BR102019013765A2 - Método de obtenção de vacina autóloga à base de células dendríticas para tumores cerebrais e vacina resultante - Google Patents

Abstract

método de obtenção de vacina autóloga à base de células dendríticas para tumores cerebrais e vacina resultante. trata-se de método de obtenção de vacina autóloga para tumores cerebrais e vacina resultante do tipo que auxilia o sistema imunológico da pessoa contra o ataque as células cancerígenas; dito método de obtenção de vacina autóloga é compreendido por três etapas, quais sejam: i) preparação de células tumorais; ii) geração de células dendríticas de sangue periférico; iii) hibridização e preparação da vacina de células tumorais e dendríticas; dita vacina obtida é autóloga a base de células dendríticas para tumores cerebrais que compreende conteúdo celular composto de hibridomas, formados pela fusão entre células tumorais do indivíduo e células dendríticas de doadores saudáveis, formadas por eletroporação.

Description

MÉTODO DE OBTENÇÃO DE VACINA AUTÓLOGA À BASE DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PARA TUMORES CEREBRAIS E VACINA RESULTANTE.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO [001] A presente patente de invenção trata de método de obtenção de vacina-à base de células dendríticas para tumores cerebrais onde, notadamente, dito método baseiase na imunoterapia celular contra o câncer, atingindo diretamente as células tumorais, não-próprias do indivíduo, usando como base a propriedade do sistema imune de identificar o não-próprio do corpo.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO [002] Atualmente, são conhecidos alguns tipos de tratamentos contra o câncer como, por exemplo, a cirurgia que é realizada quando a doença está contida numa área localizada, de forma a permitir a retirada do tumor junto com qualquer tecido nas proximidades que possa conter células cancerosas. Porém, a cirurgia não é capaz de retirar as células dispersas e infiltradas nos tecidos acometidos que não são identificáveis visualmente e, assim, as chances de cura podem ser reduzidas.

[003] Da mesma forma, a extensão da doença é verificada durante o procedimento cirúrgico, especialmente quando da disseminação do tumor para outras áreas, sendo que, outros tratamentos, como radioterapia e quimioterapia, podem ser realizados junto com a cirurgia, e podem ser administrados antes ou depois da cirurgia.

[004] Supracitada terapia com quimioterapia é o tratamento com medicamentos anticancerígenos administrados por via venosa ou oral, sendo que ditos medicamentos se misturam com o sangue e são levados a todas as partes do corpo, a fim de destruir as células doentes que estão formando o tumor, bem como, impedir a dispersão.

[005] O principal inconveniente da quimioterapia convencional reside no fato de que ditos medicamentos atacam indiscriminadamente todas as células em proliferação no corpo, ou seja, atacam as células saudáveis, fato que acarreta os conhecidos efeitos colaterais como anemia, leucopenia, plaquetopenia, queda de cabelo, náuseas e vômitos, etc.

[006] Já a radioterapia é uma modalidade de tratamento que utiliza a radiação para eliminar as células tumorais, sendo que a programação do tratamento é realizada

Petição 870190061835, de 03/07/2019, pág. 5/19 / 6 através do uso de softwares específicos de planejamento, onde o médico delimita a área a ser tratada com base nos exames de imagem. Tal tratamento pode ser do tipo radioterapia externa ou tele-radioterapia, seja fracionada, hipo-fracionada ou em dose única (dita radiocirurgia), aplicadas por fonte externa, ou do tipo braquiterapia, onde a fonte radiativa é implantada no doente.

[007] O inconveniente do mencionado tratamento reside no fato da radioterapia afetar localmente todas as células em reprodução como, também, em parte o tecido saudável, causando edema, necrose, perda de memória e concentração quando no cérebro, entre outros problemas.

[008] Uma outra forma de tratamento conhecido consiste no uso de vacinas contra câncer que fazem com que o sistema imunológico da pessoa ataque as células cancerígenas, tal como, a vacina denominada como 'DCVax', feita a partir das células dendríticas de cada paciente. Essas as células imunológicas são separadas do sangue do paciente e expostas às células tumorais onde, através desse processo, as células dendríticas aprendem a reconhecer os marcadores e proteínas específicos associados às células tumorais do paciente. As células dendríticas instruídas são, então, injetadas de volta no paciente, onde vão recrutar e ensinar outras células imunes a reconhecer e atacar as células cancerígenas.

[009] Dita vacina pode ser vislumbrada no documento de n°. US 2019046568 que compreende células dendríticas parcialmente maduras e ativadas que produzem citocinas/quimiocinas, por exemplo, uma ou qualquer combinação de e / ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFa que estão correlacionadas com melhores resultados clínicos, aumentou significativamente o tempo de sobrevida e aumentou significativamente o tempo de recorrência do tumor ou do câncer. As quantidades limiares determinadas destas citoquinas podem ser utilizadas para (i) um teste de potência imunoterapêutica para células dendríticas ativadas, (ii) seleção de pacientes respondedores, (iii) rejeição de pacientes não respondedores, e (iv) para rastrear ativação de células dendríticas ou agentes de maturação que também podem induzir a produção da quantidade limite das citoquinas/quimiocinas.

Petição 870190061835, de 03/07/2019, pág. 6/19 / 6 [010] A principal diferença da supracitada usual vacina contra o câncer (DC-Vax) em relação a vacina ora requerida, reside no fato das células dendríticas da vacina usual serem derivadas dos próprios enfermos, com câncer, diferentemente da vacina aqui proposta, à base de células dendríticas derivadas de doadores saudáveis. É sabido que que células dendríticas de doentes com câncer são silenciadas pelo tumor, não respondendo aos estímulos imunes de maneira normal e efetiva.

[011] Outro documento encontrado em bancos de dados especializados refere-se a uma vacina contra o câncer descrita no documento n°. AU2019203111 que trata de fabricação de vacinas de células dendríticas prontas para injeção em doses múltiplas, terapias combinadas para bloqueio de HER2 e HER3 e terapia de câncer de mama HER2 positivo para receptor de estrogênio. As presentes formas de realização referem-se a uma vacina de células dendríticas pulsadas com antígeno (DC) de antígeno de dose múltipla, aprovada pelo FDA. Numa forma de realização, a vacina DC carregada com antígeno ativado compreende uma dose imunizante inicial e múltiplas doses de reforço. Também é fornecido um método para bloquear HER-2 e HER-3 como um tratamento que causa a senescência tumoral permanente em cânceres mama expressando HER2. Também é fornecida combinação terapia anti-estrogênica e vacinação contra chamada dendrítica anti-HER2 para pacientes com câncer de mama com ERP ° S / HER2PS DCIS.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO [012] É, portanto, objetivo da presente patente apresentar um método de obtenção de vacina autóloga à base de células dendríticas para tumores cerebrais e vacina resultante através do uso de células dendríticas alogênicas, ou seja, de doadores saudáveis.

[013] É objetivo desta patente apresentar um método de obtenção de vacina autóloga à base de células dendríticas para tumores cerebrais e vacina resultante produzida por meio de hibridomas constituídos com a fusão entre células tumorais viáveis e células imunitárias, o que é induzido por eletroporação. Dito processo mostrou-se mais eficiente que a simples mistura entre células tumorais e células imunes usuais, ou ainda a mistura de células dendríticas com lisados tumorais como é o caso da vacina 'DC-Vax'.

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DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [014] A complementar a presente descrição de modo a obter uma melhor compreensão das características do presente invento e de acordo com uma preferencial realização prática do mesmo, acompanha a descrição, em anexo, um conjunto de desenhos, onde, de maneira exemplificada, embora não limitativa, se representou seu funcionamento:

a figura 1 representa um fluxograma da análise do infiltrado tumoral e sangue;

a figura 2 mostra um fluxograma de preparação da vacina e análise da resposta.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [015] Com referência aos desenhos ilustrados, a presente patente de invenção se refere à MÉTODO DE OBTENÇÃO DE VACINA AUTÓLOGA À BASE DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PARA TUMORES CEREBRAIS E VACINA RESULTANTE, mais precisamente trata-se de método de obtenção de vacina autóloga para tumores cerebrais e vacina resultante do tipo que auxilia o sistema imunológico da pessoa contra o ataque as células cancerígenas.

[016] Segundo a presente invenção, o método de obtenção de vacina autóloga é compreendido por três etapas, quais sejam: i) preparação de células tumorais; ii) geração de células dendríticas de sangue periférico; iii) hibridização e preparação da vacina de células tumorais e dendríticas, assim definidas:

i) Etapa 1 - Preparação de células tumorais.

- Amostras de tumores frescos, obtidas assepticamente a partir de ressecção da lesão primária ou metastática que são triturados mecanicamente, e suspensões unicelulares que são geradas por digestão com colagenase tipo VIII (0,56 mg / ml; Sigma, St. Louis, MO, EUA) e DNAse I (0,026 mg / ml; Sigma, St. Louis, MO, EUA), durante 90 a 120 minutos com incubação a 37 °C, mantidos sob agitação;

- Em média, 107 células viáveis são obtidas para cada grama de tecido digerido. A viabilidade celular pelo método de exclusão de azul tripan varia de 30 a 100%;

- Após a recuperação, as células são lavadas, ressuspensas em meio de congelamento (60% de RPMI 1640, 30% de FCS e 10% de dimetilsulfóxido; Sigma, St. Louis, MO, EUA), imediatamente congelados e mantidos em nitrogênio líquido até hibridação com DCs.

Petição 870190061835, de 03/07/2019, pág. 8/19 / 6 ii) Etapa 2 - Geração de células dendríticas de sangue periférico.

- Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são coletadas de voluntários saudáveis e não relacionados por aférese realizada em um ‘Cobe Spectra Blood Cell Separator 7.0', programado para coleta de células mononucleares. Citrato ácido dextrose (ACD) é utilizado como anticoagulante, com proporção de anticoagulante: sangue de 1: 8-1: 11;

- Uma volemia sanguínea e meia são a seguir processadas por 2-4 h. As células mononucleares são separadas por uma densidade de gradiente (1,077 g / dl; Lymphoprep; Axis-Shield, Oslo, Noruega), ressuspendidas e semeadas em frascos de cultura. Como meio de cultura utiliza-se o RPMI 1640, suplementado com soro fetal bovino a 10%. Após, os frascos são incubados a 37 °C por um período de 4 h;

- Células não aderentes são removidas na troca de meio RPMI, ocasião em que o meio anterior é substituído por um meio isento de soro (X-Vivo 15; BioWhittaker, Walkersville, MD, EUA) contendo GM-CSF (50 ng / ml; R & D, Minneapolis, MN, EUA) e interleucina 4 (50 ng / ml; R & D, Minneapolis, MN, EUA). Após 5 dias em cultura, (50 ng / ml; R & D, Minneapolis, MN, EUA) é adicionado às culturas para ativação das células dendríticas;

- Após mais 2 dias em cultura, as células são colhidas e utilizadas para a geração da vacina híbrida de tumor dendrítico.

iii) Etapa 3 - hibridização e preparação da vacina de células tumorais e dendríticas.

- No último dia, as culturas de células dendríticas são lavadas e ressuspensas em solução estéril de glicose a 5% para uma concentração de 107 células / ml. Células tumorais são descongeladas, lavadas e também ressuspensas em solução de glicose a 5% para uma concentração de 107 células /ml;

- Estas duas suspensões de células são misturadas em igual volumes fundidas por um pulso elétrico de 1.000 V/cm a 25 lF (aplicado por um Gene-Pulser II; Bio-Rad, Richmond, CA, EUA), depois de alinhadas em um campo elétrico não homogêneo (62,5 V / cm) por 15 s;

- Após um descanso de 2 min na cubeta de eletroporação, as células são transferidas para um tampão de relaxamento (KCL 100 mM, NaCl 3 mM, EDTA 1,25 mM, PIPES 10

Petição 870190061835, de 03/07/2019, pág. 9/19 / 6 mM, 0,5 mM ATP, ajustado para pH 6,8), mantidos por mais 5 min. Logo após a fusão, todas as células são coradas com azul tripano, mas após o repouso inicial no tampão de relaxamento e mais descanso em meio de cultura, eles recuperaram a habilidade para excluir o corante vital;

- A preparação da célula híbrida é então centrifugada, ressuspensa em 1 ml de tampão de fosfato estéril, solução salina (pH 7,2) e, após irradiação (200 Gy), injetado nos pacientes. Neste momento, a viabilidade celular varia entre 60 a 80% da viabilidade inicial de células tumorais;

- As injeções de vacina assim preparadas são intradérmicas em condições assépticas, em dois pontos da face volar do antebraço (0,5mL cada).

[017] A vacina autóloga a base de células dendríticas para tumores cerebrais obtida compreende conteúdo celular composto de hibridomas, formados pela fusão entre células tumorais do indivíduo e células dendríticas de doadores saudáveis, formadas por eletroporação.

[018] É certo que quando o presente invento for colocado em pratica, poderão ser introduzidas modificações no que se refere a certos detalhes de construção e forma, sem que isso implique afastar-se dos princípios fundamentais que estão claramente substanciados no quadro reivindicatório, ficando assim entendido que a terminologia empregada não teve a finalidade de limitação.

Claims (2)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE VACINA AUTÓLOGA À BASE DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PARA TUMORES CEREBRAIS E VACINA RESULTANTE, mais precisamente trata-se de método de obtenção de vacina autóloga para tumores cerebrais e vacina resultante do tipo que auxilia o sistema imunológico da pessoa contra o ataque as células cancerígenas; caracterizado por método de obtenção de vacina autóloga é compreendido por três etapas, quais sejam: i) preparação de células tumorais; ii) geração de células dendríticas de sangue periférico; iii) hibridização e preparação da vacina de células tumorais e dendríticas, assim definidas:

i) etapa 1 - preparação de células tumorais

- amostras de tumores frescos, obtidas assepticamente a partir de ressecção da lesão primária ou metastática que são triturados mecanicamente, e suspensões unicelulares que são geradas por digestão com colagenase tipo VIII e DNAse I, durante 90 a 120 minutos com incubação a 37 °C, mantidos sob agitação;

- em média, 107 células viáveis são obtidas para cada grama de tecido digerido; a viabilidade celular pelo método de exclusão de azul tripan varia de 30 a 100%;

- após a recuperação, as células são lavadas, ressuspensas em meio de congelamento, imediatamente congelados e mantidos em nitrogênio líquido até hibridação com DCs;

ii) etapa 2 - geração de células dendríticas de sangue periférico

- células mononucleares do sangue periférico são coletadas de voluntários saudáveis e não relacionados por aférese realizada em um 'cobe', programado para coleta de células mononucleares; citrato ácido dextrose é utilizado como anticoagulante, com proporção de anticoagulante: sangue de 1: 8-1: 11;

- uma volemia sanguínea e meia são a seguir processadas por 2-4 h; as células mononucleares são separadas por uma densidade de gradiente, ressuspendidas e semeadas em frascos de cultura; como meio de cultura utiliza-se o RPMI 1640, suplementado com soro fetal bovino a 10%; após, os frascos são incubados a 37 °C por um período de 4 h;

- células não aderentes são removidas na troca de meio RPMI, ocasião em que o meio anterior é substituído por um meio isento de soro contendo GM-CSF e interleucina 4;

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2 / 2 após 5 dias em cultura é adicionado às culturas para ativação das células dendríticas;

- após mais 2 dias em cultura, as células são colhidas e utilizadas para a geração da vacina híbrida de tumor dendrítico iii) etapa 3 - hibridização e preparação da vacina de células tumorais e dendríticas.

- no último dia, as culturas de células dendríticas são lavadas e ressuspensas em solução estéril de glicose a 5% para uma concentração de 107 células/ml; células tumorais são descongeladas, lavadas e também ressuspensas em solução de glicose a 5% para uma concentração de 107 células /ml;

- estas duas suspensões de células são misturadas em igual volumes fundidas por um pulso elétrico de 1.000 V/cm a 25 lF, depois de alinhadas em um campo elétrico não homogêneo por 15 s;

- após um descanso de 2 min na cubeta de eletroporação, as células são transferidas para um tampão de relaxamento, mantidos por mais 5 min; logo após a fusão, todas as células são coradas com azul tripano, mas após o repouso inicial no tampão de relaxamento e mais descanso em meio de cultura, eles recuperaram a habilidade para excluir o corante vital;

- a preparação da célula híbrida é então centrifugada, ressuspensa em 1 ml de tampão de fosfato estéril, solução salina e, após irradiação injetado nos pacientes; neste momento, a viabilidade celular varia entre 60 a 80% da viabilidade inicial de células tumorais;

- as injeções de vacina assim preparadas são intradérmicas em condições assépticas, em dois pontos da face volar do antebraço 0,5mL cada.

2. VACINA RESULTANTE, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por vacina obtida ser autóloga a base de células dendríticas para tumores cerebrais que compreende conteúdo celular composto de hibridomas, formados pela fusão entre células tumorais do indivíduo e células dendríticas de doadores saudáveis, formadas por eletroporação.