KR20080049917A - 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물 - Google Patents

인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20080049917A
KR20080049917A KR1020060120479A KR20060120479A KR20080049917A KR 20080049917 A KR20080049917 A KR 20080049917A KR 1020060120479 A KR1020060120479 A KR 1020060120479A KR 20060120479 A KR20060120479 A KR 20060120479A KR 20080049917 A KR20080049917 A KR 20080049917A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
neural
stem cells
disease
cord blood
Prior art date
Application number
KR1020060120479A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100959995B1 (ko
Inventor
양윤선
오원일
이재권
Original Assignee
메디포스트(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020060120479A priority Critical patent/KR100959995B1/ko
Application filed by 메디포스트(주) filed Critical 메디포스트(주)
Priority to US12/516,913 priority patent/US9387226B2/en
Priority to CA2669304A priority patent/CA2669304C/en
Priority to JP2009539185A priority patent/JP2010511381A/ja
Priority to MX2009005496A priority patent/MX2009005496A/es
Priority to PCT/KR2007/006084 priority patent/WO2008066330A1/en
Priority to CN2007800440974A priority patent/CN101541954B/zh
Priority to AU2007326171A priority patent/AU2007326171B2/en
Priority to EP07851154.0A priority patent/EP2099901B1/en
Priority to BRPI0718937-0A priority patent/BRPI0718937A2/pt
Priority to ES07851154.0T priority patent/ES2550456T3/es
Publication of KR20080049917A publication Critical patent/KR20080049917A/ko
Priority to HK10102815.7A priority patent/HK1134688A1/xx
Application granted granted Critical
Publication of KR100959995B1 publication Critical patent/KR100959995B1/ko
Priority to JP2013160426A priority patent/JP5871865B2/ja
Priority to US13/970,074 priority patent/US9439931B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/402—1-aryl substituted, e.g. piretanide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 제대혈(human umbilical cord blood) 유래 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 유효성분으로 포함하는, 신경전구세포(neural precursor cell) 또는 신경줄기세포(neural stem cell)의 신경세포로의 분화 및 증식 유도용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따라 제대혈로부터 분리·배양된 간엽 줄기세포는 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화 및 증식시킬 수 있으므로 신경 손상 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및 증식 유도용 조성물{COMPOSITION FOR INDUCING DIFFERENTIATION AND PROLIFERATION OF NEURAL PRECURSOR CELLS OR NEURAL STEM CELLS TO NEURAL CELLS, COMPRISING A HUMAN UMBILICAL CORD BLOOD-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELL AS AN ACTIVE INGREDIENT}
도 1은 본 발명의 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 신경전구세포의 공동배양에 사용되는 트랜스웰 챔버(transwell chamber)를 모식도로 나타낸 것이고,
도 2는 NG108-15 세포를 단독으로 또는 본 발명의 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양한지 4일 및 7일 후, 각각 위상차 현미경(× 100)을 이용하여 세포의 분화 및 증식을 관찰한 결과이고,
도 3은 NG108-15 세포를 단독으로 또는 본 발명의 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양한지 7일 후, 신경세포 분화단계의 초기 표지(early marker)인 튜불린 베타-Ⅲ에 대한 면역염색(immunostaining)을 수행한 결과이고,
도 4는 NG108-15 세포를 단독으로 또는 본 발명의 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양한지 7일 후, 위상차 현미경(× 100)을 이용하여 세포의 분화 및 증식을 관찰한 결과이고,
도 5는 생쥐 태아 뇌 피질 신경줄기세포와 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 농도 별로 트랜스웰 챔버에 7일간 공동배양한 후, 위상차 현미경(× 100)을 이용하여 세포의 분화 및 증식을 관찰한 결과이고,
도 6은 NG108-15 세포와 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 농도별로 트랜스웰 챔버에 7일간 공동배양한 후, 트립판 블루 염색법(Trypan blue staining)을 이용하여 살아있는 세포의 수를 측정한 결과이고,
도 7은 생쥐 태아 뇌 피질 신경 줄기세포와 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 농도별로 트랜스웰 챔버에 7일간 공동배양한 후, 트립판 블루 염색법(Trypan blue staining)을 이용하여 살아있는 세포의 수를 측정한 결과이다.
본 발명은 인간 제대혈(human umbilical cord blood) 유래 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 유효성분으로 포함하는, 신경전구세포(neural precursor cell) 또는 신경줄기세포(neural stem cell)의 신경세포로의 분화 및 증식 유도용 조성물에 관한 것이다.
난치병으로 알려진 뇌졸중 (stroke), 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 피크병 (Pick's disease), 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis), 외상성 중추 신경계 질환 (traumatic central nervous system diseases) 및 척수 손상 질환 (spinal cord injury disease)은 뇌의 신경세포 손상에 의해 신경기능에 이상이 생기는 질환으로서, 상기 질환들로 인해 손상된 신경세포를 치료하는 방법은 약물요법이나 외과적 수술로 치료하는 것이 일반적인 방법이다. 그러나, 이러한 치료는 다른 정상적인 세포에도 많은 손상을 입혀 문제점으로 지적되고 있다.
이에 최근에는 질환에 의해 파괴되거나 손상받은 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체 요법 (cell replacement therapy)이 효과적인 치료법으로 제시되고 있다. 이러한 세포 치료 요법에서, 재생이 필요한 조직으로 증식 및 분화가 가능한 줄기세포 (stem cell)가 각광을 받고 있다.
줄기세포란 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하며 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 말한다.
신경 줄기세포 역시 자기복제능력을 가지고 있으며, 중추신경계를 구성하는 신경세포, 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 등의 세 가지 구성세포로 분화하는 다분화능력을 가진 미분화세포이다. 신경 줄기세포는 특정한 신경계 세포를 만들어내는 신경전구세포나 글리아전구세포의 단계를 거쳐서 신경세포/뉴론이나 글리아세포로 분화하게 된다.
한편, 간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)는 골, 연골, 지방조직, 근육, 건, 인대, 신경조직 등으로 분화할 수 있어 세포 치료요법에 적합한 세포로 주목받 고 있다. 현재 간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 가장 대표적 기원 조직으로 골수 (bone marrow)를 들 수 있다. 그러나, 골수에 존재하는 간엽 줄기세포는 제한적인 분화능과 증식능력으로 인해 그 응용범위가 한정적일 수밖에 없으며, 골수로부터 유래하는 한계로 인해 여러 단계의 시술이 필요하고, 시술 과정이 복잡하여 채취 대상자에게 시간적, 정신적 및 육체적 고통을 수반하는 것이 보통이다. 또한, 골수 이식을 위해서는 조직적합항원 비교를 통해 항원 표현형이 일치하여 이식편대 숙주반응을 보이지 않는 공여자를 찾아야 한다는 문제점이 있다.
최근에는, 제대혈에 많은 양의 줄기세포가 있는 것으로 알려지면서 연구가 활발히 이루어지고 있다. 제대혈이 조혈모세포의 풍부한 원천으로 알려진 이후, 임상적으로 제대혈 이식을 통해 혈액관련 질환을 치료하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있으며, 자가이식 치료를 위하여 제대혈을 냉동시켜 수년 후 사용가능한 상태로 보존하는 제대혈은행이 국내에서도 활성화되고 있다.
제대혈은 골수와는 달리 분만과정에서 버려지는 제대 (umbilical cord)에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다. 또한, 제대혈 이식시 나타날 수 있는 이식편대 숙주반응이 골수이식에 비해 상당히 적어 제대혈에 포함되어 있는 줄기세포의 성상 확인 및 그의 임상에의 응용 확대를 위한 연구가 전세계적으로 이루어지고 있다.
그러나, 아직까지 제대혈로부터 분리·배양한 간엽 줄기세포가 주변의 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화 및 증식시킨다고 보고된 바는 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 제대혈로부터 분리한 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및 증식 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제대혈로부터 분리한 간엽 줄기세포를 이용하여 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 이용한 신경세포 손상 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 제대혈 유래의 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포의 분화 및 증식 유도용 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 제대혈 유래의 간엽 줄기세포를 신경전구세포와 공동배양하는 것을 포함하는, 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 신경세포 손상의 회복이 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하는 신경세포 손상 질환의 치 료방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용된 용어 "제대혈"은 인간을 포함하는 모든 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 제대 정맥으로부터 채취된 혈액을 의미한다. 본 발명에서 사용된 용어 "제대혈 유래 간엽줄기세포"는 포유동물, 바람직하게는 인간의 제대혈로부터 분리 및 배양된 간엽 줄기세포를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "신경 손상 질환"은 운동 및 감각에 관여하는 신경이 손상되어 운동 및 감각을 포함하는 행동기능에 이상이 생기는 것을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "치료"는 1) 아직 신경 손상 질환을 보유하고 있다고 진단되지 않았으나, 이러한 경향이 있는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 질병 또는 장애가 발생되는 것의 예방; 2) 신경 손상 질환의 억제, 즉 발전의 억제; 및 3) 신경 손상 질환의 경감을 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "신경세포 (neural cell)"는 뉴론(neuron), 성상세포(astrocyte) 또는 희돌기교세포(oligodendrocyte)를 의미한다.
제대혈로부터 간엽 줄기세포를 포함하는 단핵구 세포를 분리하기 위해서는 피콜-하이팩 밀도구배 분리법 (Ficoll-Hypaque density gradient method)과 같은 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로, 분만 후 태반이 박리되기 전에 제정맥 (umbilical vein)으로부터 채취한 제대혈을 피콜-하이팩 그라디언트 (Ficoll- Hypaque gradient)로 원심분리하여 단핵구 세포를 수득한 다음, 수차례 세척하여 불순물을 제거한다.
이와 같이 분리된 단핵구 세포는 간엽 줄기세포의 분리 및 배양에 바로 이용하거나 초저온 냉동시켜 장기간 보관 후 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 상기와 같이 분리된 제대혈 유래 단핵구 세포로부터 간엽 줄기세포를 분리 및 배양하기 위해, 단핵구 세포를 5 내지 30 중량%, 바람직하게는 10 중량%의 FBS를 함유한 동물세포 배양용 배지, 예를 들면 DMEM, α-DMEM, 이글스 기본 배지(Eagle's basal medium), RPMI 1640 배지 등에 현탁시킨 다음, 이를 적당한 농도로 상기와 동일한 조성의 배지에 접종하여 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 세포배양기에서 배양한다. 배양된 세포가 단일층을 형성하면, 위상차 현미경을 이용하여 스핀들(spindle) 모양으로 증폭된 간엽 줄기세포를 확인한 다음, 상기 간엽 줄기세포가 충분히 증폭될 때까지 계대배양을 반복한다(문헌 [Yang SE et al., Cytotherapy, 6(5):476-486, 2004] 참조).
이와 같이 제대혈로부터 분리 및 배양된 간엽 줄기세포는 신경전구세포 또는 신경줄기세포와 공동배양하는 경우, 신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화와 증식을 동시에 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 제대혈 유래의 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화 및 증식 유도하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 함유하는 조성물은 뇌졸중(stroke), 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤 병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 외상성 중추 신경계 질환(traumatic central nervous system diseases) 및 척수 손상 질환(spinal cord injury disease)을 포함하는 신경 손상 질환, 바람직하게는 뇌졸중 환자 또는 척수 손상 질환 환자에 대한 세포 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 신경 전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포 분화 및 증식 유도용 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소 투여용 제제 등이 바람직하다. 이때, 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 함께 사용할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 제제는 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 뇌척수액 또는 정맥이나 병변에 혈류를 공급하는 동맥을 통하여도 투여할 수 있고, 바람직하게는 뇌 또는 척수의 손상부위 주변 또는 손상부위의 반대쪽 부위에 직접 투여할 수 있으며, 예를 들어 더글라스 콘치올카(Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998)가 발표한 임상 방법을 이용할 수 있다. 즉, 먼저 대상의 두개골을 약 지름 1 ㎝ 정도의 완두콩 크기로 절개한 다음, HBSS(Hank's balanced salt solution)와 혼합된 간엽 줄기세포 용액을 주입하는 방법이 이용될 수 있다. 이때, 세포용액의 주입은 긴 바늘이 달려있는 주사기와, 뇌 내부에 목적하는 세포용액을 정좌표로 삽입하기 위한 틀(stereotactic frame)을 이용하여 이루어진다.
상기 간엽 줄기세포의 1일 투여량은 1× 105 내지 1× 107 세포/kg 체중, 바람직하게는 5× 105 내지 5× 106 세포/kg 체중이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 분화 및 증식시키고자 하는 신경세포의 양, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 제대혈 유래의 간엽 줄기세포를 신경전구세포 또는 신경줄기세포와 공동배양하는 것을 포함하는 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법을 제공한다. 상기 공동배양에는 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 신경전구세포 또는 신경줄기세포와 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:1 내지 1:2의 세포수 비율로 혼합하여 DMEM, α-MEM, α-DMEM, 이글스 기본 배지(Eagle's basal medium), RPMI 1640 배지 등의 일반적인 세포배양용 배지에서 배양할 수 있다. 이때, 배양배지에는 겐타마이신 등의 항생제 및/또는 10 중량%의 FBS 를 추가로 첨가할 수 있다. 배양기간은 5 내지 10일이 바람직하다.
또한, 본 발명은 신경세포 손상의 회복이 필요한 대상의 손상부위에 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 투여함으로써 신경 손상 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이때 상기 대상은 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다.
이러한 본 발명의 신경 손상 질환의 치료방법은 치료학적으로 유효한 양의 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 손상부위에 투여하면 주변 신경전구세포를 신경세포로 분화 및 증식시켜 손상된 신경 기능을 회복시키므로 뇌졸중, 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 피크병, 헌팅톤병, 근위축성 측면 경화증, 외상성 중추 신경계 질환 및 척수 손상 질환을 포함하는 신경 손상 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 제대혈로부터 분리 및 배양된 간엽 줄기세포는 신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화와 증식을 동시에 유도할 수 있으므로 신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화를 통한 치료효과를 가질 뿐 아니라 신경세포의 수를 늘려줌으로써 이러한 치료효과를 지속 및 강화시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 분리 및 배양
단계 1) 제대혈 (umbilical cord blood, UCB)의 수득
제대혈 샘플은 산모의 동의를 얻어 출산시 제정맥 (umbilical vein)으로부터 수득하였다. 구체적으로, 44 ㎖의 CPDA-1 항응고제 (녹십자)를 포함하는 UCB 수집함 (collection bag)의 16-게이지의 주사바늘을 제정맥에 삽입하여 UCB가 중력에 의해 수집함으로 모이도록 하였다. 모든 제대혈 수득물은 채취 후 48시간 내에 처리하였으며, 전체 세포의 생존율은 90% 이상이었다.
단계 2) 간엽 줄기세포의 분리 및 증폭
상기 단계 1에서 얻은 제대혈 수득물을 피콜-하이팩 그라디언트 (Ficoll-Hypaque gradient, 밀도: 1.077 g/㎖, Sigma 사)로 원심분리하여 단핵구 세포를 수득한 다음, 수차례 세척하여 불순물을 제거하였다. 10% FBS (HyClone 사)를 함유한 최소 기본배지 (α-MEM, Gibco BRL 사)를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 상기 세포를 적당한 농도로 10% FBS를 함유한 최소 기본배지에 분주한 다음, 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 세포배양기에서 일주일에 두 번씩 배지를 교환해가며 배양하였다. 배양된 세포가 단일층을 형성하면, 위상차 현미경을 이용하여 스핀들 (spindle) 모양으로 증폭된 간엽 줄기세포를 확인한 다음, 상기 간엽 줄기세포가 충분히 증폭될 때까지 계대배양을 반복하였다(문헌 [Yang SE et al., Cytotherapy, 6(5):476-486, 2004] 참조).
실시예 2: NG108-15의 배양
생리학적 및 형태학적으로 신경전구세포와 유사한 성질을 나타내는 생쥐 뇌 유래의 NG108-15 세포(Neuroblastoma X glioma hybrid)(ATCC, Cat. No. ATCC-CRL-HB-12317)를 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(4 mM/L 글루타민, 4.5 g/L 글루코오스, 4.0 mg/L 피리독신-HCl, 0.1 mM 하이포잔틴아닌, 400 nM 아미노프테 린, 0.016 mM 티미딘, 10 % 우태아혈청)에 배양하였다.
실시예 3: 신경줄기세포의 배양
생쥐 태아 뇌 피질 신경줄기세포(Chemicon, Cat. No. SCR029)를 신경줄기세포 기본 배지(Neural stem cell basal medium)(20 ng/㎖ FGF-2, 20ng/㎖ EGF 및 2mg/㎖ Heparin)에 배양하였다.
실시예 4: 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 NG108-15의 공동배양 Ⅰ
실시예 1에서 얻은 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포(hUCB-MSCs)를 실시예 2에서 배양된 NG108-15와 트랜스웰 챔버(transwell chamber)(도 1)를 이용하여 실시예 2의 배양 조건에서 1:1의 비율로 공동배양(co-culture)하였다. 대조군으로서 NG108-15(NG108)만을 동일한 조건으로 배양하였다. 배양에 사용된 트랜스웰 챔버는 도 1에 표시된 바와 같이, 1 ㎛의 공극을 갖는 미세공막(microporous membrane)에 의해, 하부(lower compartment)와 상부(upper compartment)로 구분되어 있다. 트랜스웰 챔버의 미세공막을 기준으로 상부에 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를, 하부에 NG108-15를 배양하였다.
배양 4일 및 7일 후에 각각 위상차 현미경(× 100)을 이용하여 NG108-15의 분화를 관찰하였다. 도 2에 표시된 바와 같이, 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양한 NG108-15는 길게 가지를 뻗고, 방추 형태로 분화하는 성숙한 신경세포의 형태로 분화되었음을 알 수 있다.
또한, 신경세포 발달 단계의 초기 표지인 튜불린-베타 Ⅲ에 대한 면역염색(immunostaining)을 하기와 같이 수행하여 분화된 세포가 신경세포임을 확인하였다.
hUCB-MSCs, NG108-15 및 hUCB-MSC와 NG108-15의 1:1 혼합 세포를 각각 커버슬라이드에서 배양한 후, 0.3% 트리톤 X-100이 포함된 10% 정상 염소 혈청에 넣어 상온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 일차 항체로서 피코에리트린(Phycoerythrin) 이 부착되어있는 항-튜불린-베타 Ⅲ 마우스 단일클론 항체 (chemicon 사)를 1:100으로 희석하여 첨가한 후 4℃에서 밤새 반응시킨 다음, 0.01 M의 PBS로 5분씩 3회 세척하였다.
도 3에 표시된 바와 같이, 실시예 1의 간엽 줄기세포와 함께 배양된 NG108-15는 튜불린-베타 Ⅲ에 대한 면역 염색에 대하여 뚜렷한 반응을 보여 분화된 세포가 신경세포임을 입증하였다.
실시예 5: 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 NG108-15의 공동배양 Ⅱ
실시예 1의 방법으로 얻은 기원이 다른 간엽 줄기세포(hUCB-MSCs-1 및 hUCB-MSCs-2)를 실시예 4와 동일한 방법으로 NG108-15와 7일간 배양하고, 위상차 현미경(×100)을 이용하여 세포의 분화 및 증식을 관찰하였다. 또한, 동일한 조건으로 NG108-15만을 배양하면서, 비교예로서 기존에 NG108-15를 신경세포로 분화시킬 수 있는 것으로 알려진 cAMP(NeuroReport 9, 1261-1265, 1998)를 1 mM 첨가한 군 및 NG108-15만을 동일한 배지에 배양한 군에 대해서도 세포의 분화 및 증식을 관찰하 였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 표시된 바와 같이, 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양한 NG108-15는 성숙한 신경세포의 형태로 분화되었음을 알 수 있다. 또한, 서로 다른 두 개의 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 분화 유도 활성의 유의적인 차이는 없었다.
실시예 6: 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 신경줄기세포의 공동배양
실시예 1의 방법으로 얻은 기원이 다른 간엽 줄기세포 hUCB-MSCs-1 및 hUCB-MSCs-2를 실시예 3의 생쥐 태아 뇌 피질 신경줄기세포와 트랜스웰 챔버를 이용하여 실시예 3의 조건에서 공동 배양하였다. 이 때, 간엽 줄기세포를 500, 1000, 2000, 4000 및 6000 세포/㎠의 농도로 배지에 첨가하였으며, 신경줄기세포는 각각 2000 세포/㎠의 농도로 배지에 첨가하였다. 또한, 대조군으로서 생쥐 태아 뇌 피질 신경줄기세포만을 동일한 조건으로 배양하였다. 7일 후, 위상차 현미경(× 100)을 이용하여 세포의 분화 및 증식을 확인하였다(도 5).
도 5에 표시된 바와 같이, 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양한 생쥐 태아 뇌 피질 신경줄기세포는 성숙한 신경세포의 형태로 분화되었음을 알 수 있다. 또한, 서로 다른 두 개의 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 분화 유도 활성의 유의적인 차이는 없었다. 또한, 제대혈 유래 간엽 줄기세포에 의한 신경줄기세포의 분화 및 증식은 공동배양되는 간엽줄기세포의 농도에 비례하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 신경전구세포 또는 신경줄기세포의 공동배 양
NG108-15 및 생쥐 태아 뇌 피질 신경줄기세포를 실시예 5 및 실시예 6의 방법에 따라 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 7일간 공동배양한 후, 트립판 블루 염색법(trypan blue staining)을 이용하여 살아있는 세포의 수를 측정하였다(도 6 및 도 7).
도 6에 나타낸 바와 같이, NG108-15의 수는 공동배양되는 간엽 줄기세포의 농도에 따라 증가되었으며, 이러한 결과는 간엽 줄기세포가 신경전구세포의 신경세포로의 분화 뿐 아니라 증식도 함께 유도한다는 것을 나타낸다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 신경줄기세포 역시 공동배양되는 간엽 줄기세포의 농도에 따라 분화 및 증식이 증가되었다.
본 발명의 방법에 따라 제대혈로부터 분리·배양하여 얻은 간엽 줄기세포는 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화 및 증식시키므로, 본 발명의 간엽 줄기세포 및 이를 포함하는 조성물은 뇌졸중, 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 피크병, 헌팅톤병, 근위축성 측면 경화증, 외상성 중추 신경계 질환 및 척수 손상 질환을 포함하는 신경 손상 질환에 대한 세포 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 제대혈 유래의 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및 증식 유도용 조성물.
  2. 제대혈 유래의 간엽 줄기세포를 신경전구세포 또는 신경줄기세포와 공동배양하는 것을 포함하는, 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 신경전구세포 또는 신경줄기세포의 비율이 1:0.1 내지 1:10인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항의 조성물을 신경세포 손상의 회복이 필요한 대상의 손상 부위에 투여하는 것을 포함하는 신경 손상질환의 치료방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    신경 손상 질환이 뇌졸중 (stroke), 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 피크병 (Pick's disease), 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis), 외상성 중추 신경계 질환 (traumatic central nervous system diseases) 및 척수 손상 질환 (spinal cord injury disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 치료방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    대상이 포유동물임을 특징으로 하는 방법.
KR1020060120479A 2006-11-30 2006-12-01 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물 KR100959995B1 (ko)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060120479A KR100959995B1 (ko) 2006-12-01 2006-12-01 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물
EP07851154.0A EP2099901B1 (en) 2006-11-30 2007-11-29 Use of a composition contaning human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells
JP2009539185A JP2010511381A (ja) 2006-11-30 2007-11-29 神経前駆細胞又は神経幹細胞の神経細胞への分化及び増殖の誘導方法、分化及び増殖誘導用組成物、及び薬学的製剤
MX2009005496A MX2009005496A (es) 2006-11-30 2007-11-29 Uso de una composicion que contiene una celula madre mesenquimal derivada de sangre del cordon umbilical humano para inducir diferenciacion y proliferacion de celulas precursoras neurales o celulas madre neurales a celulas neurales.
PCT/KR2007/006084 WO2008066330A1 (en) 2006-11-30 2007-11-29 Use of a composition contaning human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells
CN2007800440974A CN101541954B (zh) 2006-11-30 2007-11-29 含有人脐带血衍生的间充质干细胞的组合物诱导神经前体细胞或神经干细胞分化和增殖为神经细胞的用途
US12/516,913 US9387226B2 (en) 2006-11-30 2007-11-29 Neural cell proliferation induced through the culture of neural cells with umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells
CA2669304A CA2669304C (en) 2006-11-30 2007-11-29 Use of a composition contaning human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells
BRPI0718937-0A BRPI0718937A2 (pt) 2006-11-30 2007-11-29 Uso de uma composição contendo célula tronco mesenquimal derivada de sangue de cordão umbilical para indução de diferenciação e proliferação de células precursoras neurais ou células tronco neurais para células neurais
ES07851154.0T ES2550456T3 (es) 2006-11-30 2007-11-29 Uso de una composición que contiene células madre mesenquimatosas derivadas de sangre de cordón umbilical humano para inducir diferenciación y proliferación de células precursoras neurales o células madre neurales a células neurales
AU2007326171A AU2007326171B2 (en) 2006-11-30 2007-11-29 Use of a composition contaning human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells
HK10102815.7A HK1134688A1 (en) 2006-11-30 2010-03-17 Use of a composition contaning human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells
JP2013160426A JP5871865B2 (ja) 2006-11-30 2013-08-01 神経前駆細胞又は神経幹細胞の神経細胞への分化及び増殖の誘導方法、分化及び増殖誘導用組成物、及び薬学的製剤
US13/970,074 US9439931B2 (en) 2006-11-30 2013-08-19 Administering umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells to treat nerve injury

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060120479A KR100959995B1 (ko) 2006-12-01 2006-12-01 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080049917A true KR20080049917A (ko) 2008-06-05
KR100959995B1 KR100959995B1 (ko) 2010-05-28

Family

ID=39805447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060120479A KR100959995B1 (ko) 2006-11-30 2006-12-01 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물

Country Status (3)

Country Link
KR (1) KR100959995B1 (ko)
BR (1) BRPI0718937A2 (ko)
ES (1) ES2550456T3 (ko)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012050627A2 (en) * 2010-02-22 2012-04-19 The Research Foundation Of State University Of New York Dopaminergic neurons derived from induced pluripotent stem cells and method of making same
US9994814B2 (en) 2013-04-09 2018-06-12 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Method for cellular restoration
KR20190089143A (ko) * 2019-07-23 2019-07-30 사회복지법인 삼성생명공익재단 환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법
US10717981B2 (en) 2018-01-18 2020-07-21 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Therapeutic compositions and methods of making and using the same
US10772911B2 (en) 2013-12-20 2020-09-15 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Cell free compositions for cellular restoration and methods of making and using same
CN113712995A (zh) * 2021-07-20 2021-11-30 河北医科大学 神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用
US11203754B2 (en) 2016-04-29 2021-12-21 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Microrna compositions and methods of making and using same
US11219643B2 (en) 2013-12-20 2022-01-11 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Compositions for cellular restoration and methods of making and using same
US11286463B2 (en) 2012-03-08 2022-03-29 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Reprogramming of aged adult stem cells

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040203142A1 (en) 2003-04-14 2004-10-14 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Growth of neural precursor cells using umbilical cord blood serum and a process for the preparation thereof for therapeutic purposes

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012050627A2 (en) * 2010-02-22 2012-04-19 The Research Foundation Of State University Of New York Dopaminergic neurons derived from induced pluripotent stem cells and method of making same
WO2012050627A3 (en) * 2010-02-22 2012-06-21 The Research Foundation Of State University Of New York Dopaminergic neurons derived from induced pluripotent stem cells and method of making same
US11286463B2 (en) 2012-03-08 2022-03-29 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Reprogramming of aged adult stem cells
US9994814B2 (en) 2013-04-09 2018-06-12 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Method for cellular restoration
US10772911B2 (en) 2013-12-20 2020-09-15 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Cell free compositions for cellular restoration and methods of making and using same
US11219643B2 (en) 2013-12-20 2022-01-11 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Compositions for cellular restoration and methods of making and using same
US11203754B2 (en) 2016-04-29 2021-12-21 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Microrna compositions and methods of making and using same
US10717981B2 (en) 2018-01-18 2020-07-21 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Therapeutic compositions and methods of making and using the same
KR20190089143A (ko) * 2019-07-23 2019-07-30 사회복지법인 삼성생명공익재단 환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법
CN113712995A (zh) * 2021-07-20 2021-11-30 河北医科大学 神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0718937A2 (pt) 2014-07-08
ES2550456T3 (es) 2015-11-10
KR100959995B1 (ko) 2010-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5871865B2 (ja) 神経前駆細胞又は神経幹細胞の神経細胞への分化及び増殖の誘導方法、分化及び増殖誘導用組成物、及び薬学的製剤
KR100959995B1 (ko) 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물
Khalili et al. Therapeutic benefit of intravenous transplantation of mesenchymal stem cells after experimental subarachnoid hemorrhage in rats
EP2076588B1 (en) Expansion method for adult stem cells from blood, particularly peripheral blood, and relative application in medical field
US20060247195A1 (en) Method of altering cell properties by administering rna
RU2323252C1 (ru) Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo
KR20140040696A (ko) 간엽줄기세포 및 면역조절 t 세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
KR20090055691A (ko) 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물
KR100887211B1 (ko) 중간엽 줄기세포를 포함하는 운동신경원질환 치료용 조성물및 치료방법
EP2063902A1 (en) Therapeutic cell medicine comprising skin tissue derived stem cell
KR100791487B1 (ko) 제대혈로부터 간엽줄기세포의 분리 및 배양 방법
KR101653197B1 (ko) 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법
TW201444973A (zh) 用於治療神經退化的細胞療法
KR100814504B1 (ko) 골수 간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법
US20200108100A1 (en) Neural stem cell therapy for stroke
WO2019216380A1 (ja) 脊髄損傷の治療剤
KR20080106152A (ko) 중간엽 줄기세포를 포함하는 운동신경원질환 치료용 조성물및 치료방법
KR20150062817A (ko) 태반의 융모막 또는 와튼제대교질 유래 간엽줄기세포로부터 신경세포 및 유모세포를 분화시키는 방법
Mao et al. Research Article Skin-Derived Precursor Cells Promote Angiogenesis and Stimulate Proliferation of Endogenous Neural Stem Cells after Cerebral Infarction
KR20110118084A (ko) 고막조직에서 유래된 다분화능 성체줄기세포, 이의 제조방법 및 이로부터 분화된 세포

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130430

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140515

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150507

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160516

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170516

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190430

Year of fee payment: 10