CN105018429B - 脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供制备脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞的方法，所述方法利用运动神经元样细胞诱导剂处理3‑6代的高纯度脂肪干细胞从而得到运动神经元样细胞。本发明方法还可包括在用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞之后用神经营养因子继续处理，从而得到更加成熟的运动神经元样细胞。本发明方法能在极短时间内获得更加成熟的脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞，得到的运动神经元样细胞可以用于预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤；而经本发明方法获得的预诱导的运动神经元样细胞可以更好地用于预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤。

Description

脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及干细胞及生物医药领域。具体地说，本发明涉及人源脂肪干细胞(Human-Adipose Derived Stem Cell，hADSC)来源的运动神经元样细胞(motoneuron-likecell，MNLC)及其制备方法和在预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤中的应用。

背景技术

脊髓损伤(SCI)是伴有外伤水平相关的突然性功能丧失的一种破坏性状况，从而导致瘫痪以及相关的并发症。最初的外伤后，会发生一系列次生事件级联反应，包括局部缺血、细胞死亡、出血、炎症、水肿和进一步的组织损伤，从而在损伤部位导致脱髓鞘、轴突变性和空穴现象。传统的治疗包括外科手术以使损伤减压并稳定，预防次生并发症以及促进机能恢复。现也实施了各种新型治疗方法，例如给予针对髓磷脂相关神经突生长抑制剂的抗体和神经营养因子。然而，所有这些策略对脊髓损伤仅有有限的疗效。相反，干细胞治疗因它们自我更新、分化成多种谱系、分泌神经营养因子和抗炎性细胞因子的能力而对于脊髓损伤修复有很大希望。为作SCI治疗，已在实验上和临床上检验了几种基于干细胞的策略，包括ES细胞，间充质干细胞(MSC)，例如BM衍生的基质细胞(BMSC)和脂肪衍生的干细胞(ADSC)，神经干细胞(NSC)和诱导的多潜能干细胞(iPSC)。虽然ESC在体外几乎可无限增殖并且能分化成任何谱系，但它们因致瘤可能性和难以获得不具核型异常的高纯度的任何单一谱系以及伦理担忧而在临床应用上极具争议。开发iPSC技术可极大克服利用ESC而产生的伦理问题，然而，阻碍ESC应用的问题对于iPSC仍存在。在技术上，iPSC诱导的传统方案需要病毒感染和易于致瘤的潜在基因组转基因整合。该缺陷可通过新的诱导技术，例如腺病毒、幼猪Bac转座子、直接蛋白转导和纯粹的化学诱导来克服，然而，这些iPSC的临床应用的安全性与有效性尚未被证明。

与ESC/iPSC不同，基于MSC的干细胞疗法较少产生安全性和伦理问题的顾虑，因此在研究人员之中越来越多普及。MSC是可从许多组织，例如骨髓、脐带血、骨骼肌和脂肪组织分离的一组异质多能细胞。MSC有自我更新以及分化成入中胚层、外胚层和内胚层来源的各种细胞的能力，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经元等。MSC的主要优点包括它们可自体移植，它们可以分泌一些神经营养因子和细胞因子来提高贫弱的细胞存活并抑制炎症以便修复。用于SCI细胞替代疗法的最常见细胞是BMSC，但它们的效果有争议，一些显示改善运动，而其它无此作用，可能是因为缺乏在体内和体外一致的将MSC转化成神经细胞的方法。虽然MSC有治疗益处，但这些细胞也存在不应忽略的不利作用，特别是促进肿瘤形成、生长和转移的潜能。还有报道说长期体外扩增或遗传操作导致MSC经历恶性转化。因此，MSC的临床应用还需仔细思量。

在各种MSC中，发现ADSC与BMSC及其类似，免疫原性低，还具有免疫抑制性，但易于收获和体外扩增，因此它们的治疗潜能收到越来越多的关注。可对ADSC作预先程序化处理以使之向神经谱系分化，可在神经元分化前作有丝分裂刺激，通过关键NES增强子元件的脱甲基化增强该预先程序化处理。因此，许多研究证实ADSC具有较强的分化能力。ADSC还能形成其它神经细胞，例如少突胶质细胞和功能性Schwann细胞。由于这些优点，ADSC更被视为SCI治疗的理想干细胞来源。由于运动神经元丧失是SCI患者中永久性残疾的主要原因之一，预计运动神经元替代可带来一定的功能恢复。当将衍生自小鼠或人ESC的运动神经元移植入SCI动物模型，它们存活并整合入受损的组织，还观察到显著的运动功能改善。最近，两个研究组独立报道改进了将ESC/iPSC转化成运动神经元的方案，利用该改进方案他们能将hADSC诱导成运动神经元样细胞，但获得的运动神经元样细胞的成熟度低、存活时间短。然而，本领域技术人员知晓分化诱导得到的细胞离真正用于临床治疗还有相当长的距离，很多分化诱导得到的细胞，即使是高度成熟的分化细胞也可能因为种种原因而最终未能应用于临床治疗。因此，分化诱导得到的运动神经元样细胞在相关SCI模型中疗效还有待解决。

因此，本领域急需开发能够将hADSC有效转分化成运动神经元样细胞，并且对SCI具有真正治疗潜能的方法并提供相应的细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将脂肪干细胞分化成运动神经元样细胞的方法。

本发明的另一目的在于提供一种成熟度高的脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞群。

本发明还有另一目的在于提供一种具备优异治疗潜能的脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞群。

在第一方面，本发明提供一种将脂肪干细胞分化成运动神经元样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

利用运动神经元样细胞诱导剂处理3-6代脂肪干细胞6-84小时，从而获得运动神经元样细胞群。

在优选的实施方式中，利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞6-72小时。

在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是3-5代，更优选3代。

在另一优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是高纯度脂肪干细胞，其中75%以上，优选85%以上的脂肪干细胞是CD29、CD44、CD105阳性细胞；而10%以下，优选3.5%以下的脂肪干细胞是CD45和CD133阳性细胞。

在另一优选的实施方式中，利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞18-30小时，更优选24小时。

在另一优选的实施方式中，在利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞后，利用神经营养因子继续处理60-84小时，优选66-78小时。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞诱导剂是Sonic Hedgehog途径激活剂和视黄酸，更优选地，所述运动神经元样细胞诱导剂是Purmorphamine或SHH或Hh-Ag1.5和视黄酸，更优选地，所述运动神经元样细胞诱导剂是SHH和视黄酸。

在优选的实施方式中，所述神经营养因子是选自下组：BDNF、NGF、NT3、CNTF、GDNF或IGF。

在进一步优选的实施方式中，所述神经营养因子是BDNF、GDNF或IGF。

在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是人源脂肪干细胞，优选纯度较高的人源脂肪干细胞。

在优选的实施方式中，所述方法得到的运动神经元样细胞群具有选自下组的任一或多种特征：

(1)有50%以下，优选40%以下，最优选30%以下的细胞表达运动神经元祖细胞标志物；

(2)有70%以上，优选80%以上，最优选85%以上的细胞表达运动神经元标志物；

(3)有70%以上，优选80%以上，最优选90%以上的细胞表达神经元标志物；

(4)有30%以上，优选40%以上，最优选45%以上的细胞可观察到复杂的突触结构；

(5)有30%以上，优选40%以上，最优选50%以上的细胞表达突触蛋白；和

(6)有60%以上，优选70%以上，最优选80%以上的细胞表达离子通道蛋白，从而具备电生理特性。

在优选的实施方式中，所述方法得到的运动神经元样细胞的分化效率是80-90%，优选85～95%，体外存活时间是30-35天。

在优选的实施方式中，所述方法得到的运动神经元样细胞在移植后8周，没有检测到肿瘤形成。

在第二方面，本发明提供一种脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞群，所述细胞群具有以下一种或多种特征：

(1)有50%以下，优选40%以下，最优选30%以下的细胞表达运动神经元祖细胞标志物；

(2)有70%以上，优选80%以上，最优选85%以上的细胞表达运动神经元标志物；

(3)有70%以上，优选80%以上，最优选90%以上的细胞表达神经元标志物；

(4)有30%以上，优选40%以上，最优选45%以上的细胞可观察到复杂的突触结构；

(5)有30%以上，优选40%以上，最优选50%以上的细胞表达突触蛋白；和

(6)有60%以上，优选70%以上，最优选80%以上的细胞表达离子通道蛋白，从而具备电生理特性。

在优选的实施方式中，有70%以上，优选80%以上，最优选85%以上的细胞还表达神经元间标志物，例如GAP43和神经胶质标志物，例如GFAP。

在优选的实施方式中，所述运动神经元祖细胞标志物选自：Oligo2、PAX6。

在优选的实施方式中，所述运动神经元标志物选自：HB9、Sim-1、Oligo2、ChAT、Nkx6.1。

在优选的实施方式中，所述神经细胞标志物选自：Synapsin1/2、MAP2、Tuj1、NFL、NFM、GAP43、GFAP、NF-200。

在优选的实施方式中，所述突触蛋白选自：SNAP25、Synapsin1/2。

在优选的实施方式中，所述离子通道蛋白选自：电压依赖性钠通道、钙通道、钾通道。

在优选的实施方式中，有70%以上，优选75%以上，最优选80%以上的细胞不表达运动神经元祖细胞标志物，例如Oligo2和PAX6。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群的分化效率是80-90%，优选85-95%，体外存活时间是30-35天。

在第三方面，本发明提供一种脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞群，所述细胞群具有以下一种或多种特征：

(1)有50%-70%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物Oligo2；

(2)有30%-50%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物PAX6；

(3)有60%-80%的细胞表达运动神经元标志物HB9；

(4)有70%-90%的细胞表达神经元标志物MAP2；

(5)有20%-40%的细胞表达神经元标志物Synapsin1/2；

(6)有20%-40%的细胞不表达HB9；

(7)有60%-80%的细胞不表达Synapsin1/2；

(8)有10%-30%的细胞不表达MAP2。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群中的细胞不表达ChAT、观察不到复杂的突触结构、不表达离子通道蛋白。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群中的细胞有继续分化成本发明第二方面所述细胞群的潜能。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群采用本发明的上述方法制备，其中，利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞18-30小时，更优选24小时。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群用于制备本发明第二方面所述的运动神经元样细胞群。

在另一优选的实施方式中，所述细胞群采用本发明第一方面所述的方法制备。

在优选的实施方式中，所述细胞群采用本发明的上述方法制备，其中，在利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞后，利用神经营养因子继续处理60-84小时，优选66-78小时。

在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是人源脂肪干细胞。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群在移植后8周，没有检测到肿瘤形成。

在第四方面，本发明提供本发明第二和第三方面所述运动神经元样细胞群的用途，所述运动神经元样细胞群用于制备预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤的药物。

在优选的实施方式中，所述运动神经元损伤包括：肌萎缩侧索硬化症(ALS,Amyotrophic lateral sclerosis)、路格瑞氏症(Lou Gehrig's disease)、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症(SMA,Spinal Muscular Atrophy)。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群是本发明第三方面所述的运动神经元样细胞群。

在第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：

(1)有效量的本发明第二或第三方面所述的运动神经元样细胞群；和

(2)药学上可接受的载体。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群是本发明第三方面所述的运动神经元样细胞群。

在第六方面，本发明提供一种治疗预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤的方法，所述方法包括给需要的对象施用本发明第二或第三方面所述的运动神经元样细胞群、或本发明第五方面所述的药物组合物。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群是本发明第三方面所述的运动神经元样细胞群。

在优选的实施方式中，所述运动神经元损伤包括：肌萎缩侧索硬化症、路格瑞氏症、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了hADSC的分离和表征。(A)纯化的hADSC具有典型的纺锤体样形态和涡旋式生长。(B和C)各种CD标志物阳性hADSC的免疫染色和定量测定。(D)干细胞标志物Sox2、Oct4、c-Myc和Nanog的免疫细胞化学染色。(E)干细胞标志物阳性细胞的定量测定。(F)hADSC诱导成脂肪细胞，油红(Oil Red)O染色，核仁相比于苏木精曙红染色；诱导成成骨细胞，茜素红染色；诱导成软骨细胞，甲苯胺蓝染色；以及诱导成神经元样细胞，Tuj1抗体染色，用在普通培养基中平行培养的未处理hADSC自我对照；(G)定量测定各种最终分化细胞的存在情况。所有的定量测定结果来自至少3个独立的实验。通过Student t-检验进行统计学分析，p<0.001(***)。

图2显示了主要通过SHH和RA诱导hADSC分化成神经元样细胞。(A)诱导方案的示意图。(B)用运动神经元标志物(HB9)、运动神经元祖细胞-标志物(Oligo2和PAX6)以及神经元标志物(MAP2和Synapsin1/2)免疫染色未处理的hADSC。(C)用SHH和RA诱导3天后，hADSC表达高水平的MAP2和Synapsin1/2(集中在核中)并开始表达运动神经元相关标志物，HB9和Oligo2及Pax6。(D)补加神经营养因子(NF)，BDNF、GDNF和IGF再诱导3天后，这些hADSC仍表达高水平的HB9、Pax6、MAP2、Synapsin1/2；Oligo2表达降低，Synapsin1/2呈斑点样结构表达。(E)各种标志物阳性细胞与核(n=5)之比的统计学分析，通过Student t-检验进行统计学试验，p<0.001(***)。基准尺50μm。

图3显示了hADSC-MN变得电生理活性并表达各种电压门控离子通道。(A)电压钳记录hADSC-MN的内向钠电流，用SHH、RA以及各种神经营养因子诱导6天后，用1uM TTX阻断。(B)qRT-PCR显示hADSC-MN表达的神经细胞标志物，TUJ1、MAP2、NFL、NFM、GAP43、SNAP25、GFAP和钙-依赖性K⁺通道标志物，MaxiK增加；电压依赖性K⁺通道标志物，Kv4.2；河豚毒素敏感性Na⁺通道标志物，NE-Na；电压-依赖性L-型Ca²⁺通道，α1C和1G亚单位标志物，CACNA1C和CACNA1G；GAPDH用作持家基因，内参照。(C和D)RT-PCR和q-RT-PCR实验显示诱导6天后，hADSC-MN表达各种运动神经元特异性标志物，例如Sim-1、Oligo2、HB9、ChAT、NKX6.1和轴突标志物，NF-200。

图4显示了将hADSC-MN移植入小鼠SCI模型证明有显著疗效。(A)在野生型C57/BL6小鼠的T8区段制作压缩SCI模型。PBS对照组中可见受伤部位的空腔和脊髓较低部分的变性，但在hADSC-MN移植组中空腔和变性情况降低。(B)实验流程的示意图。(C)对照组和移植组的存活曲线。(D)通过BMS评分评估后肢运动功能，包括基础评分和子评分(各组中n＝7)。

图5通过IHC分析显示，在受伤部分存活下的移植的hADSC-MN主要变为神经元，这些hADSC-MN能移动并整合入脊髓。(A和B)用星形细胞标志物GFAP分别对PBS对照组和hADSC-MN移植组作脊髓切片IHC染色(移植后8周)。选择受伤部位(中心)和震中(头端和尾端)的代表性图像。源自虚线三角形的放大图像以字母或数字标出。(C、D和E)分别显示了各部位的GFAP阳性星形细胞占总细胞之比、GFP阳性移植细胞占总细胞之比以及衍生自GFP阳性移植细胞的GFAP和GFP双阳性星形细胞占总细胞之比的统计学分析。(F和G)分别显示了PBS对照组和hADSC-MN组中神经元标志物MAP2的IHC染色。(H、I和J)显示了MAP2阳性神经元占总细胞之比、MAP2和GFP双阳性神经元占总细胞之比的统计学分析以及受伤部分的面积。对于各切片，每个样品计数至少5个视野来进行定量测定。利用GraphPad Prism进行Student T-检验。***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05，ns表示P>0.05。用Image-Pro Plus软件计算受伤面积。非放大图中的基准尺表示400μm。

图6显示移植的hADSC-MN在小鼠SCI模型中具有抑制炎症的作用。(A)在受伤部位，GFAP高表达揭示PBS对照组中主要是神经胶质活化。(B)在hADSC-MN移植组中，GFAP表达收到GFP-阳性细胞的极大抑制，从而证明移植细胞的免疫抑制作用。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用运动神经元样细胞诱导剂处理3-6代的高纯度脂肪干细胞并结合神经营养因子后处理，能在短时间内将所述脂肪干细胞分化成运动神经元样细胞，所述运动神经元样细胞的分化效率高，存活时间长，成熟度高，并且能具备电生理活性。本发明人还出乎意料地发现，采用本发明方法处理24小时左右获得的不成熟的运动神经元样细胞也能够很好地用于治疗脊髓损伤。在此基础上完成了本发明。

脊髓损伤与运动神经元损伤

脊髓损伤(SCI)是伴有外伤水平相关的突然性功能丧失的一种破坏性状况，其能导致瘫痪以及相关的并发症，对于个体和社会都是主要的经济和社会负担。最初的外伤后，会发生一系列次生事件级联反应，包括局部缺血、细胞死亡、出血、炎症、水肿和进一步的组织损伤，从而在损伤部位导致脱髓鞘、轴突变性和空穴现象。尽管对SCI患者的医学和外科手术照料有了很大进步，但迄今为止没有可行的治疗方法，特别是对于严重和不顺从形式的SCI。

运动神经元(MN)即外导神经元，是负责将脊髓和大脑发出的信息传到肌肉和内分泌腺，支配效应器官的活动的神经元。而运动神经元损伤是属于神经内科的一类疾病，主要侵犯上、下两极运动神经元。它是一种慢性疾病，其类型较多，包括但不限于：肌萎缩侧索硬化症、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化等等。

脂肪干细胞

基于干细胞的疗法有可能应对SCI中遇到的几乎所有问题，例如神经元、schwann细胞丧失，轴突变性和脱髓鞘，血管结构破坏和炎症，其是SCI疗法的可行选择之一。迄今为止，检验了各种类型的干细胞，不同的运动功能恢复情况已见诸报道。然而，临床应用ESC和iPSC在很大程度上受限于伦理担忧、致瘤可能性或缺乏有效的策略将它们分化为高纯度的特定谱系。自从四十多年前鉴定到BMSC以来，BMSC因其多分化潜能和收集期间的低发病率而已成为干细胞治疗的选择之一。但收集BMSC实际上是一侵入性和繁重的过程，有潜在危险性且获得的细胞数量非常有限。相比之下，脂肪干细胞(adipose-derived stemcells，ADSC)易于从脂肪组织中大量获得，而且几乎是非侵入性的。重要的是，ADSC预计在自我更新、多潜能性、免疫豁免以及安全性上也有优势。因此，ADSC越来越被视作用于各种治疗应用的干细胞选择。

脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。它是源自脂肪组织的一种间充质干细胞，可以分化为间质类细胞，如骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等。ADSC细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。近年来，多潜能人源脂肪干细胞(hADSC)已成为治疗人类一些严重疾病，如脊髓损伤、脑卒中等的很好的细胞来源。

将hADSC预先分化成运动神经元样细胞来替换SCI的受伤运动神经元是有吸引力的。然而，对于hADSC的体外运动神经元分化知之甚少[1，2]。而hADSC衍生的运动神经元在脊髓损伤动物模型中是否真正有治疗作用没有数据可用。在本领域中，一般认为将hADSC在体外预处理成成熟度高的运动神经元样细胞再进行移植是比直接利用hADSC治疗脊髓损伤更理想的选择。

鉴于本发明的内容以及本领域的现有技术，本领域普通技术人员会理解，本文所述的脂肪干细胞可以是任何动物来源的脂肪干细胞，优选哺乳动物来源的脂肪干细胞，更优选人源脂肪干细胞，最优选纯度较高的人源脂肪干细胞。

本发明提供一种高纯度的hADSC，所述hADSC表达典型的间充质干细胞标志物CD29、CD44和CD105，而不表达造血干细胞标志物CD45和CD133。这些hADSC表达大多数报道的胚胎干细胞标志物，例如Sox2、Oct4、c-Myc和Nanog，但表达水平低于ESC的，从而可能决定hADSC的自我更新能力和多潜能性以及低致瘤可能性。

在具体的实施方式中，本发明的高纯度人源脂肪干细胞中75%以上，优选85%以上的脂肪干细胞是CD29、CD44、CD105阳性细胞；而10%以下，优选3.5%以下的脂肪干细胞是CD45和CD133阳性细胞。

运动神经元样细胞诱导剂

本文所用的“运动神经元样细胞诱导剂”表示能够诱导包括胚胎干细胞、可诱导多能干细胞以及脂肪干细胞在内的各种干细胞分化形成运动神经元样细胞的物质。在具体的实施方式中，所述运动神经元样细胞诱导剂是SonicHedgehog途径激活剂和视黄酸。在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞诱导剂是Purmorphamine或SHH或Hh-Ag1.5和视黄酸。在更优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞诱导剂是SHH和视黄酸。

制备脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞的方法

在获得高纯度人源脂肪干细胞的基础上，本发明人利用SHH和RA将得到的3-6代的高纯度hADSC逐步诱导成运动神经元样细胞。诱导后，进一步补充神经营养因子，例如但不限于BDNF、GDNF和IGF-1能促进hADSC衍生运动神经元样细胞成熟。

基于此，在具体的实施方式中，本发明提供了一种将脂肪干细胞分化成运动神经元样细胞的方法，所述方法利用运动神经元样细胞诱导剂处理3-6代脂肪干细胞6-84小时。在优选的实施方式中，脂肪干细胞处理6-72小时。在另一优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是3-5代，更优选3代。在进一步的实施方式中，在利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞后，利用神经营养因子继续处理60-84小时，优选66-78小时。在具体的实施方式中，所述神经营养因子包括但不限于：BDNF、NGF、NT3、CNTF、GDNF或IGF。在优选的实施方式中，所述神经营养因子是BDNF、GDNF或IGF。

在另一具体实施方式中，本发明利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞18-30小时，更优选24小时，而不用神经营养因子作进一步处理。

本发明的方法得到的运动神经元样细胞具备优异的技术效果，其分化效率是80-90%，优选85～95%，体外存活时间是30～35天。

在优选的实施方式中，本发明方法得到的运动神经元样细胞在移植后8周，没有检测到肿瘤形成。

鉴于本发明方法的技术内容，本领域技术人员会知晓，虽然通过本发明的方法获得的运动神经元样细胞具备各种用途，包括治疗用途，但制备脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞的方法本身并不包括所得运动神经元样细胞的给药或治疗步骤，换言之，本发明的方法本身是一种非治疗方法。

本发明的脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞以及运动神经元样细胞群

根据本发明的方法，利用SHH和RA处理3天后，观察到运动神经元特异性标志物Pax6、Oligo2和HB9以及常规神经元标志物synapsin和MAP2的表达上调，IHC和qRT-PCR证实这点，提示这些细胞在性质上是祖细胞和运动神经元的混合物。用多种神经营养因子再处理3天后，运动神经元祖细胞标志物oligo2的表达水平降低，Synapsin呈斑点样结构表达更多，暗示终末分化的运动神经元部分增多。这些运动神经元样细胞最终变成电生理活性的神经元，但非常高的输入阻抗和去极化静止膜电位显示其在很大程度上仍是不成熟的。

值得指出的是，鉴于人ESC体外分化成功能上成熟的运动神经元需要6周以上的事实，这些分化的细胞可能仍处于神经祖细胞和成熟神经元的中间阶段。通过延长培养时间以及补充神经胶质细胞可使得hADSC进一步成熟。事实上，hADSC衍生的神经元在体内表现得更成熟，神经突更复杂，分枝更多。本发明人可检测到几种神经元分化标志物基因，例如SIM-1、Oligo2、NKX6.1和NF200的表达，虽然较为微弱。综合来看，本发明能将hADSC分化成神经元，或者更特别的运动神经元，从而可用于SCI的治疗。

实际上，用SHH和RA预处理hADSC再移植入小鼠SCI模型后，受损小鼠的运动功能得到逐步而稳健的改善，相比之下，PBS对照组仅有限恢复。更好的长期存活率表明受伤小鼠的生活质量也显著改善。PBS组中有时观察到死亡，这在hADSC-MN移植组中从未发生。实验小鼠的脊髓暴露时，可以立即发现受伤导致的空腔在移植组中显著缩小，而在PBS对照组中依然可见，从而提示脊髓得到有效修复。在PBS对照组中，受损部位尾端的脊髓呈灰色，反映出细胞变性，而在hADSC-MN移植组中，这些细胞受到极大保护。令人吃惊而又确凿无疑的是，这些hADSC-MN在野生型小鼠脊髓中存活而无需施加任何免疫抑制剂，表明ADSC及其分化后代也可能与其它MSC一样是免疫豁免细胞。hADSC能抑制神经胶质细胞活化证明其另一重要特性是这些移植的细胞施加免疫抑制效应。本发明人证实预处理的hADSC能存活并主要分化为神经元，这些神经元能在脊髓中整合并迁移。

本文所用的术语“运动神经元样细胞群”是指运动神经元样细胞形成的群体；即，通过本发明方法将脂肪干细胞诱导分化成运动神经元样细胞而形成的细胞群体。组成所述运动神经元样细胞群的细胞具备运动神经元样细胞的各种特征，表达运动神经元样细胞的各种标志物。鉴于本发明的教导和现有技术的知识，本领域技术人员应该知道，本文所述的运动神经元样细胞群中的各细胞并非完全一致的，在整体上，所述细胞群体中有一定比例的细胞表达某种或某几种标志物，而并非其中的每个细胞都表达某种或某几种标志物。

如上所述，在具体的实施方式中，本发明提供一种脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞群，所述细胞群具有以下一种或多种特征：

(1)有50%以下，优选40%以下，最优选30%以下的细胞表达运动神经元祖细胞标志物；

(2)有70%以上，优选80%以上，最优选85%以上的细胞表达运动神经元标志物；

(3)有70%以上，优选80%以上，最优选90%以上的细胞表达神经细胞标志物；

(4)有30%以上，优选40%以上，最优选45%以上的细胞可观察到复杂的突触结构；

(5)有30%以上，优选40%以上，最优选50%以上的细胞表达突触蛋白；和

(6)有60%以上，优选70%以上，最优选80%以上的细胞表达离子通道蛋白，从而具备电生理特性。

在优选的实施方式中，所述细胞群中有70%以上，优选80%以上，最优选85%以上的细胞还表达神经元间标志物，例如GAP43和神经胶质标志物，例如GFAP。

在具体的实施方式中，所述运动神经元祖细胞标志物选自：Oligo2、PAX6；所述运动神经元标志物选自：HB9、Sim-1、Oligo2、HB9、ChAT、Nkx6.1；所述神经细胞标志物选自：synapsin1/2、MAP2、Tuj1、NFL、NFM、GAP43、GFAP、NF-200；所述突触蛋白选自：SNAP25、Synapsin1/2；所述离子通道蛋白选自：电压依赖性钠通道、钙通道、钾通道。

本发明发现，用神经营养因子能够使得分化的运动神经元样细胞进一步成熟。在具体的实施方式中，在用神经营养因子进一步处理后得到的运动神经元样细胞群中，有70%以上，优选75%以上，最优选80%以上的细胞不表达运动神经元祖细胞标志物，例如Oligo2和PAX6。

本发明人还出乎意料地发现，利用运动神经元样细胞诱导剂处理18-30小时，优选24小时左右获得的运动神经元样细胞的成熟程度不如处理时间更长，甚至用神经营养因子作进一步处理得到的运动神经元样细胞，但将该细胞用于治疗脊髓损伤反而能够取得更好的效果。如此处理获得的运动神经元样细胞群具有以下一种或多种特征：

(1)有50%-70%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物Oligo2；

(2)有30%-50%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物PAX6；

(3)有60%-80%的细胞表达运动神经元标志物HB9；

(4)有70%-90%的细胞表达神经元标志物MAP2；

(5)有20%-40%的细胞表达神经元标志物Synapsin1/2；

(6)有20%-40%的细胞不表达HB9；

(7)有60%-80%的细胞不表达Synapsin1/2；

(8)有10%-30%的细胞不表达MAP2。

在具体的实施方式中，上述方案处理得到的细胞群体中有约60%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物Oligo2；有约40%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物PAX6；有约70%的细胞表达运动神经元细胞标志物HB9；有约80%的细胞表达神经元细胞标志物MAP2。

在优选的实施方式中，上述运动神经元样细胞群中的细胞不表达ChAT、观察不到复杂的突触结构、和/或不表达离子通道蛋白。

本领域技术人员知晓，上述利用运动神经元样细胞诱导剂处理18-30小时，优选24小时左右获得的运动神经元样细胞可视作制备利用运动神经元样细胞诱导剂处理更长时间，甚至用神经营养因子作进一步处理得到的高度成熟运动神经元样细胞的“前体细胞”或“中间体细胞”，因此，上述成熟程度不高的运动神经元样细胞具有继续分化成高度成熟的运动神经元样细胞的潜能，换言之，上述成熟程度不高的运动神经元样细胞可用于制备高度成熟的运动神经元样细胞。

本发明的脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞群的用途

鉴于本发明的教导和本领域现有的知识，本领域普通技术人员会理解，本发明的运动神经元样细胞群可用于制备预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤的药物。

在具体的实施方式中，所述运动神经元损伤包括：肌萎缩侧索硬化症(ALS,Amyotrophic lateral sclerosis)、路格瑞氏症(Lou Gehrig's disease)、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症(SMA,Spinal Muscular Atrophy)。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群是利用运动神经元样细胞诱导剂处理18-30小时，优选24小时左右获得的运动神经元样细胞群。

药物组合物

基于本发明的运动神经元样细胞以及该细胞优异的技术效果和用途，本发明进一步提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

(1)有效量的本发明的运动神经元样细胞群；和

(2)药学上可接受的载体。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群是利用运动神经元样细胞诱导剂处理18-30小时，优选24小时左右获得的运动神经元样细胞群。

所述药物组合物可用于预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤。在具体的实施方式中，所述运动神经元损伤包括：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、路格瑞氏症、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症(SMA)。

预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤的方法

基于本发明的运动神经元样细胞以及该细胞优异的技术效果和用途，本发明还提供了一种治疗预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤的方法，所述方法包括给需要的对象施用本发明的运动神经元样细胞群、或包含其的药物组合物。

在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群是利用运动神经元样细胞诱导剂处理18-30小时，优选24小时左右获得的运动神经元样细胞群。在具体的实施方式中，所述运动神经元损伤包括：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、路格瑞氏症、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症(SMA)。

本发明的主要优点包括：

1.本发明利用运动神经元样细胞诱导剂处理3-6代的高纯度脂肪干细胞并结合神经营养因子后处理，能在短时间内将所述脂肪干细胞分化成运动神经元样细胞；

2.本发明方法得到的运动神经元样细胞的分化效率高，存活时间长，成熟度高，并且能具备电生理活性；

3.采用本发明方法处理24小时左右获得的不成熟的运动神经元样细胞能够很好地用于治疗脊髓损伤；和

4.本发明方法可以利用廉价的运动神经元样细胞诱导剂并且操作简便。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料与方法

hADSC的分离、扩增和表征

原代hADSC从腹部吸脂获得的新鲜人脂肪组织分离。简言之，用无菌磷酸盐缓冲溶液(100U/ml青霉素，100μg链霉素)清洗这些脂肪组织数次，切成小片，然后于37℃下，用I型胶原酶(Sigma Company:0.075%，磷酸盐缓冲液配制)振荡温育30分钟。进行离心(1500rpm/min)，除去上层漂浮的脂肪。剩余的悬浮液经100μm尼龙滤膜(Falcon Company)过滤；然后用DMEM/F12配制的10%FBS(Chemicon)中和滤液，再离心(1500rpm/min)10分钟。弃去上清液，收集沉淀的细胞，在含有10%FBS和青霉素/链霉素(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)的DMED/F12中培养，37℃温育。24小时后，利用PBS冲洗平板以洗去悬浮的细胞。5-7天后，胰蛋白酶(0.05%胰蛋白酶/0.5mM EDTA)处理细胞，再涂布并培育2-5代以供后续使用。为表征分离的hADSC，通过免疫染色分析间充质干细胞特征性的表面抗原，包括CD29(eBioscience,11-0299),CD44(eBioscience,17-0441-81),CD105(eBioscience,12-1057-42)或造血干细胞标志物CD45(eBioscience,11-9459-41),CD133(Biorbyt,orb4216)。还通过免疫细胞化学方法分析了一些典型的胚胎干细胞标志物，包括sox2(Santa cruz,sc-17320)、oct4(Santa cruz,sc-9081)、c-Myc(Santa cruz,sc-764)和Nanog(Santa cruz,sc-30331)，利用hADSC cDNA作为模板以表1所列引物对进行扩增，同时以人胚胎干细胞cDNA作为阳性对照。利用已公开的方法[3，4，5]，通过诱导hADSC分化成脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经元样细胞来检测多谱系分化潜能。

表1干细胞标志物基因引物对信息

多向潜能分化实验

根据已有的报道[3、4]，进行朝向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经元样细胞的多谱系分化实验。简言之，将3-5代的分离hADSC维持在补加了10%FBS的DMEM/F12中直至60%汇合，然后进行诱导。用PBS进行快速洗涤作为诱导起点。对于脂肪细胞诱导，加入包含DMEM/F12、10%FBS、0.5mM异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、1μM地塞米松、10μM胰岛素、200μM吲哚美辛、1%抗生素/抗真菌药的混合培养基。对于成骨细胞诱导，加入包含DMEM/F12、10%FBS、0.1μM地塞米松、50μM抗坏血酸-2-磷酸、10mMβ-甘油磷酸、1%抗生素/抗真菌药的混合培养基。对于软骨细胞诱导，加入包含DMEM/F12、1%FBS、6.25μg/ml胰岛素、10ng/ml TGFβ1、50nM抗坏血酸-2-磷酸、1%抗生素/抗真菌药的混合培养基。对于神经元样细胞诱导，利用DMEM/F12、丁基羟基茴香醚(BHA,200μM终浓度)、KCl(5mM)、丙戊酸(2μM)、毛喉素(10μM)、氢化可的松(1μM)和胰岛素(5μg/ml)组成的神经元诱导培养基。每3天更换以上诱导培养基。诱导期间，用显微镜仔细观察细胞形态。对于脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞诱导，诱导持续14天，而神经元诱导只持续3-5天。采用油红O(Sigma,目录号O0625-25G)染色作为胞内脂质累积的指示剂来评估脂肪生成。利用茜素红S(Sigma,目录号A5533)染色成骨细胞，利用甲苯胺蓝(BIO BASICINC.目录号TB0961-1G)染色软骨细胞。染色方案参见已公开的文件Zuk等[5]。

将hADSC分化成运动神经元样细胞

用PBS洗涤维持在补加了10%FBS的DMEM/F12中的第3代hADSC，将培养基更换为补加了1uM Purmorphamine(CALBIOCHEM,目录号540220)或10ng/mL SHH(R&D,目录号1314-SH-025)和0.1uM所有方式视黄酸(RA,Sigma,目录号R2625)的无血清运动神经元诱导DMEM/F12培养基[6]。3天后，将该诱导培养基更换为新鲜的诱导培养基，同时加入神经营养因子BDNF(PeproTech,目录号AF-450-02)、GDNF(PeproTech,目录号AF-450-10)和IGF-1(PeproTech,目录号AF-100-11)(各10ng/mL)[6]。该处理再持续3天。利用神经细胞标志物MAP2(sysy,目录号188011)、Synapsin1/2(sysy,目录号106002)、运动神经元相关标志物Pax6(Sigma,目录号AV32741)、Oligo2(Millipore,目录号AB9610)、HB9(DSHB，目录号81.5C10)测定hADSC衍生运动神经元样细胞。还进行RT-PCR和qRT-PCR来测定这些运动神经元样细胞。表征的基因以及所用的引物列于表2。

表2神经细胞标志物基因引物对信息

临床相关的小鼠SCI压缩模型

将6-8周龄的C57/BL6小鼠安置在受控SPF级环境(12小时白天/黑夜周期，21℃)，自由饮水和标准饲料。制作SCI模型之前，将这些小鼠预先安置在外科手术室中2小时。首先用2%(0.15mL/10g小鼠体重)的水合氯醛(2,2,2-三氯乙-1,1-二醇,C₂H₃Cl₃O₂)麻醉预处理的小鼠。借助解剖显微镜，将小鼠皮肤切口，然后去除T8处的椎骨(胸段8)并暴露脊髓。利用具有0.4mm垫片的改进尖端镊子从两端横向压缩脊髓10s。然后将小鼠缝合并保暖直至苏醒。通过BMS测试它们的后肢运动功能。将0-3BMS的那些小鼠视作成功的SCI模型，用于随后的实验。

hADSC标记、运动神经元诱导和移植

用表达EGFP的慢病毒FG12感染维持在补加10%FBS的DMEM/F12中的hADSC。48小时后，用SHH和RA对hADSC进行运动神经元诱导，24小时。胰蛋白酶处理来收集这些hADSC-MN，用PBS洗涤一次，然后重悬在PBS中，终浓度为1×10⁹细胞/mL。先制备小鼠SCI模型，7天后进行细胞移植。利用玻璃微量移液管和立体定位注射器(KDS310;Muromachi-Kikai)，在受伤部位和病损外中心的头端和尾端对SCI小鼠(n=7)注射EGFP标记hADSC-MN(3uL/部位)。对照组(n=7)注射等体积的PBS。

电生理记录

为表征hADSC-MN，进行全细胞膜片钳记录来评估它们的电生理活性。方案参考已公开的文献[7、8]。简言之，利用装配有微分干涉相差(DIC)光学元件的Nikon MODELECLIPSE FN1直立式显微镜(Nikon,日本)的63×水浸没镜头目测观察细胞。利用P-97电极拔出器(Sutter Instruments CO.)，从KG-33玻璃毛细管(内径,1.0mm;外径,1.5mm;GarnerGlass,克莱尔蒙特,加利福尼亚州)中拔出电阻为4–7MΩ的膜片电极。排除紧密电阻<5GΩ和保持电流大于-200pA的细胞。将hADSC-MN以电压钳或电流钳构型连接。用于全细胞记录的移液溶液含有(以mM计)123K-葡糖酸盐、10KCl、1MgCl₂、10HEPES、1EGTA、0.1CaCl₂、1K₂ATP、0.2Na₄GTP和4葡萄糖，用KOH将pH调节至7.2。建立全细胞电压记录5分钟后，通过灌注将TTX(1uM)加入记录室以阻断内向钠流。

行为和组织学分析

由不了解治疗组的至少两位检测人员进行功能测试并作分析。这些测试在SCI外科手术后进行，在细胞移植后的头两周较频繁地进行，然后在随后的八周期间每周一次。采用BBB衍生BMS运动评级表评估运动功能，将小鼠单独放置于具有非滑表面的开放实验场，视频记录后肢运动，持续4分钟以评估小鼠的运动功能，包括关节运动、步进能力、协调性、爪方位和趾端间隙。评分为0表明无后肢运动，而总评分为21表明与正常未受伤小鼠中观察到那样，未受损的运动。8周后，处死小鼠。各小鼠作深层麻醉，首先用PBS，然后用4%低聚甲醛(PFA,PH7.4)作心脏内灌注。通过暴露椎骨取出脊髓，后固定，蔗糖脱水，OCT凝胶(SakuraFinetechnical)包埋，置于-80℃以供随后解剖。切片设置为20um，安置已公开的报道[9]进行免疫组织学染色。

实施例1.人ADSC的体外分离、扩增和表征

处理通过抽脂获得的人脂肪组织，接种在T-75烧瓶内含10%FBS的DMEM/F-12基础培养基中。每周更换培养基两次，培养15天后，富集贴壁hADSC，通过亮视野显微图像和苏木精曙红(HE)染色显示其表现出典型的纺锤体样形态涡旋式生长，并具有较大的核仁(图1A)。通过连续传代获得高纯度的hADSC。对于大多数分离的细胞(>85%)，间充质干细胞特异性表位CD29、CD44、CD105对纯化hADSC染色呈阳性，而造血干细胞特异性标志物CD45和CD133为阴性(<3.5%)(图1B和C)，这与以前的报道一致。

通过免疫细胞化学染色[10]，超过80%的hADSC还表达经典的胚胎干细胞标志物，例如Sox2、Oct4、c-Myc和Nanog(图1D)。然而，RT-PCR[11]揭示，它们在hADSC中的表达水平(Sox2,Oct4,Nanog和KLF4)显著低于胚胎干细胞的。为进一步检验这些hADSC是否具有多重分化能力，进行多谱系分化实验，处理hADSC以便分别向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经元高效(>50%)分化，并分别用谱系特异性标志物，油红O、茜素、甲苯胺蓝和Tuj1染色(图1F和G)。因此，分离的hADSC的自我更新和多谱系分化能力证明它们不仅表达典型的间充质干细胞标志物，还能维持它们的干细胞“身份”。

实施例2.hADSC分化成电生理活性运动神经元样细胞

已有报道，SHH和RA对于ESC或iPSC的中性化和腹侧性非常重要，有助于从多能干细胞分化成运动神经元。因此，发明人检验了SHH和RA是否能使得hADSC向运动神经元转分化(图2A)。诱导前，除了有少量的微弱和弥散性MAP2染色，大多数hADSC(>95%)的神经元标志物MAP2和synapsin1及运动神经元标志物HB9染色为阴性(图2B)，提示如果不诱导，自发的神经元分化很少，即便在一系列传代后，hADSC亦可维持其干细胞身份。最早从处理后6个小时开始，发明人即观察到剧烈的形态改变。令人吃惊的是，在诱导的3天内，细胞开始表达运动神经元标志物HB9、Oligo2和PAX6以及神经元标志物synapsin1。MAP2表达也上调(图2C)。hADSC的胞体开始回缩并变得具有光折射性，随着轴突样结构生长、延伸和形成，逐渐变得极化。synapsin1的表达主要集中在胞体，暗示这些神经元仍是未成熟的，突触形成仍未发生。大多数培养物表达多能MN祖细胞标志物Oligo2和PAX6这一事实提示hADSC-运动神经元转分化培养物的不成熟性质。因此，本发明人进一步利用BDNF、GDNF和IGF使得这些不成熟的运动神经元样细胞成熟。在3天处理期间，synapsin1表达水平显著上调(图2D、E)，开始见到清晰的角状结构，从而表明突触形成的开始以及神经元的进一步成熟(图2D)。诱导6天后，Oligo2表达下调，暗示更多的MN祖细胞转化成MN(图2D、E)。

虽然hADSC-MN表达各种谱系特异性标志物，从而证实它们的神经元身份，更具体地说，是运动神经元身份，但关键的是确定它们是否能表达各种离子通道并激发动作电位，这一最重要的神经元标准。因此，发明人对6-日诱导方案获得的hADSC-MN进行全细胞膜片钳记录。在全细胞电压-钳构型中，记录hADSC-MN的电压依赖性内向电流。当加入1uM TTX时，这些内向电流完全阻断，提示这些内向电流是典型的电压门控钠电流(图3A)。与上述相一致的是，qRT-PCR实验显示电压依赖性钠通道和钙通道具有最高的表达水平，还可检测到钾通道的水平(图3B)。突触蛋白，例如SNAP25(SNARE复合物成员)的表达水平显著改变。重要的是，包括Sim-1、Oligo2、HB9、ChAT、Nkx6.1和NF-200在内的运动神经元标志物的表达谱上调(图3C、D)，从而暗示了培养物的运动神经元性质。然而，除了常规神经细胞标志物，例如Tuj1、MAP2、NFL和NFM表达升高外，还可检测到其它谱系特异性标志物，例如GAP43(神经元间标志物)和GFAP(神经胶质标志物)(图3B)。综合来看，可以得出以下结论：中性化和ventralize以及进一步的成熟处理后，hADSC能变成电生理活性神经元，主要是运动神经元。

实施例3.移植的hADSC-preMN在小鼠脊髓受损模型中的疗效

本发明人进一步检验了hADSC-衍生的运动神经元是否能在SCI模型体内施加疗效。

先用SHH和RA处理hADSC一天。经检测，得到的细胞群体中有60%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物Oligo2；有40%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物PAX6；有70%的细胞表达运动神经元细胞标志物HB9；有80%的细胞表达神经元细胞标志物MAP2。然后，选择这些预处理的细胞并将它们移植入脊髓受损小鼠脊柱的受损部位及其外中心。移植前3天，用慢病毒-GFP感染hADSC以便示踪移植的细胞。在SCI模型建立后的第7天进行细胞移植。然后将小鼠维持在SPF动物笼舍中作行为观察8周，随后处死(图4B)。移植后8周，PBS对照仍表现出大的可见空腔，与之相比，移植组中受损部位极大恢复(图4A)。在PBS对照组中，受损部位尾部的腰椎变成灰色，表明有组织变性。hADSC-MN移植几乎完全阻断了这种变性(图4A)。T8节段处的SCI不可避免地导致失禁并需要精心的日常照料。可能是因为损伤的严重程度，PBS对照组中约30%SCI小鼠死亡。令人吃惊的是，移植组中无小鼠死亡(图4C)，体现出hADSC-MN移植所赋予的真实治疗益处。

为更直接地评估功能恢复，由不了解治疗组的至少两位检测人员分析后肢运动功能。如图4D所示，应用和处理BBB衍生BMS运动评级表评分，包括基础评分和子评分。PBS对照组(PBS注射)的评分逐渐增加，在受伤后3周左右达到平台，估计是因为自发恢复。然而，hADSC-MN组中BMS评分稳定增加并持续升高至8周，显著关于PBS对照组(P<0.001)。事实上，移植的hADSC-MN早在第一周即表现出疗效(P<0.05)(图4D)。这些数据证明hADSC-MN细胞移植能显著缓解SCI小鼠表现出的行为和功能缺失。

实施例4.移植的hADSC-MN在受损组织中的存活以及整合

本发明进一步进行了细胞检测并测定了移植细胞的命运，从而提供说明疗效的细胞基础。如预期的那样，在PBS对照组中没有检测到GFP阳性细胞。受损部位依然可见，空腔形成明显(图5A)。相比之下，在hADSC-MN移植组中发现大量GFP阳性细胞，大多数在受损部位的中心及其外中心的两侧(图5B)。GFP阳性细胞大多数是(>80%)MAP2-阳性染色，但有少量是GFAP阳性染色(<10%)，提示移植的hADSC-MN在体内主要向神经元谱系分化(图5B和G)。此外，预处理的hADSC适应类似于成熟神经元的体内多极化形态，与宿主组织整合并迁移出至少几毫米(图5B放大图-1、2、3)。因此，移植组中受伤后形成的空腔的大小远小于对照组的(图5J)。与预期的一样，受伤部位中及附近的大量GFAP阳性细胞表明，SCI导致大量炎性反应以及由此的神经胶质活化(图6A)，令人吃惊的是，治疗组中，受伤部位区域的GFAP阳性细胞大量缺失(图6B)，从而强烈提示所移植hADSC细胞的免疫抑制功能。

实施例5.移植hADSC运动神经元样细胞在小鼠SCI模型中的疗效以及移植细胞在受损组织中的存活和整合

发明人进一步利用运动神经元样细胞诱导剂处理3天(3天-方案)以及结合神经营养因子再处理3天(6-天方案)得到的运动神经元样细胞重复实施例3和4，以便评估3天-方案和6-天方案所得细胞在小鼠CSI模型中的疗效以及移植细胞在受损组织中的存活和整合情况。

结果，出乎意料地发现，虽然与实施例3和4所用的细胞，即，仅仅诱导了1天的细胞相比，3-天方案与6-天方案所得细胞的成熟度更高，但在小鼠CSI模型中的疗效以及移植细胞在受损组织中的存活和整合情况却不如诱导1天所得细胞。

结论

本发明证实能利用运动神经元样细胞分化诱导剂使得hADSC向运动神经元谱系分化。这些hADSC不仅表达运动神经元和神经元特异性标志物，还通过表达各种电压门控离子通道，例如钠、钾和钙通道而成为电生理活性。为运动神经元分化作预处理并局部移植入小鼠SCI模型的受伤脊髓后，观察到显著的功能和行为恢复。这些引发的hADSC是免疫豁免的，避开免疫排斥并长期存活。大多数这些hADSC变成神经元，可能参与重建受损的回路并通过抑制炎症来优化微环境。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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Claims (6)

1.一种将脂肪干细胞分化成运动神经元样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

利用运动神经元样细胞诱导剂处理3-6代脂肪干细胞24小时，从而获得运动神经元样细胞群；

运动神经元样细胞诱导剂是10ng/mL SHH和0.1uM RA。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪干细胞是高纯度脂肪干细胞，其中75％以上的脂肪干细胞是CD29、CD44、CD105阳性细胞；而10％以下的脂肪干细胞是CD45和CD133阳性细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脂肪干细胞是高纯度脂肪干细胞，其中85％以上的脂肪干细胞是CD29、CD44、CD105阳性细胞；而3.5％以下的脂肪干细胞是CD45和CD133阳性细胞。

4.一种脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞群，所述细胞群具有以下一种或多种特征：

(1)有50％-70％的细胞表达运动神经元祖细胞标志物Oligo2；

(2)有30％-50％的细胞表达运动神经元祖细胞标志物PAX6；

(3)有60％-80％的细胞表达运动神经元标志物HB9；

(4)有70％-90％的细胞表达神经元标志物MAP2；

(5)有20％-40％的细胞表达神经元标志物Synapsin1/2；

(6)有20％-40％的细胞不表达HB9；

(7)有60％-80％的细胞不表达Synapsin1/2；

(8)有10％-30％的细胞不表达MAP2；

并且所述细胞群采用权利要求1或2所述的方法制备。

5.权利要求4所述运动神经元样细胞群的用途，所述运动神经元样细胞群用于制备预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤的药物。

6.一种预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤的药物组合物，所述药物组合物包含：

(1)有效量的如权利要求4所述的运动神经元样细胞群；和

(2)药学上可接受的载体。

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