本发明的药物组合物除线粒体外，还包括有溶媒。

在一些实施例中，所述药物组合物中线粒体的浓度为0.1μg/ml至900mg/ml。例如，所述药物组合物中线粒体的浓度可以为0.1μg/ml、0.15μg/ml、0.6μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、300mg/ml、500mg/ml、700mg/ml或900mg/ml。

在一些实施例中，所述药物组合物中的溶媒包括生理盐水、磷酸缓冲液、培养液、组织液、带有药物性质的磷脂或氨基酸溶液及其组合。

在一些实施例中，所述药物组合物还包括有稳定剂。所述稳定剂包括葡萄糖、蔗糖、胎牛血清、ADP、ATP、氨基酸、丙三醇、丙二醇、甘胆酸钠、胆固醇、甘露醇、白蛋白或枸橼酸钠及其组合。

在一些实施例中，所述药物组合物还包括其他具有疾病治疗作用的活性制剂。所述活性制剂可以是用于协同治疗肿瘤的制剂，或是用于治疗其他疾病的制剂。

在一些实施例中，所述药物组合物还包括抗生素、抗病毒药、抗真菌药、糖皮质激素、胰岛素、抗体药物、化疗药物中的一种或多种。

本领域的技术人员应该了解根据需要选择溶媒，包括生理上可接受的化合物，依据组合物的给药途径进行选择适合的载体和它们的配方是本领域的技术人员所熟知的。

本发明的另一实施例提供了一种用于治疗肿瘤的试剂盒，包括如上所述的药物组合物。

本发明的另一实施例提供了线粒体在制备用于治疗肿瘤的药物、药物组合物或试剂盒中的应用。

所述线粒体作为制备用于治疗肿瘤的药物、药物组合物或试剂盒的特征要求与上述药物组合物和试剂盒中的描述一致，不再赘述。

本发明的另一实施例提供了一种治疗肿瘤的方法，包括以下操作步骤：

给患者施用包括分离的具有生理活性的线粒体作为活性成分的药物组合物。

在一些实施例中，所述药物组合物的给药方式包括静脉注射、动脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服、舌下含服、外用、吸入和通过口腔、眼睛、泌尿生殖系统粘膜给药及其组合。

在一些实施例中，所述治疗肿瘤的方法还包括其他对症支持疗法，所述其他对症支持疗法包括补液、强心、升压、吸氧、辅助通气、肠内营养支持、肠外营养支持、心电监护及其组合。

发明与现有技术的对比

临床上常用的癌症治疗方法有手术治疗、化疗、放疗以及细胞免疫治疗。这些治疗方法最根本的原理就是通过人为的方法直接清除癌细胞。但在面对恶性肿瘤时，往往无法将癌细胞全部灭杀，使得病情反复。而且放疗、化疗对人体的副作用大，并不是理想的治疗方法。

而本发明将分离的线粒体作为药物治疗癌症的主要优点有：

1）从根本上解决了能量不足致死的问题；

2）线粒体可从同种异体的细胞中提取，属于天然药物，毒副作用小，进入患者体内不会发生或仅有微弱的免疫排斥的反应；

3）由于线粒体自身的特性，很容易进入细胞内发挥作用；

4）线粒体获取简单。

术语

在本发明的描述中，术语“分离提取”是指线粒体或含线粒体组合物(例如，细胞质)，已从其天然生物环境中物理地分离或移出。分离的线粒体或含线粒体组合物可以在分离过程中纯化，也可以不必是纯化的。

术语“自体”是指从同一生物体获得的生物组合物。

术语“同种异体”是指同一种属中的不同基因型生物体。

术语“异种异体”是指不同种属中的不同基因型生物体。

术语“肿瘤”是指细胞增长失控和/或死亡减低所导致的形成肿块/非肿块的疾病，包括但不限于肺癌、乳腺癌、肠癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、甲状腺癌、肝癌、白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、各种肉瘤。

术语“具有生理活性的线粒体”指代能够进行基本生理活动如能量转化的线粒体，也包括在一定条件下休眠但生理活性未被破坏的线粒体。作为示例，线粒体的生理活性可通过线粒体体外呼吸速率来测定，同时也可采用其他评估线粒体生理功能的各种体外方法，包括分光光度酶测定、ATP产生的生物发光测量、MitoTracker 染色强度、JC-1染色等。例如，线粒体蛋白的各种特异性抗体可用于免疫细胞化学和 Western免疫印迹分析，这些抗体包括ATP合成酶亚单位，细胞色素c和细胞色素c氧化酶，PGC-1和TFAM。可以使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用Western免疫印迹法来分析线粒体蛋白的含量。

附图说明

图1是分离的线粒体灭活前（A）和经酒精灭活（B）或三次冻融灭活（C）后的Mitotracker Red染色图。

图2 是昆明小鼠颈部皮下注射4T细胞（小鼠乳腺癌）200万/10g，18天后的成瘤情况（A）和昆明小鼠右侧大腿皮下注射RM1细胞（小鼠前列腺癌细胞）200万/10g，14天后，对照组（B）和治疗组（C）的情况。

图3是分离的线粒体治疗乳腺癌小鼠的生存曲线图。

图4是分离的线粒体治疗前列腺癌小鼠的生存曲线图。

图5是分离的线粒体治疗胃癌小鼠的生存曲线图。

图6是分离的线粒体治疗肠癌小鼠的生存曲线图。

具体实施方案

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

肿瘤小鼠模型的构建

肿瘤细胞均为鼠源性肿瘤细胞，包括4T1、RM1、MFC、CT26等细胞。构建肿瘤模型的方式有腹腔注射构建肿瘤小鼠，皮下注射构建大腿皮下荷瘤小鼠或颈部皮下荷瘤小鼠。细胞用相应的完全培养基配制成4.0×10⁷个/mL，注射的剂量为2.0×10⁶个/10g，选用的小鼠为昆明小鼠。

活性线粒体的提取

内脏提取线粒体：颈椎脱臼法处死小鼠后，取心、肝、脾、肾于50mL离心管中，以20mL/只加入1×PBS（磷酸缓冲盐溶液），再根据体积加入终浓度为5mM EDTA（乙二胺四乙酸）和终浓度为0.2mM PMSF，于均质机中以6000rpm匀浆2min。匀浆后在1015g，4℃下离心10min。取上清，在14600g，4℃下离心10min。弃上清，沉淀滤干后称重，直接或灭活后用含有10%FBS和7×PSA（细胞培养所用的三抗，含有青霉素G钠盐700U/mL, 硫酸链霉素700μg/mL,两性霉素B 1.75μg/mL）的DMEM高糖培养基配置成线粒体溶液。

线粒体灭活处理

乙醇灭活：在上文线粒体提取步骤中14600g，4℃下离心10min后，弃上清，沉淀滤干后称重，根据重量加入5倍1×PBS，以此体积50%的量加入75%乙醇混匀，室温下放置5min，然后以14600g离心10min，弃上清，沉淀滤干后称重，根据重量用含有10%FBS和7×PSA的DMEM高糖培养基配置成500mg/mL灭活线粒体（Inactivated Mitochondria，IAM）溶液。

冻融法灭活：将上文线粒体提取步骤中提取的活性线粒体溶液，置于-80℃冰箱或室温，反复冻融3次，即得到灭活的线粒体溶液。

线粒体给药对癌症小鼠的治疗效果的监测实验

方法：通过皮下注射或腹腔注射肿瘤细胞构建小鼠肿瘤模型后， Treatment组通过腹腔注射、皮下注射、肌肉注射等方式注射活性线粒体溶液，Control组腹腔注射、皮下注射、肌肉注射等方式注射灭活的线粒体溶液。连续观察直至小鼠全部死亡，记录小鼠存活情况。

实施例 1

按照上述方法从昆明小鼠心、肝、脾、肾等脏器提取线粒体，部分线粒体灭活，配成5%（质量/体积浓度）的线粒体悬浮液。使用MitoTracker Red染色（稀释倍数1:5000）观察，MitoTracker Red通过线粒体膜电位进入且存留于线粒体基质，信号强表示线粒体活性好，无信号表示线粒体膜电位丧失，是线粒体灭活的表现。结果见图2，其中A为活性线粒体，B为酒精灭活的线粒体，C为冻融3次灭活的线粒体。可见活性线粒体的荧光亮点比两种方法灭活的线粒体亮且多，而且B和C几乎不可见亮点，表明酒精和冻融3次都能几乎完全灭活线粒体。

实施例2

取24只健康的雌性的昆明小鼠，体重范围在20-26g，将其随机分成对照组和治疗组，每一对对照组小鼠和治疗组小鼠体重相差不超过1g。体外培养的4T1细胞（小鼠乳腺癌细胞）以完全培养基（10%FBS，1xPSA的RPMI 1640）配成4000万/ml的细胞悬浮液，颈部皮下注射0.05ml/10g。注射18天后的成瘤情况见图1（A）。注射6天后开始腹腔注射50%的有活性的或者灭活的线粒体0.1ml/10g，间隔1-2天给药一次，每周3次，连续两周。每天观察小鼠存活情况直至全部死亡，结果示于图3中，可见治疗组比对照组的生存期延长30%左右。

实施例3

取40只健康的雄性的昆明小鼠，体重范围在20-26g，将其随机分成对照组和治疗组，每一对对照组小鼠和治疗组小鼠体重相差不超过1g。体外培养的RM1细胞（小鼠前列腺癌细胞）以完全培养基（10%FBS，1xPSA的DMEM高糖培养基）配成4000万/ml的细胞悬浮液，右侧大腿皮下注射0.05ml/10g。注射4天后开始腹腔注射50%的有活性的或者灭活的线粒体0.1ml/10g，间隔1-2天给药一次，每周3次，持续4周。每天观察小鼠存活情况直至全部死亡，结果示于图2和图4中。图2（B）为对照组小鼠，可见毛发粗乱，全身有较多的皮肤转移灶，（C）为治疗组，可见毛发光滑，身上很少皮肤转移灶。图4可见治疗组比对照组的生存期延长50%左右。

实施例4

取24只健康的雄性的昆明小鼠，体重范围在20-26g，将其随机分成对照组和治疗组，每一对对照组小鼠和治疗组小鼠体重相差不超过1g。体外培养的MFC细胞（小鼠胃癌细胞）以完全培养基（10%FBS，1xPSA的RPMI 1640）配成4000万/ml的细胞悬浮液，腹腔注射0.05ml/10g。注射4天后开始皮下注射50%的有活性的或者灭活的线粒体0.1ml/10g，间隔1-2天给药一次，每周3次，持续3周。连续观察小鼠存活情况直至全部死亡，结果示于图4中，可见治疗组比对照组的生存期延长50%左右。

实施例5

取24只健康的雄性的昆明小鼠，体重范围在20-26g，将其随机分成对照组和治疗组，每一对对照组小鼠和治疗组小鼠体重相差不超过1g。体外培养的CT26细胞（小鼠结肠癌细胞）以完全培养基（10%FBS，1xPSA的RPMI 1640）配成4000万/ml的细胞悬浮液，腹腔注射0.05ml/10g。注射4天后开始肌肉注射20%的有活性的或者灭活的线粒体0.05ml/10g，间隔1-2天给药一次，每周3次，持续3周。每天观察小鼠存活情况直至全部死亡，结果示于图5中，可见治疗组比对照组的生存期延长40%左右。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包括分离的具有生理活性的线粒体作为活性成分。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分离的线粒体的来源为自体、同种异体或异种异体及其组合。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分离的线粒体的来源为同种异体。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分离的线粒体是由细胞或组织中分离提取的，所述细胞包括体细胞、生殖细胞、干细胞及其组合，所述组织包括心、肝、脾、肾、脑及其组合。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述分离的线粒体是由心、肝、脾、肾及其组合的组织中分离提取的。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括有溶媒。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述分离的线粒体的浓度为0.1μg/ml至900mg/ml。

8.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物中的溶媒包括生理盐水、磷酸缓冲液、培养液、组织液、血浆、血清、带有药物性质的磷脂或氨基酸溶液及其组合。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括抗生素、化疗药、蛋白质药物中的一种或多种。

10.一种用于治疗肿瘤的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的药物组合物。

11.分离的线粒体在制备用于治疗肿瘤的药物、药物组合物或试剂盒中的应用。

12.一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

给患者施用包括含有分离的且具有生理活性的线粒体作为活性成分的药物组合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述药物组合物的给药方式包括静脉注射、动脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射、口服、舌下含服、外用、吸入和通过口腔、眼睛、泌尿生殖系统粘膜给药及其组合。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述药物组合物的施用部位为除实体肿瘤组织以外的部位。

15.根据权利要求1或权利要求10-12所述的肿瘤为所有的恶性肿瘤。

16.根据权利要求1或权利要求10-12所述的肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、肠癌、胃癌。