CN113712995A - 神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用 - Google Patents
神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113712995A CN113712995A CN202110819246.1A CN202110819246A CN113712995A CN 113712995 A CN113712995 A CN 113712995A CN 202110819246 A CN202110819246 A CN 202110819246A CN 113712995 A CN113712995 A CN 113712995A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cells
- cells
- spinal cord
- cord injury
- nsc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 title claims abstract description 51
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 title claims description 92
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 28
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 12
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 11
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 9
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 6
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims description 6
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000006748 scratching Methods 0.000 claims description 3
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 abstract description 10
- 230000007659 motor function Effects 0.000 abstract description 10
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 abstract description 8
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 31
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 15
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 15
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 7
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 7
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 206010061431 Glial scar Diseases 0.000 description 4
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- 230000009519 contusion Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 4
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 3
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 3
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 3
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 3
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 3
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 2
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 2
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 2
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBOKASXZHPZFRZ-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-indole-4,6-diamine Chemical compound N1C2=CC(N)=CC(N)=C2C=C1C1=CC=CC=C1 UBOKASXZHPZFRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-9,10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(O)=C(O)C(S(O)(=O)=O)=C2 JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 206010039203 Road traffic accident Diseases 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010048992 Transcription Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100023489 Transcription factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 241000364021 Tulsa Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011759 adipose tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000034184 interaction with host Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002684 laminectomy Methods 0.000 description 1
- 239000008141 laxative Substances 0.000 description 1
- 229940125722 laxative agent Drugs 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001144 postural effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009719 regenerative response Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明将人诱导多能干细胞体外分化为NSC、人脐带分离培养为MSC辅以辅料，按照1:1的比例使用的，溶媒物用的是PBS，将获得的细胞生物产品联合原位移植到急性脊髓损伤(胸髓T10阶段)的小鼠脊髓，有效促进神经损伤修复、改善运动功能。本发明治疗动物急性脊髓损伤产品可以在宿主体内向神经元与胶质细胞分化，缩小胶质瘢痕面积、减少纤维化、降低炎症水平，从而改善动物运动功能，尤其是肢体协调性，为后续治疗脊髓损伤、促进组织修复充分发挥作用。
Description
技术领域
本发明涉及人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源 的间充质干细胞(MSC)作为治疗动物急性脊髓损伤产品的应用，属于细胞联 合治疗技术领域。
背景技术
脊髓损伤(spinalcordinjury，SCI)是一种常见的疾病，由于损伤后轴突无法 再生，可能导致神经功能的破坏和永久丧失，从而中断大脑和身体之间的联系。 根据现有证据，在过去十年中，中国的脊髓损伤发生率急剧增加，这主要是由于 车祸和高处跌落引起的脊柱创伤增多。《全球疾病、伤害和危险因素负担研究》 报告了93万(95％不确定区间[UI]78-116万)新的脊髓损伤病例，2016年脊髓损 伤导致950万人(95％不确定区间[UI]670-1240万)的生活残疾。
根据大量的临床前研究，干细胞治疗在中枢神经系统(CNS)损伤的治疗中 有很大的应用前景。在动物模型中，创伤性脊髓损伤后给予干细胞治疗可以减少 神经元的丢失并改善功能恢复。细胞治疗的两个理想目标是诱导营养反应(如产 生细胞外基质和扩散生长因子)和用移植衍生的细胞(如新的少突胶质细胞和神 经元)替换因损伤或疾病而丢失的细胞，这将增强宿主中枢神经系统的再生反应。 移植细胞分泌的营养因子已被证明支持神经元存活和轴突的生长。间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs)由于易于在原代培养中分离和保存、不引起伦 理问题以及不太可能发展为肿瘤，在细胞治疗中也引起了人们的关注。此外，交 叉反应性极小或不存在。在轻度和重度脊髓损伤的大鼠模型中，MSCs有助于缩 小脊髓损伤腔的大小，同时分化为胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的星形胶质 细胞和神经元细胞。MSCs也已被证明可分化为少突胶质细胞，但不能分化为表 达神经元标记物的细胞[神经元细胞核(NeuN)]。基于这些结果，MSCs可能在 某些方面具有治疗局限性。而神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)在脊髓损伤 的治疗中具有广阔的应用前景。神经干细胞可以从feotal脑和脊髓组织中获得， 也可以从胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)中获得。这些开创性的 研究表明，神经干细胞在损伤部位存活并分化为神经元和胶质细胞，通过表达神 经营养因子和促进轴突生长以及髓鞘的再生，从而减轻氧化应激、促进血管生成、 整合突触传递和促进神经再生。然而，对于移植的神经干细胞调节局部和全身的 炎症过程、纤维化以及星形胶质细胞活化的潜能的关注较少，这些都是脊髓损伤发病机制中不可或缺的过程。迄今为止，来源于iPSCs的NSCs(iPSC-NSCs)的产 生不仅解决了伦理问题和可用性方面的限制，而且与从ESCs或foetal组织获得 的NSCs相比，进一步提供了自体移植的可能性。多个研究小组对iPSC-NSCs移植 治疗SCI进行了开创性研究，取得了很好的效果，大多数研究针对亚急性和慢性 SCI。先前关于hiPSC-NSCs治疗脊髓损伤的文献集中在轴突再生、肿瘤发展和突 触形成。此外，很少有研究比较NSC和MSC治疗的疗效，但是在亚急性SCI模 型中，NSCs和MSCs在SCI损伤后至少7天被移植。因此，本研究将人脐带间充 质干细胞(huMSCs)或人iPSC-NSCs(hiPSC-NSCs)移植到脊髓损伤小鼠模型中， 观察急性期潜在的治疗恢复效果和损伤部位周围炎症反应性改变以及全身炎症 扩散同时观察纤维化和胶质瘢痕的形成。
发明内容
本发明的目的在于提供人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人 脐带来源的间充质干细胞(MSC)作为治疗动物急性脊髓损伤产品的应用，将 人诱导多能干细胞体外分化为NSC、人脐带分离培养为MSC，并辅以辅料联合 (NSC&MSC)原位移植到急性脊髓损伤(胸髓T10阶段)的小鼠脊髓，有效 促进神经损伤修复、改善运动功能。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质干细 胞(MSC)作为治疗动物急性脊髓损伤产品的应用；
本发明通过将人诱导多能干细胞体外分化为NSC、人脐带分离培养为MSC， 并辅以辅料得到治疗动物急性脊髓损伤产品，并将获得的产品原位移植到急性脊 髓损伤的脊髓；
所述人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质 干细胞(MSC)比例按照1:1的比例使用的，溶媒物用的是PBS。
本发明的另一目的在于，提供一种治疗动物急性脊髓损伤产品，包括比例为 1:1的人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质干 细胞(MSC)的细胞混合产品。
本发明的另一目的在于，提供一种治疗动物急性脊髓损伤产品的制备方法； 所述人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质干细 胞(MSC)比例按照1:1的比例使用的，溶媒物用的是PBS；
所述人诱导多能干细胞体外分化为NSC通过人外周血单个核细胞重编程为 诱导多能干细胞，干细胞在神经诱导剂作用下，体外分化为神经干细胞，置于 37℃，5％CO2培养箱中；
在分化为神经干细胞的过程中，用37℃预热的神经诱导培养基隔天换液， 共培养七天，第八天可将细胞消化传代，得到P0 NSC。
所述人脐带分离培养为MSC，包括以下步骤：
S1：使用组织块法贴壁分离脐带间充质干细胞，并使用无血清培养基培养， 使用差速贴壁法纯化细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中；
S2：在培养皿上进行随机直线划痕，以便固定华通胶，并在超净台中干燥 5～10min，加入3～5ml无血清培养基，每1～3天续加2～3ml培养基，观察细胞迁 移及生长状况；
S3：传代培养：在传代细胞融合度至85～95％时，继续传代培养，传代过程 中将细胞悬液放入培养皿，放入培养箱中静置5～10min，将悬液中的细胞重新放 入新的培养皿中，将已经贴壁的细胞弃去；
S4：冻存：将部分细胞离心后以3-4×105/mL放入1ml冻存液中，放入程 序性冻存盒中，置于-80℃冰箱内；
S5：建立脐带间充质干细胞的数据库，并使该数据库与冻存细胞进行关联。
所述S3中培养的条件为：置于37℃，5％CO2培养箱中；
所述S4中的冻存液成分包括：70％无血清培养基，20％胎牛血清(ThermoFisher)，10％二甲基亚砜(Sigma)。
本发明的有益效果：
本发明将人诱导多能干细胞体外分化为NSC、人脐带分离培养为MSC辅以 辅料，按照1:1的比例使用的，溶媒物用的是PBS，将获得的细胞生物产品联合 原位移植到急性脊髓损伤(胸髓T10阶段)的小鼠脊髓，有效促进神经损伤修复、 改善运动功能。本发明治疗动物急性脊髓损伤产品可以在宿主体内向神经元与胶 质细胞分化，缩小胶质瘢痕面积、减少纤维化、降低炎症水平，从而改善动物运 动功能，尤其是肢体协调性，为后续治疗脊髓损伤、促进组织修复充分发挥作用。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1 hiPSC-NSC和huMSC的特征。A：hiPSC-NSC中nestin、SOX2和PAX6 呈阳性。B：流式细胞术检测第4代细胞表面抗原。huMSCs对CD29，CD44， CD73，CD90和CD105呈阳性。相反，在huMSC中检测到很少的造血谱系标 志物HLA-DR和CD45的表达。C：油红O染色显示huMSCs分化为成脂细胞系。 Bar:50μm。D：茜素红染色显示诱导的huMSCs细胞外基质钙化，证实huMSCs 分化为成骨细胞。Bar:500μm，E：藏红O染色显示软骨细胞分泌细胞外基质。
图2病理形态学改变。不同组在术后7天(A-C和J-L)、术后14天(D-F 和M-O)和术后28天(G-I和P-R)的HE染色和Masson三色染色图像。术后 28天三组损伤面积均明显小于术后7天并且在术后28天NSC组和MSC组受伤 面积均明显小于对照组。在术后28天，MSC和NSC组的炎性细胞浸润水平明 显低于对照组。NSC组和MSC组的纤维化率明显低于对照组(U)。Scale bar:100 μm.*:p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001；
图3是本发明实施例所述病理形态学改变对照图；
图4是本发明实施例所述脊髓纵切面(14μm)免疫组化GFAP检测星形胶 质细胞增生。比例尺：500μm。
图5：脊髓损伤部位GFAP表达水平(A)及术后7、14、21天血清IL-6(B)、 VEGF(C)、TNF-α(D)的水平。所有数据均以平均数±均值标准误差表示： 采用方差分析和Tukey事后检验确定显著性。*：p<0.05；***：p<0.01；***： p<0.001。
图6：移植干细胞的存活和分化，术后14天GFAP、TUJ-1和SOX2标记物 免疫荧光染色的荧光图像。比例尺：25μm。
图7：脊髓损伤后干细胞移植后运动功能的恢复。使用BMS试验评估PBS 或干细胞治疗小鼠的运动功能：BMS得分(A)分项评分(B)协调性(C)躯 干(D)以及右侧(E)和左侧(F)的步态评分。NSC组的所有动物在旷场BMS 试验中的表现均显著高于MSC处理组和PBS对照组(A)。NSC组的分项得分 显著高于其他治疗组。此外，MSC移植的动物没有表现出比对照组更好的表现(B)。关于协调性(C)，体重支持的步态是必不可少的，NSC组表现出稳定 但不显著的提高趋势。NSC组躯干功能恢复早于MSC组和对照组(D)。移植 干细胞(E和F)后，NSC组的步态功能表现稳定但不显著的提高趋势。G-I， 术后1天小鼠肢体功能；G’-I’，术后28天小鼠肢体功能。*与对照组比较p<0.05； #：与MSC组比较p<0.05。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根 据这些附图获得其他的附图。
实施例1
道德声明：
所有人体标本的采集和动物实验的实施都是经过河北医科大学实验伦理委员会的 批准(保证号：20190505)。实验是按照实验动物管理与使用指南进行的。
获取iPSC来源神经干细胞
hhiPSCs是使用我们实验室的一项研究(细胞系：HEBHMUi002-a)中先前描 述的方案从真皮成纤维细胞生成的。简单地说，根据制造商的指南，使用Cytotune TM-iPS 2.0仙台重编程套件(Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)， 将第4代的成纤维细胞重编程为hiPSC。在转导的第0天，将4个重编程因子添 加到成纤维细胞中，并在24小时后更换培养基以去除病毒。转导后第7天，将 细胞以推荐的密度转移到6孔板中，该板用Geltrex hESC认证的基底膜基质 (Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)包被。24小时后，将培养 基更改为Essential 8TM培养基(Gibco，美国纽约州格兰德岛)；在转导后平均 14天，就可以手动挑选hiPSC菌落，并使用经过验证的标准方法进行表征。根据 推荐的方案，我们使用了PSC神经诱导培养基(Gibco)诱导iPSC成为NSC。简 而言之，将iPSCs在PSC神经诱导培养基[添加了10％神经诱导补充剂(Gibco) 的神经基础培养基(Gibco)]上，在涂有Geltrex的6孔板上进行培养，每隔一天 更换一次。7天后，iPSCs分化为神经干细胞。衍生细胞用4％多聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO，USA)固定在DPBS(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中进行免 疫荧光染色[Nestin，SOX2，PAX6，PAX6和八聚体结合转录因子4(OCT4)：Abcam， Cambridge，UK，详细信息见附加文件1：表。S1]。
huMSC的培养和特征：
人脐带是从河北医科大学附属医院剖腹产后足月新生儿获得的(中国石家 庄)。患者已被事先告知，并同意捐赠脐带。通过组织块培养获得huMSCs。简 短地说，在无菌条件下，将脐带切成3-4厘米的小块，然后放在装有盐溶液的培 养皿中；沿脐静脉切开每一部分，并轻轻去除外膜，静脉壁和动脉壁。用剪刀将 残留的组织切成1mm3的切片，并均匀地固定在培养皿的底部。将完整的MSC 生长培养基和补充剂(中国，北京，京蒙)添加到每个培养皿中，其体积应覆盖 培养皿底部的薄薄一层，然后置于37℃，
5％CO2的培养箱中。17天后，可以观察到细胞生长。当细胞达到约90％汇合时 传代。用流式细胞术检测3-5代细胞表面抗原分化簇(CD)29、CD44、CD73、 CD90、CD105、cd45和HLA-DR的水平。用合适的分化培养基(Cyagen，苏州， 中国)进行脂肪诱导，骨形成和软骨细胞分化实验。油红O染色，茜素红染色 和番红O染色用于特定染色。
实施例2
脊髓损伤模型建立
腹腔注射1％戊巴比妥钠(50mg/kg，腹膜内注射)麻醉八周大的BALB/c 雌性免疫缺陷雌性裸鼠(19-22g，n＝54)，武汉，湖北信润德化工有限公司。中 国)。在第10胸椎进行椎板切除术，以暴露脊髓硬脊膜的背表面。用重10g， 高5cm的中石撞击器(中石，北京，中国)在T10水平诱发脊髓挫伤。
实施例3
治疗动物急性脊髓损伤产品的获得；
所述人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质 干细胞(MSC)比例按照1:1的比例使用的，溶媒物用的是PBS；
所述人诱导多能干细胞体外分化为NSC通过人外周血单个核细胞重编程为 诱导多能干细胞，干细胞在神经诱导剂作用下，体外分化为神经干细胞，置于 37℃，5％CO2培养箱中；
在分化为神经干细胞的过程中，用37℃预热的神经诱导培养基隔天换液， 共培养七天，第八天可将细胞消化传代，得到P0 NSC。
所述人脐带分离培养为MSC，包括以下步骤：
S1：使用组织块法贴壁分离脐带间充质干细胞，并使用无血清培养基培养， 使用差速贴壁法纯化细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中；
S2：在培养皿上进行随机直线划痕，以便固定华通胶，并在超净台中干燥 5～10min，加入3～5ml无血清培养基，每1～3天续加2～3ml培养基，观察细胞迁 移及生长状况；
S3：传代培养：在传代细胞融合度至85～95％时，继续传代培养，传代过程 中将细胞悬液放入培养皿，放入培养箱中静置5～10min，将悬液中的细胞重新放 入新的培养皿中，将已经贴壁的细胞弃去；
S4：冻存：将部分细胞离心后以3-4×105/mL放入1ml冻存液中，放入程 序性冻存盒中，置于-80℃冰箱内；
S5：建立脐带间充质干细胞的数据库，并使该数据库与冻存细胞进行关联。
所述S3中培养的条件为：置于37℃，5％CO2培养箱中；
所述S4中的冻存液成分包括：70％无血清培养基，20％胎牛血清(ThermoFisher)，10％二甲基亚砜(Sigma)。
实施例4
人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)、人脐带来源的间充质干细胞 (MSC)以及联合移植的对照实验；
设计对照实验，NSC组、MSC组以及(NSC&MSC)联合移植组；
在NSC组中，用10μl Hamilton注射器和立体定向微注射器(RWD，中国 深圳)以0.5μl/min的速率，将溶在1μl PBS中的1×105个hiPSC-NSCs移植 到18只小鼠的损伤脊髓(距病变中心口1mm)。
采用同样的方法，18只小鼠注射1μl PBS(MSC组)的1×105个huMSCs， 18只小鼠注射1μl PBS(对照组)。所有手术均在麻醉下进行，并努力通过选 定的人道终点尽量减少动物的痛苦；
(NSC&MSC)联合移植组，按照1:1的比例使用的，溶媒物用的是PBS；
运动功能行为测试
在术后第1、3、5、7、14、21和28天，从每个治疗组随机选择6只小鼠进 行行为测试。后肢运动功能用Basso小鼠量表(BMS)在空旷场地进行测试评估。 将小鼠放在尺寸为20cm×40cm的平面上，观察3分钟。两名观察者同时对随 机分组的动物进行行为学评估，包括协调性、躯干不稳和步态。0分表示松弛瘫 痪；9分代表正常步态。简而言之，当仅发生一两次可评估的步态时，无论这些 步态是否显示出协调性，我们都将鼠标打分为“无协调性”。因此，我们将协调 划分为：无(无或3个可评估步态)，一些(小于50％的评估步态)和大多数(≥50％的可评估步态)。严重的躯干不稳有两种表现：后躯表现出严重的姿势 缺陷，如在测试过程中主要表现为极度倾斜、明显步履蹒跚和/或接近萎缩，或 任何臀部撞击、痉挛、脊柱侧凸事件，导致一条或两条后肢无法行走。当有五个 或五个以上的轻微躯干不稳定，少于五个无法行走的事件，或者在测试期间严重 躯干不稳的情况不明显时，对轻微躯干不稳进行评分。如果在测试期间发生的轻 微躯干不稳定事件少于5次，则对正常躯干稳定性进行评分。在步态评分中，0 分表示没有步态，1分、2分和3分分别表示偶尔、频繁和一致的背向步态前进， 没有足底步态前进。4、5和6分分别代表偶尔、频繁和持续的足底步伐前进。
组织学和免疫荧光染色
从每个治疗组中随机选择6只小鼠，在手术后7、14和28时间点处死。小 鼠麻醉后，用生理盐水灌流，然后用PBS中的4％多聚甲醛(PFA)灌注固定。将 脊髓从体内取出，在4％PFA(4℃)中保存过夜，然后在30％蔗糖PBS中冷冻过 夜。第二天，将脊髓修剪至受伤部位(全长的5毫米)，包埋在Tissue-Tek复合 材料(德国韦茨拉尔)中，冷冻并保持在-80℃。取厚14μm的组织切片进行苏 木精-伊红染色(H&E)和Masson三色染色。针对人类细胞核的一抗(HuNu，人 类细胞核抗体，Gene Tex，Irvine，CA，美国)用于鉴定移植到小鼠脊髓中的人类细胞。使用针对GFAP(Thermo Fisher Scientific)、βIII微管蛋白(TUJ-1，Abcam，Cambridge，MA，UK)和SOX2(Abcam，Cambridge，MA，UK)的抗体跟踪移 植干细胞的情况及其与宿主组织的相互作用的情况。冰冻切片在0.1％tritonx-100 中渗透20分钟。通过将切片与5％山羊血清的PBS孵育30分钟，然后与一抗溶 液孵育，来阻断非特异性蛋白质结合。4℃孵育过夜后，用0.05％PBS-tween依 次洗涤2次，每次PBS洗涤5分钟。然后将切片与DyLight594偶联的山羊抗小 鼠IgG(H+L)二抗和FITC偶联的山羊抗兔IgG(H+L)抗体(ThermoFisher Scientific)在室温下孵育1小时。细胞核用4,6-二氨基-2-苯基吲哚复染(DAPI，Cell Signaling，Danvers，MA，USA)。
血清细胞因子水平的测定：
在脊髓损伤后7天、14天和28天(每个时间点每组6只动物)，测定血清 细胞因子水平，以评估各种干细胞(huMSCs和hiPSC-NSC)移植对炎症的影响。 取血，4℃过夜，离心机5000rpm离心，取血液上清做ELISA去测定细胞因子。 根据厂家说明书，使用小鼠ELISA试剂盒(Abconal，武汉，中国)对VEGF，IL-6 和TNF-α进行了ELISA检测。用SPARK(Tecan TradingAG，Switzerland)检测450 nm处的OD值(570nm处的参考值)，并根据标准曲线计算出绝对浓度。
定量分析
从损伤中心的纵切面图像中手动绘制损伤区域的轮廓，并使用图像J(版本1.50i，美国国家卫生研究所)计算损伤区域。对于炎症细胞计数，我们使用了5 张在震中附近拍摄的400×400像素HE染色标本的正方形数码照片，并使用图 像J(版本1.50i，美国国家卫生研究所)手动计数炎症细胞。在用Masson三色 染色的每个切片中选择4个高功率(×200)场，使用Image Pro Plus 6.0软件(Media Controlnetics，Silver Spring，MD，USA)计算脊髓纤维化区域与整个区域的比率。 GFAP的免疫荧光染色强度通过使用Image-ProPlus 6.0软件测量积分光密度(IOD) 进行量化，如先前的报告所述。简单地说，用150μm网格测量损伤中心附近 的GFAP染色密集区域(不包括病变区域)来量化胶质瘢痕区域。从而获得GFAP的 平均染色强度。
统计分析
所有定量数据均报告为平均值±平均值标准误差(SEM)，并使用SPSS 22.0(StatSoft，Tulsa，OK，USA)或GraphPad PRISM 7.0(GraphPad Software，San Diego， USA)统计软件进行分析。三组间差异的统计显著性采用单因素方差分析进行评 估，而Tukey的多重比较检验则作为事后分析来评估任何两组间的差异。统计学 意义：P<0.05。
结果
来源于hiPSC的hiPSC-NSCs表达Nestin、SOX2和PAX6标记。用流式细胞仪 和诱导分化技术对huMSCs进行鉴定。如图1B所示，huMSCs对特定MSC表面 标记物(包括CD29、CD44、CD73、CD90和CD105)呈阳性，而对CD45和HLA-DR 呈阴性(图1B)。分别通过油红O，茜素红S和阿尔辛蓝染色的结果确定，huMSCs 具有成脂，成骨和软骨形成的能力(图1C-E)。
病理形态学改变：
对照组损伤脊髓形成空洞，损伤脊髓表面塌陷。相反，NSC组损伤脊髓表面 丰满、光滑，无明显塌陷(图2)。术后28天，对照组脊髓损伤部位有大量炎 性细胞浸润。与对照组相比，MSC组的炎性细胞浸润减少[(282.9±20.99)vs. (377.2±25.23)，p<0.05]，坏死组织面积减少[(1.20±0.08)mm2 vs.(1.55± 0.05)mm2，p<0.01]。NSC组脊髓损伤面积小于对照组[(0.96±0.09)mm2 vs. (1.55±0.05)mm2，p<0.05](图3)。评估SCI部位的纤维化百分比，以评估 恢复情况和瘢痕形成情况。在所有时间点，NSC组的纤维化面积最小，尽管dpo7 和dpo14的差异不显著。与对照组相比，NSC组的平均纤维化百分比明显降低 [(23.33±2.03)％vs.(64.48±3.10)％，p<0.001]。与对照组相比，MSC组的 纤维化百分比显着降低[(32.51±3.51)％vs.(64.48±3.10)％，p<0.001)]。
干细胞移植后的星形胶质细胞增生
进行抗GFAP免疫染色以评估挫伤后dpo7、14和28处星形胶质细胞的分布 和胶质瘢痕的形成(图4a-C)。对照组星形胶质细胞排列紧密，形成瘢痕屏障。 然而，在神经干细胞组，星形胶质细胞似乎是自由的，并没有形成突出的胶质界 限膜完全阻断轴突再生。(图4B)。与预期一样，NSC组的病变显示GFAP阳性 胶质瘢痕明显减少。相反，在MSC组中观察到一个巨大的胶质瘢痕，与对照组 没有显著差异(图4)。定量分析显示，与对照组和MSC组相比，NSC组在手术 后7天和dpo14天时GFAP的IOD显著降低。此外，对照组和MSC组中GFAP的IOD随时间呈下降趋势[对照组：术后7天(8.59×106)Vs.术后28天(3.42×106)， p<0.001；MSC组：术后7天(8.84×106)Vs.术后28天(3.87×106)，p<0.001]， 尽管NSC组的IOD随时间推移略有增加，但这些差异并不显着[术后7天(3.69 ×105)，术后14天(9.98×105)，dpo28(1.89×106)]。与MSC治疗组相比， hiPSC-NSC治疗组在所有时间点GFAP的IOD均显著降低。此外，MSC移植小鼠 在接受PBS的小鼠中表现出与GFAP相似的IOD(图5a)。
移植细胞的命运和定向分化
存活的干细胞用HuNu染色(图6)。使用细胞标志物抗体鉴定三个干细胞 移植组的受损脊髓中移植的干细胞的分化，将对照组用作阴性对照组。在神经干 细胞组的脊髓切片中观察到具有HuNu阳性细胞核(红色)的细胞，它们用GFAP 或TUJ1双重染色(图6)。因此，移植的细胞已经分化成星形胶质细胞和神经 元。还观察到一些具有SOX2阳性细胞核的细胞，这表明某些NSC仍然存活(SOX2 阳性细胞)。MSC组可见HuNu阳性细胞核(红色)，用抗GFAP抗体(绿色) 双染，而不用抗TUJ1或抗SOX2抗体双染。在我们的实验中，受损脊髓中存活的huMSCs分化为星形胶质细胞，而不是神经元细胞。对照组未见移植干细胞。
脊髓损伤小鼠血清细胞因子水平
术后7天时，MSC组的IL-6水平为(45.50±6.26)pg/ml，明显高于其他各 组[NSC组：(23.63±1.80)pg/ml，对照组：(25.57)±3.33)pg/ml]。术后 14天时，三组间无差异。在术后21天时，与术后14天检测到的NSC组IL-6水 平相比，IL-6水平显著降低[(13.56±2.77)pg/ml]，并且在同一时间点与其他组 的水平相比，观察到更低的水平(图5B)。NSC组VEGF水平随损伤愈合逐渐下 降。在术后28天时，NSC组的VEGF水平明显低于其他两组。在MSC组，术后 28天的VEGF水平明显高于术后7天的VEGF水平。在PBS处理的动物中检测到 的VEGF水平在所有时间点保持不变(图5c)。三组在不同时间点的TNF-α水平 无显著差异(图5d)。
运动功能的行为分析
huMSCs组，hiPSC-NSC组以及对照组的PBS在脊髓挫伤后立即通过原位移植 细胞到受伤区域。挫伤诱发的脊髓损伤后，用BMS运动评分量表在开放场地中 评估运动功能。在术后1天，各组的后肢几乎完全瘫痪(图7G-I)，三组的BMS 评分相似(图7A)。在整个观察期间，NSC组的运动功能逐渐改善，而MSC组 和对照组的功能在术后14天之前恢复，然后下降。术后3天时，NSC组评分明 显高于其他两组[(3.11±0.21)vs.(2.49±0.17)和(2.19±0.14)]。同样，在 术后7天和14天时，NSC组的BMS评分也较高。有趣的是，在脊髓损伤后较短时间内，NSC组的移植动物相比其他组而言，在BMS测试中总是表现出更好的 最高分数。在术后28天时，对照组和MSC组小鼠的下肢和臀部肌肉明显萎缩， 而NSC组的肌肉形状基本正常(图7G'-I'。NSC组移植动物得分最高(4.71±0.22)， 明显高于MSC组和对照组(分别为(3.18±0.40)和(2.59±0.25)。统计足底 步进、协调、爪位、躯干和尾巴的得分。在手术后第一天，各组动物的分项评分 均降至零。术后28天，NSC组的平均分项得分为1.07，显著高于其他组(MSC 组：0.35，对照组：0.06)(图7b)。关于协调的变化，到术后28天，71％的 NSC治疗小鼠表现出一些或实质性的协调恢复，而对照组为38％(图7C)。重 要的是，29％的NSC治疗小鼠能够转为轻微的躯干功能障碍，而对照组为0％， MSC组为11％(图7d)。尽管NSC组的左右侧步态评分高于MSC组和对照组， 但在这些组之间未观察到统计学上的显著差异(图7E-F)。因此，hiPSC-NSC治 疗对SCI小鼠系统功能(如协调功能和躯干功能)的恢复非常有利。
Claims (7)
1.人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质干细胞(MSC)作为治疗动物急性脊髓损伤产品的应用；
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：通过将人诱导多能干细胞体外分化为NSC、人脐带分离培养为MSC，并辅以辅料得到治疗动物急性脊髓损伤产品，并将获得的产品原位移植到急性脊髓损伤的脊髓；
所述人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质干细胞(MSC)比例按照1:1的比例使用的，溶媒物用的是PBS。
3.一种治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：包括比例为1:1的人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质干细胞(MSC)的细胞混合产品。
4.如权利要求3所述的一种治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：所述人诱导多能干细胞体外分化为NSC通过人外周血单个核细胞重编程为诱导多能干细胞，干细胞在神经诱导剂作用下，体外分化为神经干细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中；
在分化为神经干细胞的过程中，用37℃预热的神经诱导培养基隔天换液，共培养七天，第八天可将细胞消化传代，得到P0 NSC。
5.如权利要求3所述的治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：所述人脐带分离培养为MSC，包括以下步骤：
S1：使用组织块法贴壁分离脐带间充质干细胞，并使用无血清培养基培养，使用差速贴壁法纯化细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中；
S2：在培养皿上进行随机直线划痕，以便固定华通胶，并在超净台中干燥5～10min，加入3～5ml无血清培养基，每1～3天续加2～3ml培养基，观察细胞迁移及生长状况；
S3：传代培养：在传代细胞融合度至85～95％时，继续传代培养，传代过程中将细胞悬液放入培养皿，放入培养箱中静置5～10min，将悬液中的细胞重新放入新的培养皿中，将已经贴壁的细胞弃去；
S4：冻存：将部分细胞离心后以3-4×105/mL放入1ml冻存液中，放入程序性冻存盒中，置于-80℃冰箱内；
S5：建立脐带间充质干细胞的数据库，并使该数据库与冻存细胞进行关联。
6.如权利要求5所述的治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：所述S3中培养的条件为：置于37℃，5％CO2培养箱中；
7.如权利要求5所述的治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：所述S4中的冻存液成分包括：70％无血清培养基，20％胎牛血清(Thermo Fisher)，10％二甲基亚砜(Sigma)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110819246.1A CN113712995A (zh) | 2021-07-20 | 2021-07-20 | 神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110819246.1A CN113712995A (zh) | 2021-07-20 | 2021-07-20 | 神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113712995A true CN113712995A (zh) | 2021-11-30 |
Family
ID=78673556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110819246.1A Pending CN113712995A (zh) | 2021-07-20 | 2021-07-20 | 神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113712995A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114404449A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-29 | 中赛干细胞基因工程有限公司 | 脐带间充质干细胞作为制备修复急性脊髓损伤药物的应用 |
| CN115054568A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-09-16 | 赣南医学院第一附属医院 | 促进脊髓损伤恢复的温敏型水凝胶及制备方法 |
| CN115747150A (zh) * | 2022-11-21 | 2023-03-07 | 河南省精神病医院(新乡医学院第二附属医院) | 脐带间充质干细胞、脐带间充质干细胞制剂及其应用 |
| WO2024077893A1 (zh) * | 2022-10-14 | 2024-04-18 | 昆明理工大学 | 联合干细胞和水凝胶生物材料的制备及其在脊髓损伤中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080049917A (ko) * | 2006-12-01 | 2008-06-05 | 메디포스트(주) | 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물 |
| CN105331583A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-02-17 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法 |
| CN112522791A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-03-19 | 河北医科大学 | 一种人脐带间充质干细胞库的构建方法 |
| CN113025654A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-06-25 | 河北医科大学 | 一种人诱导多能干细胞库的构建方法 |
-
2021
- 2021-07-20 CN CN202110819246.1A patent/CN113712995A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080049917A (ko) * | 2006-12-01 | 2008-06-05 | 메디포스트(주) | 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물 |
| CN105331583A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-02-17 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法 |
| CN112522791A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-03-19 | 河北医科大学 | 一种人脐带间充质干细胞库的构建方法 |
| CN113025654A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-06-25 | 河北医科大学 | 一种人诱导多能干细胞库的构建方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 唐超等: "诱导多能干细胞及其移植治疗脊髓损伤的研究进展", 《中国脊柱脊髓杂志》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114404449A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-29 | 中赛干细胞基因工程有限公司 | 脐带间充质干细胞作为制备修复急性脊髓损伤药物的应用 |
| CN115054568A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-09-16 | 赣南医学院第一附属医院 | 促进脊髓损伤恢复的温敏型水凝胶及制备方法 |
| WO2024077893A1 (zh) * | 2022-10-14 | 2024-04-18 | 昆明理工大学 | 联合干细胞和水凝胶生物材料的制备及其在脊髓损伤中的应用 |
| CN115747150A (zh) * | 2022-11-21 | 2023-03-07 | 河南省精神病医院(新乡医学院第二附属医院) | 脐带间充质干细胞、脐带间充质干细胞制剂及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Azari et al. | Effects of transplanted mesenchymal stem cells isolated from Wharton’s jelly of caprine umbilical cord on cutaneous wound healing; histopathological evaluation | |
| CN113712995A (zh) | 神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用 | |
| Liu et al. | Acellular spinal cord scaffold seeded with mesenchymal stem cells promotes long-distance axon regeneration and functional recovery in spinal cord injured rats | |
| Dominici et al. | Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement | |
| Zhou et al. | Comparison of mesenchymal stromal cells from human bone marrow and adipose tissue for the treatment of spinal cord injury | |
| Zuk et al. | Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells | |
| Zhang et al. | Differentiation and neurological benefit of the mesenchymal stem cells transplanted into the rat brain following intracerebral hemorrhage | |
| JP2020097634A (ja) | 神経変性を治療するための方法及び組成物 | |
| Rinaldi et al. | Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks | |
| Young et al. | Alzheimer’s disease treated with autologous and allogeneic telomerase-positive stem cells | |
| CN107254443B (zh) | 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法 | |
| KR101697141B1 (ko) | 연골 재생용 세포 치료제 | |
| CN109893541B (zh) | 经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用 | |
| Sheth et al. | Transplantation of human bone marrow–derived stromal cells into the contused spinal cord of nude rats | |
| KR100825864B1 (ko) | 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용세포치료제 | |
| KR20140038236A (ko) | 간엽줄기세포 응집체의 제조 방법 | |
| Kabatas et al. | Neuronal regeneration in injured rat spinal cord after human dental pulp derived neural crest stem cell transplantation | |
| KR102091442B1 (ko) | 건 또는 인대 손상 치유를 위한 자가 및 동종의 지방유래 중간엽줄기세포 조성물 및 이의 제조방법 | |
| CN105018429B (zh) | 脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞及其制备方法和应用 | |
| JP5388297B2 (ja) | アディポクラスター | |
| AU2018289935A1 (en) | Treatment agent for epidermolysis bullosa | |
| KR20130063483A (ko) | 개과동물 양막-유래 다분화능 줄기세포 | |
| US20150232807A1 (en) | Method for isolation and purification of epithelial stem cells from skin | |
| Lee et al. | Intracerebral transplantation of human adipose tissue stromal cells after middle cerebral artery occlusion in rats | |
| WO2022218443A1 (zh) | 间充质干细胞来源的外泌体治疗脑卒中的方法和组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211130 |