KR102446146B1

KR102446146B1 - 근육 유래 미토콘드리아를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102446146B1
Application number: KR1020200143853A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 박성환; 최종영; 김석중; 이선영; 문정현; 이아람; 나현식; 조근형; 황선희
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-09-23
Also published as: KR20210052366A

Abstract

본 발명에 따른 근육 유래 미토콘드리아는, 골관절염 동물모델, 뇌척수염 모델, 쇼그렌 증후군 동물모델 및 이식거부반응 모델에서도 염증성 사이토카인 및 Treg/Th17 세포의조절능을 갖어, 이를 다양한 염증성 질환 또는 면역질환에 이용가능하다.

Description

근육 유래 미토콘드리아를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING INFLAMMATORY DISEASE COMPRISING MITOCHONDRIA ISOLATED FORM MUSCLE}

본 발명은 근육 유래 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염, 이식거부질환, 쇼그렌증후군 및 신경계 자가면역질환과 같은 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

미토콘드리아는 세포 내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포사멸 뿐만 아니라, 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다. 미토콘드리아는 자신의 유전체를 보유하고 있으며, 세포의 에너지 대사에 중추적 역할을 하는 소기관이다. 미토콘드리아는 전자 전달 및 산화적 인산화 과정을 통해 에너지를 생산하며, 세포사멸 신호 전달 경로에 관여하는 등 중요한 역할을 한다.

미토콘드리아의 기능 저하에 의한 에너지 생산 감소는 다양한 질병을 유발하는 것으로 보고된 바 있다. 미토콘드리아 유전체 및 단백체의 변이에 따라 전자전달연쇄반응의 기능이 저하될 경우, ATP 생산 감소, 활성산소 과다 생성, 칼슘 조절 기능의 저하 등이 일어나게 된다. 이러한 경우 미토콘드리아의 막 투과성에 변화가 일어나 세포사멸의 기능이 비정상적으로 일어나게 되고 이에 따른 암 및 난치성 질환이 야기될 수 있다.

이와 같이 미토콘드리아 기능 이상에 의해 발생하는 인간 질병으로는 미토콘드리아 관련 유전병(Wallace DC 1999), 당뇨병(Maechler P 2001), 심장질환(Sorescu D 2002), 파킨슨병이나 알츠하이머병 등과 같은 노인성 치매(Lin MT 2006), 그리고 각종 암의 발생(Petros JA, 2005)과 암전이(Ishikawa K, 2008) 등이 보고된 바 있다. 또한, 200여종 이상의 다양한 암에서 공통적으로 발견되는 특징은 세포사멸(apoptosis) 기능의 손상, 염증반응의 증가, 그리고 비정상적인 대사 작용의 증가로 이루어졌다. 또한, 현재 미토콘드리아와 면역질환과의 관련성에 대한 연구가 진행되고 있다.

미토콘드리아 내부에 세포사와 밀접한 관계를 갖는 신호전달기전들이 존재하고 이들 신호를 해석하고 제어할 수 있다면 질병치료에 응용할 수 있다 (Biochimica et Biophysica Acta, 2006; Cell, 2005; Trends Biochem Sci, 2005; Nature Med, 2005; Nature, 2005; J Clin Invest, 2005; Heart Lung Circ, 2005; J Nat Cancer Inst, 2005, Science, 2005). 미토콘드리아 기능저하는 단일한 증상이나 질병이 아닌 인체내 다양한 기관에서 다양한 질병으로 나타날 수 있어, 병든 미토콘드리아와 연관된 병소 및 질병 특이적이 치료법의 가능성이 제기되고 있으나 현재까지 정확한 타깃이나 합당한 치료기술 개발이 시급한 상태이다. 특히 세포내 증가한 활성산소종으로 인한 산화스트레스의 증가는 최근 심혈관·대사질환은 물론 퇴행성신경 질환에서의 세포학적·분자생물학적 근본 기전으로 제시되고 있으나, 현재까지 임상 및 전임상 단계에서 사용되는 대사성치료제 또는 항산화제 치료는 효과는 아직 논란의 여지가 있다. 미토콘드리아 기능을 직접 제어할 수 있는 막단백질 및 기질 단백질의 발현을 조절할 수 있는 미세표적화치료(micro-targetingtherapy)로서의 유전자 치료법은 영구적 또는 반영구적 치료법으로서 가능성이 높은 전략이다.

따라서 면역 조절 뿐만 아니라 감염, 미토콘드리아 기능 향상을 통한 면역 조절 세포 기능 강화등을 조절 하는 면역 조절제 및 치료법 개발이 필요하다. 또한 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 염증면역질환 치료제 및 치료방법의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 면역질환은 면역계의 구성성분들이 병리상태를 야기하거나, 매개 또는 기타 공헌하는 질환을 의미하는데, 특히 염증성 장애는 전 세계적으로 가장 중요한 건강 문제 중 하나이다. 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대한 신체 조직의 국소화된 보호 반응을 말한다. 염증의 원인으로는 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품; 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역적 반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태 등이 있다.

염증은 통증, 적화현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실 등의 증상을 그 특징으로 한다. 이들 증상은 면역계의 세포 사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 세포의 반응으로 인해 결과적으로 여러 그룹의 염증 매개자[단백질(예를 들면, 사이토카인, 효소(예를 들면 프로테아제, 퍼옥시다제), 주요 염기성 단백질, 점착 분자(ICAM, VCAM), 지질 매개자(예를 들면, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트라이엔, 혈소판 활성화 인자(PAF)), 반응성 산소 종(예를 들면, 하이드로퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드 음이온, 산화질소(NO)의 상호작용 네트워크가 생성된다. 그러나 이들 매개자 중 대부분은 또한 정상적인 세포 활성의 조절자이다. 따라서 염증 반응의 결핍으로 인해 숙주가 제어되지 않으면서 손상(즉, 감염)되고, 따라서 만성 염증으로 인해 부분적으로는 상기 언급된 매개자 중 여럿이 과다 생성됨으로써 매개되는 염증성 질환이 야기된다.

또한, 면역질환 중 하나인 자가면역 질환은 면역 체계가 그 자신의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이러한 반응들은 T 림프구에 의한 자가항원(auto-antigen)의 인식에 기인하며, 이로 인하여 체액상(자가항원 생성) 및 세포상(림프구 및 대식세포 세포독성 활성 증가) 면역 반응이 유발된다. 자가면역질환으로는 류마티스성 질환, 건선, 전신성 피부근염, 다발성 경화증, 홍반성 낭창, 또는 항원에 의한 면역반응악화, 즉, 천식, 약물 또는 음식에 대한 알레르기 등이 있다. 이러한 질환들은 모두 제한성이고 만성인 질환들이며, 경우에 따라서는 치명적이고, 현재까지 상기 질환들을 치료할 수 있는 효과적인 치료 방법이 존재하지 않는 실정이다. 그러므로 당해 질환의 진행 중에 질환을 경감시키거나 완화시킬 수 있는 약물, 의약 또는 매체라면 환자의 건강을 위해서 중요한 해결 수단이 된다고 할 것이다.

자가면역 질환의 치료방법을 탐색하여 적당한 약물과 방법을 찾고자 집중적인 노력을 해왔다. 오늘날 자가면역질환의 치료는 주로 면역억제 약물, 예컨대 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitors) 및 증식억제제-대사물 작용 억제제(antiproliferatives-antimetabolites)의 사용을 기반으로 한다. 그러나 이와 같은 약물은 다양한 표적들에 대하여 작용하므로 전체적으로는 면역기능을 저하시킬 수 있다. 또한, 이러한 약리 요법을 장기간 사용할 경우 여러 세포 독성 작용이 나타날 수 있으며, 면역 체계를 비특이적인 방식으로 억제함으로써 환자를 감염증 또는 암에 걸리게 할 수 있다. 칼시뉴린과 글루코코르티코이드는, 그들의 신독성과 당뇨병 유발 특성에 기인하여 또 다른 문제점을 나타내기 때문에, 몇 가지 임상학적증상의 경우(예: 신기능 부전, 당뇨병 등)에는 그 사용이 제한된다. 따라서 자가면역질환, 염증질환 등과 같은 면역질환을 치료할 수 있는 물질로서, 부작용이 없으면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-1723265호

본 발명은 근육 유래 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염, 이식거부질환, 쇼그렌증후군 및 신경계 자가면역질환과 같은 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

따라서, 본 발명은 근육으로부터 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, IL-17이 매개하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 면역질환 또는 염증성 질환은 골관절염, 이식거부반응, 쇼그렌 증후군 및 자가 신경계 자가면역질환으로부터 선택된 1종 이상의 질환일 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 상기 골관절염은

1)IL-1β, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포의 수가 증가;

2)COX4가 감소된 상태;및

3)비장 조직 내의 Th17 세포가 증가된 조건을 갖는 골관절염일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 이식 거부 반응은 세포, 혈액, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응일 수 있다.

상기 이식 거부 반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 거부 반응일 수 있다.

상기 이식 거부 반응은 이식편대숙주병(GVHD,graft-versus-host disease)인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 신경계 자가면역질환은 다발성경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 급성 파종성뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 상행성 척수염(ascending myelitis), 중심성 척수염(central myelitis), 하행성 척수염(descending myelitis) 횡단성 척수염(transverse myelitis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmuneuveitis), 자가면역성뇌증(autoimmune encephalopathy), 뇌척수염(encephalomyelitis) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 근육 유래 미토콘드리아는, 골관절염 동물모델, 뇌척수염 모델, 쇼그렌 증후군 동물모델 및 이식거부반응 모델에서도 염증성 사이토카인 및 Treg/Th17 세포의 조절능을 조절 능을 가져, 이를 다양한 염증성 질환 또는 면역질환에 이용가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아에 의한 골 관절염 환자의 통증 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아가 투여된 군에서의 safranin o 염색 이미지 및 임상적 관절염 평가지수를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아가 투여된 동물에서 IHC 염색 이미지 및 IL-1β, MMP13, MCP1 및 cox4의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 동시 조절 능력을 확인한 분석 결과이다
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아에 의한 TH17 세포 조절 능력을 확인한 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아 투여에 의한 IL-17/IL-10 동시 조절 능력을 확인한 분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아 투여에 의한 골관절염 연골세포의 대사인자 조절 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아 투여에 의한 뇌척수염등 신경계 자가면역질환에 대한 치료효과를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 근육 유래 미토콘드리아 투여에 의한 쇼그렌 증후군의 치료효과를 확인한 도이다.

이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

근육으로부터 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, IL-17이 매개하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 미토콘드리아는 포유동물로부터 수득된 것일 수 있으며, 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 세포 또는 세포 배양액으로부터 분리된 것일 수 있다. 다만, 미토콘드리아는 근육 조직 또는 근육 세포에서 분리되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있고, 환자 유래의 미토콘드리아 일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 것일 수 있다.

한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.

상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고원심분리를 하여 수행할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상청액을 제조하는 단계 및 상기 상청액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.

또한, 상기 미토콘드리아는 세포를 배양한 후 얻어진 배양액 내에서 수득할 수 있다. 이러한 배양액에는 세포가 분비한 사이토카인, 케모카인, 엑소좀 및 미세소포체 등과 미토콘드리아가 포함될 수 있다. 일 구체예로, 상기미토콘드리아 분리는 세포를 배양하고, 얻어진 배양액을 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 세포잔해 등을 제거하고 상청액을 수득하는 단계, 상기 상청액을 제2차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 원심분리 횟수 및 샘플의 함량에 따라 적절히 조정될 수 있다.

상기 근육 유래 미토콘드리아는 골관절염 환자의 근육으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물에 의해 골관절염의 상황을 악화시킨다고 알려진 인자인 IL-1β, MMP13, MCP1 등을 발현하는 세포들의 수가 감소되어 골관절염의 증상을 완화시키고 개선할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에 의해 Mitochondria의 양을 측정하는 cox4가 증가하여, 미토콘드리아의 활성화에 의해 골관절염을 개선할 수 있다.

상기 조성물에 의해 TH17/Treg 세포의 발현이 동시에 조절되어 Treg 세포는 증가하는 반면 TH17의 발현은 감소될 수 있다.

상기 조성물에 의해 IL-17/IL-10의 발현이 동시 조절되어, IL-17은 감소하고 IL-10은 증가할 수 있다.

상기 근육 유래 미토콘드리아는 염증성 인자 발현 면역 세포 침윤을 감소시키고, IL-17 발현 염증성 Th17 세포의 활성을 감소시켜, 관절 염증뿐만 아니라 전신 면역 시스템 병인 조절을 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 근육 유래 미토콘드리아는 연골 세포의 대사 인자의 활성을 저해하여, 연골세포 손상/ 연골 조직 손상을 제어할 수 있어 관절을 보호할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

따라서, 본 발명의 근육 유래 미토콘드리아는

1)IL-1β, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포의 수가 증가;

2)COX4가 감소된 상태;및

3)비장 조직 내의 Th17 세포가 증가된 조건을 갖는 골관절염에 대한 치료효과를 갖을 수 있다.

본 발명의 용어, "이식 거부(transplantation rejection)"는 이식 후 이식된 조직을 수여자의 면역체계가 비자기(non-self)로 인식하여 이식된 장기를 공격하여 제거하고자 하는 반응을 장기 이식 거부라 한다. 이식 거부에 관여하는 가장 중요한 요인은 major histocompatibility complex(MHC) 이고, minor histocompatibility complex 또한 관련이 있다고 알려져 있다. 거부반응은 세포매개면역(cellmediated immune response)와 체액 면역(humoral immune response)이 모두 관여한다. 세포매개반응의 경우 수용자의 림프구가 이식장기의 공여자 MHC를 만나(CD4 T cell-type II MHC molecule, 혹은 CD8 T cell-type I MHC molecule) 시작된다. 활성화된 T 세포는 cytokine을 분비, 혈관의 투과성이 증가되고, macrophage 등의 monocytes의 침윤을 일으키게 된다. 그 결과 미세혈관의 손상, 조직 허혈, 이식조직의 및 세포의 파괴가 일어나게 된다.

상기 이식 거부 반응은 세포, 혈액, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응이고, 바람직하게는 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.

이식 거부 반응은 이식편대숙주병(GVHD, graft-versus-host disease)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

쇼그렌 증후군은 눈물샘과 침샘 등에 염증세포가 침윤되어 원인불명의 만성염증이 발생하는 자가면역 질환이다. 이 질환은 우리 몸의 신체 방어 시스템인 면역체계의 조절이 상실되어 발생하는 것으로 알려져 있다. 이로 인해 몸의 습도를 유지하는 분비선인 눈물샘, 침샘 등에 염증세포가 침윤되어 정상세포가 파괴되면서 더 이상 그 기능을 유지할 수 없게 된다.

본 발명에서 신경계 자가면역질환은 다발성경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 급성 파종성뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 상행성 척수염(ascending myelitis), 중심성 척수염(central myelitis), 하행성 척수염(descending myelitis) 횡단성 척수염(transverse myelitis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmuneuveitis), 자가면역성뇌증(autoimmune encephalopathy) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 이루어진 군이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 조성물은 골관절염, 이식거부질환, 쇼그렌 증후군 및 신경계 자가면역질환 같은 염증질환 또는 면역질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는, 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 골관절염, 이식거부질환, 쇼그렌 증후군 및 신경계 자가면역질환 예방 또는 치료용 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골관절염, 이식거부질환, 쇼그렌 증후군 및 신경계 자가면역질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 치료 방법은 상기 골관절염, 이식거부질환, 쇼그렌 증후군 및 신경계 자가면역질환을 예방 또는 치료용 조성물은 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 근육 유래 미토콘드리아의 제조

골관절염 환자로부터의 관절 근육 조직을 IBM buffer상에서 잘게 자르고 100um 필터로 조직 부산물을 여과한 후, 4℃에서 3분간 200g으로 원심분리하였다. 펠렛은 IBM buffer에 현탁하고 Homogenizer를 이용하여 세포막을 터트렸다. 그런 다음 원심분리하여 미토콘드리아 펠렛을 수득하였다(reference: Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements).

실시예 2. 근육 유래 미토콘드리아의 골관절염의 치료 효과 확인

1. 통증 수치 개선 및 관절염 지수 확인

본 발명자들은 근육 유래 미토콘드리아의 골관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 골관절염이 유발된 동물모델에 상기 근육 유래 미토콘드리아를 주입한 후 치료 효과를 분석하는 실험을 수행하였다.

동물모델에게 MIA 유도 후, 하루 뒤에 MIA 모델의 관절강으로(i.a) 실시예 1에서와 같이 분리한 근육 유래 미토콘드리아를 10ug/100ul의 농도로 주 1회 총 3주간 관절강내로 주입하였다. weight bearing 평가는 MIA 유도 후부터 평가하였으며, 주 1회 측정하였다.

그런 다음, MIA 유도 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 관절의 연골을 safranin O 염색하여 관절 연골 조직의 손상정도를 조직 분석하였다.

그 결과, 골관절염이 유도된 마우스에 근육 유래 미토콘드리아를 주입한 경우 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 통증수치와 weight bearing이 개선됨을 확인하였다(도 1). 또한, 골관절염이 유도된 마우스에 근육 유래 미토콘드리아를 주입한 경우 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 조직이 개선되고 임상적 관절염 지수가 낮아짐을 확인하였다(도 2).

2. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 골관절염 관련 인자 억제 효과

본 발명자들은 골관절염이 유도된 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아에 의하여 항체 조절 효과를 있는지 확인하는 실험을 수행하였다.

동물모델에게 MIA 유도 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 관절 시노비움 조직 내의 염증성 인자 발현 면역 세포 침윤을 분석하기 위해 IHC 면역 염색하였다. 각 특이적 항체를 이용하여 시노비움 조직내에 IL-1β, mmp13, mcp-1, cox4 발현 세포를 분석하였다.

그 결과, 근육 유래 미토콘드리아가 주입된 마우스에서는 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 골관절염의 상황을 악화시킨다고 알려진 인자인 IL-1β, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포들의 수가 감소하여 침윤이 감소되었다(도 3). 또한, 미토콘드리아의 양을 측정하는 마커인 cox4는 오히려 근육 유래 미토콘드리아 주입 그룹에서 증가를 보였으며(도 3), 이는 증가된 미토콘드리아로 인한 효과인 것으로 생각된다.

3. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 조절 효과

본 발명자들은 골관절염이 유도된 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아에 의하여 TH17/Treg 세포가 제어되는지를 분석하였다.

동물모델에게 MIA 유도한 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 각 동물모델의 비장 조직에서 세포를 분리하여 Th17, Treg 세포 활성을 유세포 분석하였다. 유세포 분석을 위해서 CD4-PerCP, IL-17 APC, Foxp3-ECD, CD25-FITC 염색한 후, 염색된 세포를 유세포 분석하였다.

그 결과, MIA 유도된 골관절염 동물모델의 비장 조직내에 IL-17을 발현하는 Th17 세포의 활성이 증가되었으며, 근육 유래 미토콘드리아의 관절강 주입에 의해서 IL-17 발현 염증성 Th17 세포의 활성이 비장 조직 내에서 감소됨을 확인하였다(도 4). 이러한 결과는 근육 유래 미토콘드리아에 의해 관절 염증뿐만 아니라 전신 면역 시스템 병인 조절을 할 수 있음을 시사하는 것이다.

4. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 IL-17/IL-10 동시 조절 효과

골관절염 연골세포를 24 well plate에 3x10⁵cells로 접종한 후, 실시예 1에서와 같이 분리한 근육 유래 미토콘드리아 5ug을 1일간 공조배양하고, RNA 시료를 수득하였다. 수득한 RNA는 cDNA로 합성한 후, 연골세포의 대사 인자(Catabolic marker)인 MMP1, MMP3, MMP13을 QPCR을 이용하여 mRNA level에서의 양을 측정 및 분석하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 근육 유래 미토콘드리아 의해서 연골 세포의 대사 인자의 활성이 저해됨을 확인하였으며, 이러한 결과로부터 근육 유래 미토콘드리아가 연골세포 손상/연골 조직 손상을 제어할 수 있는 것임을 알 수 있었다.

실시예 3. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 이식 거부 질환 치료효과 확인

이식질환 환자와 일반인의 혈액 세포(PBMC)와 근육 유래 미토콘드리아를 3일간 공조배양한 후, 배양액의 상청액만 모아 ELISA로 IL-7과 IL-10을 측정하였다.

또한, 간이식을 한 남성 이식 질환 환자와 일반인의 혈액 세포(PBMC)와 근육 유래 미토콘드리아를 3일간 공조배양한 후 면역세포 변화를 관찰하였다. 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 근육 유래 미토콘드리아에 의해 Th17 세포의 발현이 저해됨을 확인할 수 있었다.

그 결과, 근육 유래 미토콘드리아가 주입된 그룹에서 IL-17은 감소하고 IL-10은 증가함을 확인할 수 있었다(도 7). 상기 결과를 바탕으로, 근육 유래 미토콘드리아는 이식 거부질환 치료에 이용할 수 있음을 확인하였다

실시예 4. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 신경계 자가면역질환 치료효과 확인

본 발명의 미토콘드리아의 신경계 자가면역질환 치료효과를 확인하기 위하여, MOG 펩타이드을 사용하여 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis) 동물 모델을 제조하였다. 구체적으로, 동물 모델은 출생 후 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Narabiotechnology, 대한민국; 체중 22-24g)를 준비하여 일주일 동안 안정시켰다. 마우스에 MOG 펩타이드 35-55 (Sigma-Aldrich, 미국) 200 ug이 포함된 에멀전(emulsion)과 결핵균(mycobacterium tuberculosis; Difco, 미국) 200 ug이 포함된 IFA (Incomplete Freund's adjuvant; Difco, 미국)를 혼합하여 도합 0.1 ml의 에멀전을 EAE군의 양쪽 허리부위에 피하로 주사하였고, 동시에 백일해독소(PTX, pertussis toxin; List Biologic, 미국) 500 ng을 복강으로 주사하였다. 48시간 후에 동일한 양의 백일해독소를 복강으로 다시 주사하였다. 상기 MOG에 의해 유도된 만성 EAE 동물모델의 임상 증상의 척도를 8가지로 구분하여 확인하였다. 즉, 반응이 없음(0 단계), 꼬리 끝이 쳐짐(1 단계), 꼬리 전체가 쳐짐(2 단계), 꼬리 처짐과 한쪽 뒷다리의 마비(3 단계), 양쪽 뒷다리의 마비(4 단계), 사망 (5 단계) 구분하였다.

이 후, 근육 세포 유래 미토콘드리아를 10ug/200ul의 농도로 주에 2회 총 6회 마우스에 투여하였으며, 질환 스코어를 확인한 결과를 도 8A에 나타내었고, 이의 결과, 근육 유래 미토콘드리아를 처리한 군에서 효과를 확인하였다

도 8B 는 마우스 희생당시의 비장 조직에서의 면역 세포를 유세포 분석 하였으며, CD4 T 세포에서의 IL-17 (IL-17+ CD4+), CD8 T 세포에서의 IL-17 (IL-17+CD8+), CD19 B 세포에서의 IL-17 (IL-17+CD19+) 면역 세포 아형을 분석하였다. 결과 근육 유래 미토콘드리아 이식 EAE 군에서의 IL-17 을 발현하는 각 T, B 세포아형이 감소함을 확인하였으며, 미토콘드리아 ROS 생성 (mitoSOX) 발현이 현저히 감소하였다.

도 8C 는 마우스 희생당시의 척수 조직 파괴정도를 H&E 와 LFB(Luxol fast blue) 염색을 통해서 분석하였으며, 미토콘드리아 투여군에서의 척수 조직의 백질, 회백질의 구분이 선명하며, 조직 손상이 억제됨을 확인 하였다.

실시예 5. 근육 유래 미토콘드리아에 의한 쇼그렌 증후군 치료효과 확인

1. 쇼그렌 증후군 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아의 타액 분비능 확인

본 발명자들은 쇼그렌 증후군의 치료에 위한 근육 유래 미토콘드리아의 효과를 확인하기 위하여, 쇼그렌 증후군의 동물 모델인 NOD(Non-obese diabetic) 마우스에 근육 유래 미토콘드리아를 주입한 후, 마우스의 쇼그렌 증후군의 발병척도인 타액분비능 및 분비유지능을 조사하였다. 대조군(vehicle) 또는 10ug/200ug의 미토콘드리아의 NOD/ShiLtJ 마우스에 복강내주사(intraperitoneal injection)로 쇼그렌 증후군 발병 후 주 1회 총 5회 주입하여 실험하였다.

타액량은 0.1 mg의 필로카르핀(pilocarpine)을 투여한 후 타액을 수집하여 측정하였다. 그 결과, 질환 발병 후 미토콘드리아 총 5회 투여 하였으며, 질환 발병 후 13주차에 미토콘드리아를 처리한 군에서는 대조군(vehicle)에 비하여 타액분비능(도 9A, 분 당 saliva/weight 수치인 flow rate으로 측정)이 현저히 증가함을 확인하였다.

2. 쇼그렌 증후군 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아의 Th17/Treg 세포 조절 효과 확인

본 발명자들은 쇼그렌 증후군 마우스 모델의 비장 조직에서 Th17 세포 (CD4 및 IL-17 항체로 면역염색), B17 세포, Th1 세포를 확인하기 위하여 유세포 분석 하였다. 또한 침샘 조직에서의 IL-17+CD4+ Th17 세포의 활성이 감소됨을 확인하였다. 그 결과, 미토콘드리아는 비장 조직 및 침샘 조직에서 Th17 세포, B17세포, Th1 세포 감소시켰음을 확인하였다(도 9B).

3. 쇼그렌 증후군 동물모델에서 근육 유래 미토콘드리아의 세포 형태 유지효과 및 염증세포의 침윤효과 확인

본 발명자들은 쇼그렌 증후군의 치료를 위한 미토콘드리아의 효과를 확인하기 위하여, 쇼그렌 증후군의 동물 모델인 마우스의 눈물샘(Lacrimal gland) 및 침샘(Salivary gland)에서 세포의 형태를 유지하는지 여부 및 염증세포의 침윤이 되었는지 여부를 당업계에 공지된 H&E 염색법을 통해 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 근육 유래 미트콘드리아를 주입한 경우에는 대조군에 비해 눈물샘 및 침샘 조직내에서의 면역 세포 침윤이 감소되었으며, 조직 파괴가 현저히 감소됨을 확인하였다(도 9C).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

근육으로부터 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, IL-17이 매개하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 면역질환 또는 염증성 질환은 골관절염, 이식거부반응, 쇼그렌 증후군 및 자가 신경계 자가면역질환으로부터 선택된 1종 이상의 질환인 것인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 미토콘드리아는 근육 조직 또는 근육 세포로부터 분리된 것인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기, 미토콘드리아는 골관절염 환자로부터 유래된 조직 또는 세포로부터 분리된 것인, 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 골관절염은
1)관절조직에서 IL-1β, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포의 수가 증가;
2)관절조직에서 COX4가 감소된 상태;및
3)비장 조직 내의 Th17 세포가 증가된 조건을 갖는, 조성물.
제 1항에 있어서, 이식 거부 반응은 세포, 혈액, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응인 것인 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 이식 거부 반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 거부 반응인 것인 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 이식 거부 반응은 이식편대숙주병(GVHD,graft-versus-host disease)인 것인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 신경계 자가면역질환은 다발성경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 급성 파종성뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 상행성 척수염(ascending myelitis), 중심성 척수염(central myelitis), 하행성 척수염(descending myelitis) 횡단성 척수염(transverse myelitis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmuneuveitis), 자가면역성뇌증(autoimmune encephalopathy), 뇌척수염(encephalomyelitis) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 미토콘드리아는 Th17을 감소시키며, Treg를 증가시키는 것인, 조성물.