KR100791487B1

KR100791487B1 - 제대혈로부터 간엽줄기세포의 분리 및 배양 방법

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Publication number: KR100791487B1
Application number: KR1020060048009A
Authority: KR
Inventors: 영 근 권; 맹용선
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2006-05-29
Filing date: 2006-05-29
Publication date: 2008-01-03
Also published as: KR20070114449A

Abstract

본 발명은 인간 제대혈로부터 분리된 단핵구세포(Mononuclear cell, MNC)를 간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)로 선택적 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로, 제대혈 유래 단핵구세포를 기존의 간엽줄기세포와 공동배양 함으로서 단핵구세포를 간엽줄기세포 선택적으로 분화 유도하여 많은 양의 간엽줄기세포를 확보할 수 있으므로, 간엽줄기세포가 요구되는 줄기세포 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

제대혈, 단핵구세포, 간엽줄기세포, 선택적 분화, 줄기세포

Description

재대혈로부터 간엽줄기세포의 분리 및 배양 방법{A method for isolating and culturing mesenchymal stem cell derived from umbilical cord blood}

도 1a는 인간 제대혈 유래 단핵구세포의 모양과 특이적 표지인자 발현양상을 나타낸 도이고,

도 1b는 인간 제대혈 유래 단핵구세포(MNC)를 간엽줄기세포(MSC)로 분화시키고 각분화 단계에서의 특이적 표지인자의 발현 양상을 나타낸 도이며,

도 2a는 인간 제대혈 유래 MNC의 특이적 표지인자의 발현 양상을 유세포분석(Flow cytometry)을 통해 확인한 도이고,

도 2b는 인간 제대혈 유래 MNC와 MSC의 특이적 표지인자의 발현 양상을 면역학적 염색법(Immunostaing)을 통해 확인한 도이며,

도 3a는 인간 제대혈 유래 MNC와 MSC를 마트리겔(matrigel) 위에 올려놓고 혈관형성 능력을 비교한 도이고,

도 3b는 MSC를 조골세포, 연골세포 및 지방세포로 분화시킨 후 특이적 표지인자로 염색 및 발현 양상을 확인한 도이며,

도 4a는 GFP-렌티바이러스를 이용하여 MNC를 감염시킨 후 MSC와 공동배양을 함으로써 단핵구세포가 MSC 선택적으로 분화됨을 나타낸 도이고,

도 4b는 GFP-렌티바이러스를 이용하여 MSC를 감염시킨 후 MNC와 공동배양을 함으로서 단핵구세포가 MSC 선택적으로 분화됨을 나타낸 도이며,

도 5는 GFP-렌티바이러스를 이용하여 MNC를 감염시킨 후 MACS 을 이용하여 CD34 양성(positive), CD34 음성(negative cell)을 분리한 후 MSC와 공동배양 함으로써 MNC가 MSC 선택적으로 분화됨을 나타낸 도이고,

도 6은 MSC로 분화된 MNC를 MSC 선택적 표지인자로 면역학적 염색(immunostaining) 함으로서 MNC가 MSC 선택적으로 분화되었음을 나타내는 도이다.

본 발명은 인간 제대혈로부터 분리된 단핵구세포(Mononuclear cell, MNC)를 간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)로 선택적 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.

만성질환이나 암 등으로 인해 손상된 조직과 장기를 치료하는 기술은 약물요법 등의 내과적 치료와, 수술 등의 외과적 치료가 주류를 이루고 있다. 그러나 이는 증상만을 완화시키는 대중적 치료에 그치는 경우가 많고, 수술 후 합병증이 많이 일어나며, 장기간 치료시 경제적 부담이 크다는 등의 문제점이 있다.

최근에는 기존의 문제점을 해결하고 더욱 우수한 치료효과를 기재할 수 있는 조직 및 장기의 치료 기술의 한 방편으로, 자가복제(self-renewal) 및 분화(differentiation)가 가능한 세포를 재생이 필요한 조직 및 장기에 주입하는 방법이 주목받고 있다.

이러한 세포의 대표적인 예로 간엽줄기세포 및 이의 전구세포와 조혈모세포를 들 수 있다. 그 중 조혈모세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 혈관 내의 혈구세포로 분화되는 반면, 간엽줄기세포 및 이의 전구세포는 보다 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성의(multipotent) 줄기세포이다.

간엽줄기세포 및 이의 전구세포는 골수의 간질세포를 비롯하여 연골, 골, 지방조직, 근육, 건, 인대 및 신경조직 등 인체를 구성하는 각종 세포와 조직으로 분화할 수 있으므로, 재생의학의 실용화 측면에서 가장 핵심적인 세포로 각광받고 있다. 현재 간엽줄기세포 및 이의 전구세포를 얻을 수 있는 대표적 기원 조직은 골수(bone marrow)를 들 수 있다.

골수에는 간엽줄기세포 및 이의 전구세포가 풍부하지만, 골수 채취는 여러 번 수술침으로 찌르는 등 간헐적인(invasive) 기술이므로 실용화하기 어렵고, 시술할 경우 전신마취를 필요로 하므로 환자에게 정신적 및 육체적으로 큰 부담이 되며, 시술시 겪게 되는 고통 또한 크다. 이러한 채취과정의 어려움으로 인해, 골수보관은행 등의 인프라 구축은 비현실적이고 불가능한 반면 제대혈의 채취는 아기의 출산 후 간단하게 시행할 수 있으며, 산모와 아기에게 전혀 해가 없어 실용화 가능성이 높다. 또한 제대혈은 골수에 비해 보관산업이 활성화되어 있으므로, 공여자를 구하는 것도 용이하다.

제대혈 유래 단핵구세포는 혈관내피세포, 간엽줄기세포, 신경세포, 간세포 등 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 것으로 알려졌다. 그러나 이러한 특정 세포로의 분화를 유도하는 인자는 밝혀져 있지 않으며 정확한 메커니즘 또한 알려져 있지 않은 상태이다. 최근 제대혈 유래 단핵구세포로부터 분화된 간엽줄기세포를 이용한 세포치료가 진행되고 있으며 그 결과 또한 의미 있는 것으로 밝혀지고 있다.

제대혈은 많은 HSC(hematopoietic stem cell)를 포함하고 있는 것으로 알려졌으며 최근 전세계 적으로 많은 환자(hematologic and genetic disorder, lymphoid and myeloid leukemia, fanconi anemia, aplastic anemia, hunter syndrome, Wiskott-Aldrich syndrom, beta-thalassemia and neuroblastoma)들에게 임상치료로 사용되고 있다(Laughlin MJ, et al. N Engl J Med, 344, pp.1815-1822, 2001). 제대혈은 골수보다 많은 초기 조혈모세포(primitive hematopoietic cell)를 가지고 있으며 높은 증식능력과 확장능력을 가진 원세포(progenitor cell)를 포함하고 있는 것으로 알려지고 있다. 조혈작용(hematopoiesis)은 조혈모 줄기세포(hematopoietic stem cell)의 자가 증식과 원세포 혹은 성숙한 세포로 분화하는 복잡한 과정으로서 골수의 미세 환경 내에서 기질세포(stromal cell)와 주변의 매트릭스(matix)와 밀접한 관계 하에서 일어난다(Orkin S., Curr Opin Cell Biol, 7, pp.870-877, 1995).

조혈작용에는 HSC(hematopoietic stem cell)과 MSC(mesenchymal stem cells) 두 가지 세포가 관여한다. MSC 는 골수의 기질세포와는 전혀 다른 세포로서 증식능력이 좋은 섬유아세포-유사 부착 세포(fibroblast-like adherent cell)이며 다분 화(multipotent) 가능하고 골수, 스트로마(stroma), 뼈(bone), 연골 등과 같은 중간엽(mesenchymal) 조직의 재생에 기여할 수 있는 지속적인 전구세포(long-lasting precursor cell)이다. 흥미롭게도 MSC는 면역억제의 처리 과정 없이 이식을 할 수 있다는 장점 있어 세포치료에 있어서 최고의 대안으로 떠오르고 있다(Mareschi K, et al. Haematologica, 86, pp.1099-1100, 2001). 골수가 MSC의 가장 일반적이 원료가 되고 있으나 골수는 채취하는데 환자에게 고통을 주기 때문에 어려운 점이 있다. 그러나 제대혈은 구하기가 쉽고 자가 분열 능력이 뛰어나 여러 가지 면에서 우수한 줄기세포를 제공하는 근원이 되고 있다. 따라서 제대혈 유래 단핵구세포에서 MSC의 분화유도는 향후 치료용으로 개발 가능성이 매우 높다고 할 수 있다. 그러나 아직까지는 제대혈유래 단핵구 세포에서 MSC로 분화하는 빈도가 작아 임상치료 목적으로 사용하기에 한계가 있다. 따라서 제대혈유래 단핵구세포에서 MSC 로의 분화에 대한 심층적이 연구가 요구되고 있는 실정이다.

간엽줄기세포로의 분화 방법과 관련된 기존 특허로는 등록특허출원 10-0489248호에 단핵세포를 배양하여 간엽줄기 전구세포 특이 항원에 대한 항체와 결합한 세포를 분리하여 배양하여 제대혈 유래 간엽줄기 전구세포를 분리 배양하는 방법이 기재되어 있으나, 많은 양의 세포를 분화시키는 것이 아니라 단순히 항체와 결합한 세포를 분리하여 배양하는 방법이다.

이에, 본 발명자들은 제대혈로부터 분리된 단핵구세포를 간엽줄기세포로 선택적 분화 및 많은 양의 세포가 분화되도록 유도하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 제대혈 유래 단핵구세포를 기존의 간엽줄기세포와 공동배양 함으로서 단핵구세 포를 간엽줄기세포 선택적으로 분화 유도하여 많은 양의 간엽줄기세포가 확보됨을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간 제대혈로부터 분리된 단핵구세포(Mononuclear cell, MNC)를 간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)로 선택적 분화를 유도하는 방법을 이용하여 간엽줄기세포가 요구되는 줄기세포 관련 질환의 예방 및 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 제대혈로부터 분리된 단핵구세포(Mononuclear cell, MNC)를 간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)로 선택적으로 분화를 유도하는 유도 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 제대혈 유래 단핵구세포를 기존의 간엽줄기세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 제대혈 유래 단핵구세포를 간엽줄기세포로 선택적으로 분화를 유도하는 유도 방법을 제공한다.

보다 상세하게, 본 발명은 출산 24시간 이내, 바람직하게는 출산 2시간 이내의 제대혈에서 단핵구세포(Mononuclear cell, MNC)를 분리하고, 얻어진 단핵구세포를 간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC) 또는 이의 원심분리 상층액을 처리하여 배양함으로서, 많은 양의 간엽줄기세포를 손쉽게 수득할 수 있는 제대혈 유래 단핵구세포를 간엽줄기세포로 선택적으로 분화를 유도하는 유도 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 간엽줄기세포로의 선택적 분화를 확인하고자, 제대혈 유래 단핵구세포에 GFP-렌티바이러스를 감염시켜 GFP를 발현하는 단핵구세포를 간엽줄기세포와 공동 배양하여 선택적 분화를 확인한 결과 단핵구 세포가 모두 간엽줄기세포로 분화됨을 확인하였고, 또한 본 발명의 방법이 CD34 표지인자 의존적인 간엽줄기세포로의 분화인지 비의존적인 간엽줄기세포로의 분화인지 확인한 결과 CD34에 독립적으로 단핵구세포가 간엽줄기세포로 분화하였으며, 상기 방법으로 분화한 간엽줄기세포는 실질적인 간엽줄기세포임을 확인하였다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 수득한 간엽줄기세포를 환자의 손상기관에 이식함으로서 줄기세포 관련 질환을 치료하는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 얻어진 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 간엽줄기세포가 요구되는 줄기세포 관련 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의된 줄기세포 관련 질환은 간엽줄기 세포가 분화 가능한 기관의 질환, 즉, 뇌, 척추 및 신경계 질환을 포함한다.

보다 상세하게는, 본원에서 정의된 간엽줄기 세포가 분화 가능한 기관의 질환은 파킨슨병, 헌팅톤병, 알츠하이머, 간질, 뇌졸중, 루게릭병, 심부전증, 척추신경 손상 질병, B형 간염, C형 간염, 간경화, 상처치료, 당뇨병, 동맥경화증, 퇴행성관절염, 골다공증 및 근육 위축증을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담 체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여 형태는 주사제에서 통상적으로 사용되는 어떠한 기제라도 사용 가능하다. 예를 들어, 기재는 증류수, 염화나트륨 염 용액, 염화나트륨 및 무기물염의 혼합물 또는 그와 유사한 혼합물, 만니톨, 락토스, 덱스트란, 글루코스 등의 용액, 글리신, 아르기닌 같은 아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염 용액 및 글루코스 용액의 혼합 및 이와 유사한 용액 등을 포함한다. 또한, 주사제는 통상의 방법으로 삼투압 조절제, pH 조절제, 참기름이나 콩기름과 같은 식물성 기름, 또는 레시틴, 비이온성 표면활성제와 같은 표면활성제를 상기한 기재에 첨가하여 용액, 현탁액 또는 콜로이드 용액 등으로 제조할 수 있다. 이러한 주사제는 분말형, 동결건조형 등으로 제조하여 사용하기 바로 전에 용해하여 쓸 수도 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 혈관신생에 의해 유발되는 질환 부위에 국부적으로 0.0001 내지 1000 mg/㎏의 양을 1주에 1회 내지 수회 투여하거나, 수술 이후에 카테터 (catherter)와 같은 것을 통해 일회 투여하여 목표 지점에서 흡수되도록 할 수 있다. 그 투여량은 투여경로, 질환의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정 하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 참고예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 인간 제대혈유래 단핵구 세포의 분리및 배양

분만직후 (적어도 2시간 이내) 사람의 제대혈 (연세대학교 세브란스 산부인과, human umbilical cord blood)에서 피콜-그레디언트 방법(Ficoll-gradient method, Amersham, USA)을 이용하여 단핵구세포를 분리하였다. 분리한 MNC를 EGM (growth factor supplementary medium, Cambrex, USA)배지가 담겨진 피브로넥틴이 처리된 (Fibronectin(Sigma, USA) coated) 6 웰 플레이트에 접종한 후, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 3일후에 배지를 교체하여 부착하여 자라지 않은 세포(nonadherent cell)들은 제거하고 부착하여 자란 세포(adherent cell)만을 선택하여 배양하였다. 이후 매 2일마다 배지를 교체하여 7일이 지나면서 광학 검 경(light microscopy)을 통해 관찰하였다. 7일째의 MNC로부터 RNA를 분리하여 역전사 및 증폭시킨 후 여러 가지 표지 유전자의 mRNA 전사 양상을 확인하여 도 1a에 나타내었다.

참고예 2. 인간 제대혈 유래 단핵구 세포에서 간엽줄기세포로의 분화 및 표지 유전자 발현분석

인간 제대혈에서 분리한 MNC를 EGM(growth factor supplementary medium, Cambrex, USA) 배지가 담겨진 피브로넥틴이 처리된 6 웰 플레이트에 접종한 후, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 3일후에 배지를 교체하여 부착하여 자란 세포만을 선택하여 배양하였다. 이후 매 2일마다 배지를 교체하여 7일이 지나면서 광학 검경(light microscopy)을 통해 관찰하여 MSC로의 분화를 관찰하였다. MNC와 MSC 로부터 RNA를 분리하여 역전사 및 증폭시킨 후 MSC 표지 유전자의 mRNA 전사 양상를 확인 하여 도1b에 나타내었다.

참고예 3. 유세포 분석( Flow cytometry ) 및 면역학적 염색법( immunostaining )을 통한 제대혈 유래 단핵구세포의 표지인자 발현분석

인간 제대혈에서 분리한 MNC(7일 배양)에 2mM EDTA 를 포함하는 PBS를 처리하여 떼어냈다. PBS로 두 번 세척한 후 형광이 결합된 조혈모세포 표지 인자를 인식하는 항체와 섞어 30분 동안 4 ℃에서 배양하였다. 2% 파라포름 알데하이드로 고 정하고 유세포 분석을 진행하여 도 2a에 나타내었다. MNC 와 MNC 로부터 분화된 MSC 가 다른 종류의 세포임을 확인하기위해서 MNC 와 MSC 선택적 표지인자로 면역학적 염색법을 수행하였다. 각 세포를 파라포름 알데하이드로 고정하고 0.1% 트리톤(Triton)X-100 으로 투과한 후 MNC(CD14, CD45), MSC(α-SMA, PDGFRβ) 선택적 표지인자를 인식하는 항체(1차 항체)를 넣어 2시간 상온에서 배양한 후 PBS로 3번 세척하고 1차 항체를 인식하는 형광이 결합된 2차 항체를 넣어 1시간 배양하였다. PBS로 3번 세척한 후에 마운팅(mounting)한 후 형광현미경을 통해 관찰하여 결과를 도2a에 나타내었다.

참고예 4. 인간 제대혈 유래 단핵구세포와 간엽줄기세포의 관형성 분석

10㎎단백질/㎖ 농도의 매트리젤(Collaborative Biomedical Products, USA)을 250㎕을 직경 16㎜의 세포배양 웰에 넣어 37℃에서 30분간 중합시켰다. 인간 제대혈 유래 단핵구 세포(day7)와 간엽줄기세포(1x10⁵/well)를 매트리젤에 올려놓고 16시간 동안 배양하였다.

현미경을 통해서 관찰한 결과 단핵구세포와 간엽줄기세포 모두 관형성을 이루지 못하는 것을 확인하였다(도3a 참조).

참고예 5. 간엽줄기세포의 조골세포( osteoblast ), 연골세포( chodrocyte ) 및 지방세포( adipocyte )로의 분화능 분석

간엽줄기세포는 여러 가지 세포로 분화하는 능력을 가지고 있기 때문에 제대혈유래 MNC로부터 분화된 MSC 가 조골세포, 연골세포 및 지방세포로 분화 할 수 있는지 확인하기 위해 각 세포로의 분화유도 배지〔osteogenic induction media(PT-3002), chondrogenic induction media(PT-3003), adipogenic induction media(PT-3004) cambrex, USA)〕를 넣어 3주 동안 배양하였다.

배양 3주 후 MSC로부터 각각의 세포로 분화되었는지 확인하기 위해 각각의 세포를 확인하기 위한 염색법을 수행하였다(von kossa staining: osteoblast, safranin-O-staining: chondrocyte, oil-red staining: adipocyte (Yang S.E, Cytotherapy., pp.6476-6486, 2004). 또한 세포 선택적인 표지 유전자의 발현을 확인하기 위해 각 세포로부터 RNA을 분리 하여 PCR을 수행 하였다. 그 결과 MSC가 각각의 세포로 분화되었음을 확인하였고, 세포 선택적 표지 유전자 또한 발현되는 것을 확인하였다(도3b 참조).

실시예 1. 인간 제대혈 유래 단핵구세포와 간엽줄기세포의 공동배양을 통해 단핵구세포를 간엽줄기세포로 분화를 유도

인간 제대혈유래 MNC(day7)을 간엽줄기세포(MSC)가 자라고 있는 플레이트에 넣어주어 공동배양 하였다. 이 후 매 2일마다 배지를 바꾸어 주면서 MNC의 MSC로 분화를 관찰한 결과 MNC가 모두 MSC 로 분화됨을 확인하였다.

실시예 2. 인간 제대혈유래 단핵구세포와 간엽줄기세포의 공동배양을 통한 분화 분 석

인간 제대혈유래 MNC(day7)에 GFP-렌티바이러스(Green Fluorescent Protein-lentivirus)를 감염시켜 발현시켜, 48시간 후 GFP를 발현하는 MNC를 MSC가 자라고 있는 플레이트에 넣어 공동배양을 한다. 이 후 매 2일마다 배지를 바꾸어 주면서 MNC의 MSC로 분화를 관찰한 결과 MNC가 모두 MSC 로 분화됨을 확인하였다(도 4a 참조). MSC에 GFP-렌티바이러스를 감염시켜 발현시켜 48시간 후 GFP를 발현하는 MSC를 MNC가 자라고 있는 플레이트에 넣어주어 공동배양 하였다. 이 후 매 2일마다 배지를 바꾸어 주면서 MNC의 MSC로 분화를 관찰한다. 그 결과 MNC가 모두 MSC로 분화됨을 확인하였다(도 4b 참조).

실시예 3. 인간 제대혈유래 단핵구세포가 간엽줄기세포로 분화시 CD34 표지인자 의존적 분화 유무 분석

인간 제대혈유래 MNC에 GFP-lentivirus을 감염시켜 발현시킨다. 48시간 후 GFP를 발현하는 MNC에 2mM EDTA 를 포함하는 PBS를 처리하여 떼어낸다. CD34 마이크로비드(130-046-702, Direct CD34 Progenitor cell isolation kit) MicroMeads 를 넣어 4℃에서 30분 배양한다. MACS(Magnetic associated cell sorting)를 이용하여 CD34표지인자를 발현하는 세포와 발현하지 못하는 세포로 분리한 후 MSC가 자라고 있는 플레이트에 넣어 공동 배양한다. 매 2일마다 배지를 교체해 주면서 MNC가 MSC로 분화하는지 관찰한다. 그 결과 CD34표지인자 독립적으로 MNC가 MSC 선택적으로 분화하는 것을 확인하였다(도 5 참조).

또한 MSC로 분화한 MNC가 실질적으로 MSC 인지 확인하기 위해 MSC 표지인자의 하나인 α-SMA로 면역학적 염색법을 수행하였다. CD34 표지인자를 발현하는 세포와 발현하지 않는 MNC에서 MSC로 분화한 각 세포를 파라포름 알데하이드로 고정하고 0.1% 트리톤X-100으로 투과한 후 α-SMA 항체(1차 항체)를 넣어 2시간 상온에서 배양하였다. 이후 PBS로 3번 세척하고 1차 항체를 인식하는 형광이 결합된 2차 항체(anti-rabbit IgG TRITC)를 넣어 1시간 배양하였다. PBS로 3번 세척한 후에 마운팅한 후 형광현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과 CD34 독립적으로 MNC가 MSC로 분화하였으며 이렇게 분화한 MSC는 실질적인 MSC라는 것을 확인 하였다(도 6 참조).

상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 제대혈 유래 단핵구세포를 기존의 간엽줄기세포와 공동배양 함으로서 단핵구세포를 간엽줄기세포 선택적으로 분화 유도하여 많은 양의 간엽줄기세포를 확보할 수 있으므로, 간엽줄기세포가 요구되는 줄기세포 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

출산 24시간 이내의 제대혈에서 단핵구세포(Mononuclear cell, MNC)를 분리하고, 얻어진 단핵구세포를 간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)와 공동 배양함을 특징으로 하는 단핵구세포를 간엽줄기세포로 선택적으로 분화를 유도하는 유도 방법.
제 1항의 방법으로 수득한 간엽줄기세포를 인간을 제외한 포유동물의 손상기관에 이식함을 특징으로 하는 줄기세포 관련 질환의 치료 방법.
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