ES2300320T3 - Celulas madre pluripotentes generadas a partir de celulas del estroma derivadas de tejido adiposo y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento in vitro para diferenciar una célula del estroma aislada derivada de tejido adiposo en una célula que tiene las propiedades de una célula neuronal, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicha célula del estroma con un antioxidante, induciendo así la diferenciación de dicha célula del estroma en una célula neuronal in vitro.
Description
Células madre pluripotentes generadas a partir
de células del estroma derivadas de tejido adiposo y sus usos.
La invención está en el campo de los
procedimientos para inducir que células del estroma aisladas
derivadas de tejido adiposo se diferencien en células de linaje no
mesenquimal. En particular la invención se refiere a procedimientos
para inducir que una célula del estroma aislada derivada de tejido
adiposo exprese al menos una característica fenotípica de una
célula neuronal.
Una célula madre debe cumplir los siguientes
criterios: (1) capacidad de una población de células madre clonales
para autorrenovarse; (2) capacidad de una población de células madre
clonales para generar un nuevo tipo de célula terminalmente
diferenciada in vitro; (3) capacidad de una población de
células madre clonales para sustituir una población ausente de
células terminalmente diferenciadas cuando se transplantan a un
animal con sus propias células naturales drásticamente
reducidas.
El periodo neonatal en el desarrollo humano se
caracteriza por la presencia de células "madre" con el
potencial para desarrollarse a lo largo de múltiples rutas de
diferenciación. La diferenciación terminal de estas células está
determinada por las señales de citoquinas y hormonales que coordinan
la organogénesis y la arquitectura tisular. Se han aislado células
madre embrionarias (ES) murinas y se han estudiado exhaustivamente
in vitro e in vivo. Usando estímulos exógenos in
vitro, los investigadores han inducido la diferenciación de
células ES a lo largo de múltiple rutas de linaje. Estas rutas
incluyen las rutas neuronal, linfoide de linaje B y de adipocitos
(Dani y col. (1997) J. Cell Sci. 110:1279; Remoncourt y col.
(1998) Mech. Dev. 79:185; O'Shea, S. (1999) Anat.
Rec. 257:32, 1999). Las células ES se han manipulado in
vivo por técnicas de recombinación homóloga para generar
ratones que no expresan o nulos para un gen específico (Johnson, R.
S. (1989) Science 245:1234). Una vez que se han aislado los
clones de células ES que carecen de un gen específico, se
transplantan a un zigoto murino fertilizado. La progenie de esta
célula ES aislada puede desarrollarse en cualquiera y en todos los
tejidos murinos de una forma coordinada.
Las células madre multipotenciales existen en
tejidos del organismo adulto. El ejemplo mejor caracterizado de una
"célula madre" es el progenitor hematopoyético aislado de la
médula ósea y la sangre periférica. Los estudios fundamentales de
Trentin y colaboradores (Trentin (1965) Cardiovasc. Res. Cent.
Bull 4:38; Till & McCulloch (1961) Rad. Res. 14:213)
examinaban ratones irradiados letalmente. En ausencia de
tratamiento, estos animales murieron porque no consiguieron reponer
sus células sanguíneas de la circulación; sin embargo, el
transplante de células de la médula ósea de animales donantes
singénicos rescató al animal huésped. Las células del donante
fueron responsables de la repoblación de todas las células
sanguíneas de la circulación. Se han sucedido una gran cantidad de
estudios elegantes para demostrar que la donación de un número
finito de células madre hematopoyéticas sin diferenciar es capaz de
regenerar cada uno de los ocho o más linajes de células sanguíneas
diferentes en un animal huésped. Este trabajo ha proporcionado la
base para el transplante de médula ósea, una modalidad terapéutica
ampliamente aceptada para el cáncer y los errores de metabolismo
congénitos. Por lo tanto, las células madre hematopoyéticas siguen
estando presentes en la médula ósea humana normal a lo largo de
toda la vida; y no están limitadas al periodo neonatal.
Hay una nueva constatación apasionante de que
los progenitores hematopoyéticos pueden no estar limitados al
microentorno de la médula ósea. Investigadores de la Universidad de
Calgary han examinado células madre neuronales, que habitualmente
se diferencian en las rutas de linaje de células neuronales. Cuando
estas células se transplantaron a huéspedes letalmente irradiados,
los investigadores detectaron la presencia de marcadores de células
del donante en células mieloides y linfoides recién producidas
(Bjornson (1999) Science 283:534). Investigadores en el
Baylor College of Medicine han llevado a cabo estudios similares
usando células satélite aisladas de músculo esquelético murino
(Jackson y col. (1999) PNAS 96:14482). Cuando estas células
derivadas de músculo se transplantaron a huéspedes letalmente
irradiados, los investigadores detectaron la presencia de marcadores
de genes musculares en todos los linajes de células sanguíneas.
Conjuntamente estos estudios indican que el tejido neuronal y
muscular contiene células madre capaces de diferenciación
hematopoyética. Esto sugiere que otros sitios distintos de la
médula ósea pueden proporcionar una fuente renovable de progenitores
hematopoyéticos con potencial aplicación en la terapia de
enfermedades humanas (Quesenberry y col. (1999) J.
Neurotrauma 16:661: Scheffler y col. (1999) Trends
Neurosci. 22: 348; Svendson & Smith (1999) Trends
Neurosci. 22:357).
Al igual que las células neuronales y musculares
pueden regenerar la médula ósea irradiada, las células derivadas de
la médula ósea pueden repoblar otros sitios de órganos. Cuando las
células hematopoyéticas y del estroma derivadas de la médula ósea
se transplantan a un animal con un hígado dañado, son capaces de
regenerar la células ovales hepáticas en el animal huésped (Peterse
y col. (1999) Science 284:1168). De la misma forma, cuando
las células del estroma de la médula ósea marcadas se implantan en
el ventrículo lateral de un ratón neonatal, son capaces de
diferenciarse en astrocitos maduros (Kopen y col. (1999) PNAS
96:10711). Realmente, cuando las células del estroma de la médula
ósea se transplantan por vía intraperitoneal a ratones, se detectan
por todos los órganos del animal huésped, incluyendo el bazo,
pulmón, médula ósea, hueso, cartílago y piel (Pereira y col. (1998)
PNAS 95:p1142, 1998). Estos estudios sugieren que la célula
del estroma de la médula ósea se puede diferenciar en diferentes
linajes a partir de su origen mesodérmico original (Kopen y col.
(1999) PNAS 96:10711).
El reciente desarrollo de organismos enteros a
partir de una sola célula de donante está de acuerdo con esta
hipótesis. Por ejemplo, el experimento de "Dolly" mostró que
células aisladas de una glándula mamaria ovina podían desarrollarse
en una oveja madura. En estudios similares con murinos, células
derivadas del cuerpo lúteo del ovario podían desarrollarse en un
ratón maduro. Estos estudios sugieren que en el organismo adulto
siguen existiendo células madre con capacidad para diferenciarse en
cualquiera y en todos los tipos de células. Por lo tanto, las
células madre "embrionarias" pueden mantenerse a lo largo de
toda la vida de un individuo.
El microentorno de la médula ósea del adulto es
la fuente potencial para estas hipotéticas células madre. Las
células aisladas de la médula ósea de adulto se denominan con una
variedad de nombres que incluyen células del estroma, células madre
del estroma, células madre mesenquimales (MSC), fibroblastos
mesenquimales, células endoteliales reticulares, y células de
Westen-Bainton (Gimble y col. (1996) Bone
19:421, 1996). Los estudios in vitro han determinado que
estas células pueden diferenciarse en múltiples linajes
mesenquimales o mesodérmicos, que incluyen, pero no se limitan a
adipocitos (células grasas) (Gimble y col. (1990) Eur. J.
Immunol. 20:379), condrocitos (Bruder y col. (1994) J. Cell
Biochem. 56:283), células de soporte hematopoyéticas
(Pietrangeli y col. (1988) Eur. J. Immunol. 18:863), miocitos
del músculo esquelético (Prockop (1998) J. Cell Biochem.
Suppl. 30-31:284-5), miocitos
musculares lisos (Charbord) y osteoblastos (Beresford y col. (1992)
J. Cell Sci. 99:131; Dorheim y col. (1993) J. Cell
Physiol. 154:317) Además, las células del estroma de la médula
ósea presentan la capacidad de diferenciarse en astrocitos (Kopen y
col., (1999) PNAS 96:10711) y células ovales hepáticas
(Petersen y col. (1999) Science 284:1168). Basándose en
estos descubrimientos, se ha propuesto la médula ósea como una
fuente de células madre del estroma para la regeneración ósea, de
cartílago, músculo, tejido adiposo, hígado, neuronal y otros
tejidos. Sin embargo, la extracción de células del estroma de la
médula ósea presenta un alto nivel de riesgo e incomodidad para el
paciente.
A diferencia de esto, las células del estroma
derivadas de tejido adiposo extramedular humano de adulto
representan una fuente de células madre del estroma que se puede
recoger de forma rutinaria con riesgo e incomodidad mínimos para el
paciente. Las pruebas patológicas sugieren que las células del
estroma derivadas de tejido adiposo pueden diferenciarse en
múltiples rutas de linajes. Los tumores de tejido blando más
comunes, los liposarcomas, se desarrollan a partir de células de
tipo adipocitos. Los tumores de tejidos blandos de origen mixto son
relativamente comunes. Estos tumores pueden incluir elementos de
tejido adiposo, muscular (liso o esquelético), cartílago y/u óseo.
En pacientes con una afección rara conocida como heteroplasia ósea
progresiva, los adipocitos subcutáneos forman hueso por razones que
no se conocen.
Estudios recientes han demostrado la capacidad
específica de las células del estroma derivadas de la médula ósea
para experimentar diferenciación neuronal in vitro (Woodbury
y col. (2000) J. Neuroscience Research 61:364;
Sanchez-Ramos y col. (2000) Exp. Neurology
164:247). En estas investigaciones, el tratamiento de las células
del estroma de la médula ósea con antioxidantes, factor de
crecimiento epidérmico (EGF) o factor neurotrófico derivado de
cerebro (BDNF), indujo a las células a experimentar cambios
morfológicos consecuentes con la diferenciación neuronal, es decir,
la extensión de proyecciones celulares largas que terminan en conos
de crecimiento y filopodia (Woodbury y col. (2000) J.
Neuroscience Research 61:364; Sanchez-Ramos y
col. (2000) Exp. Neurology 164:247). Además, estos agentes
indujeron la expresión de proteína específica neuronal incluyendo
nestina, enolasa específica de neurona (NSE), neurofilamento M
(NF-M), NeuN, y el receptor del factor de
crecimiento de nervios trkA (Woodbury y col. (2000) J.
Neuroscience Research 61:364; Sanchez-Ramos y
col. (2000) Exp. Neurology 164:247.
La patente de EE.UU. nº 5.486.359 de Osiris se
dirige a una población homogénea aislada de células madre
mesenquimales humanas que pueden diferenciarse en células de más de
un tipo de tejido conjuntivo. La patente describe un procedimiento
para aislar, purificar y replicar en gran medida estas células en
cultivo, es decir, in vitro.
La patente de EE.UU. nº 5.942.225 de Case
Western y Osiris describe una composición para inducir la
diferenciación dirigida al linaje de células madre mesenquimales
humanas aisladas en un solo linaje mesenquimal particular, que
incluye las células madre mesenquimales humanas y uno o más factores
bioactivos para inducir la diferenciación de las células madre
mesenquimales en un solo linaje particular.
La patente de EE.UU. nº 5.736.396 de Case
Western describe un procedimiento para inducir la diferenciación
dirigida al linaje ex vivo de células madre mesenquimales
humanas aisladas, que incluye poner en contacto las células madre
mesenquimales con un factor bioactivo para inducir de esta forma su
diferenciación ex vivo en un solo linaje mesenquimal
particular. La patente también describe el procedimiento para tratar
un individuo que necesite células mesenquimales de un linaje
mesenquimal particular, que incluye administrar a un individuo que
lo necesita, una composición que comprende células madre
mesenquimales humanas aisladas, que se han inducido para
diferenciarse ex vivo por contacto con un factor bioactivo,
para inducir así la diferenciación ex vivo de dichas células
en un solo linaje mesenquimal particular.
La patente de EE.UU. nº 5.908.784 de Case
Western describe una composición para la condrogénesis in
vitro de células precursoras mesenquimales humanas y la
formación in vitro de condrocitos humanos a partir de las
mismas, cuya composición incluye células madre mesenquimales humanas
aisladas estrechamente condensadas como un sedimento celular
empaquetado y al menos un agente inductor de condrocitos en contacto
con las mismas. La patente también describe un procedimiento para
inducir la condrogénesis en células madre mesenquimales poniendo en
contacto las células madre mesenquimales con un agente inductor de
condrocitos in vitro, en el que las células madre se
condensan estrechamente como un sedimento de células
empaquetadas.
La patente de EE.UU. nº 5.902.741 de Advanced
Tissue Sciences, Inc. describe un tejido de cartílago vivo preparado
in vitro, que incluye células del estroma que producen
cartílago y proteínas de tejido conjuntivo segregadas naturalmente
por las células del estroma unidas a y sustancialmente que envuelven
un marco tridimensional compuesto de un material biocompatible no
vivo formado en una estructura tridimensional que tiene espacios
intersticiales unidos por las células del estroma. La patente
también describe una composición para hacer crecer cartílago nuevo,
que comprende células madre mesenquimales en un vehículo polímero
adecuado para la proliferación y diferenciación de células en
cartílago.
La patente de EE.UU. nº 5.863.531 de Advanced
Tissue Sciences, Inc. describe un tejido del estroma vivo tubular
preparado in vitro, que comprende células del estroma y
proteínas de tejido conjuntivo segregadas naturalmente por las
células del estroma unidas a y que sustancialmente envuelven un
marco tubular tridimensional compuesto de un material biocompatible
no vivo, que tiene espacios intersticiales unidos por las células
del estroma.
La patente de EE.UU. nº 5.811.094 de Osiris
describe un procedimiento para producir tejido conjuntivo que
incluye producir tejido conjuntivo en un individuo que lo necesite,
administrando a dicho individuo una preparación celular que
contiene células madre masenquimales humanas, que se recuperan de
médula ósea humana y que sustancialmente no tiene células
sanguíneas.
La patente de EE.UU. nº 6.030.836 describe un
procedimiento para mantener las células madre hematopoyéticas
humanas in vitro, que comprende cocultivar células madre
mesenquimales humanas con las células madre hematopoyéticas de modo
que al menos algunas de las células madre hematopoyéticas mantengan
su fenotipo de célula madre.
La patente de EE.UU. nº 6.103.522 describe una
línea celular de estroma humano inmortalizada irradiada en un
cultivo in vitro combinado con células precursoras
hematopoyéticas humanas.
El documento WO 9602662A1 y la patente de EE.UU.
nº 5.879.940 describen líneas celulares del estroma de médula ósea
humana que sostiene la hematopoyesis.
La patente de EE.UU. nº 5.827.735 de Morphogen
describe células madre mesenquimales pluripotentes purificadas que
no tienen sustancialmente células comprometidas con el linaje
miogénico multinucleadas, y que tienen predominantemente forma
estelada, en las que las células madre mesenquimales forman
predominantemente células fibroblásticas cuando se ponen en
contacto con proteína morfogénica muscular en medio de cultivo
tisular que contiene suero de ternero fetal al 10% y forman
predominantemente estructuras multinucleadas ramificadas que se
contraen espontáneamente cuando se ponen en contacto con proteína
morfogénica muscular y factor inhibidor de cicatriz en cultivo
tisular con medio que contiene suero de ternero fetal al 10%.
El documento WO 99/94328 describe el uso de
células madre mesenquimales para tratar el sistema nervioso central
y un procedimiento para dirigir la diferenciación de las células del
estroma de la médula ósea.
El documento WO 98/20731 de Osiris describe una
composición precursora de megacariocitos mesenquimales y un
procedimiento para aislar MSC asociadas con megacariocitos aislados,
aislando megacariocitos.
El documento WO 99/61587 de Osiris describe CD45
humano y/o fibroblastos y células madre mesenquimales.
El documento WO 00/53795 de la Universidad de
Pittsburgh y The Regents of the University of California
describen células madre derivadas de tejido adiposo y retícula
sustancialmente sin adipocitos ni glóbulos rojos y poblaciones
clonales de células madre de tejido conjuntivo. Las células se
pueden usar solas o con composiciones biológicamente compatibles,
para generar tejidos y estructuras diferenciadas, tanto in
vivo como in vitro. Además, las células se pueden
expandir y cultivar para producir hormonas y proporcionar medio de
cultivo condicionado para soportar el crecimiento y la expansión de
otras poblaciones de células. En otro aspecto, el documento WO
00/53795 describe una retícula lipoderivada que carece
sustancialmente de células, que incluye material de matriz
extracelular del tejido adiposo. La retícula se puede usar como un
sustrato para facilitar el crecimiento y la diferenciación de
células, sea in vivo o in vitro, en anlagen o tejido
o estructuras maduras. El documento WO 00/53795 no describe células
del estroma derivadas de tejido adiposo que se hayan inducido para
expresar al menos una característica fenotípica de una célula
neuronal, astroglial, progenitora hematopoyética o hepática en su
documento prioritario, ni describe una célula del estroma aislada
derivada de tejido de adipocitos que se haya diferenciado de modo
que haya una ausencia de marcadores fenotípicos de adipocitos.
El documento WO 99/28444 describe procedimientos
y composiciones para diferenciar células del estroma de tejido
adiposo en células que tienen propiedades osteoblásticas, y
procedimientos para mejorar la estructura ósea de un sujeto.
El documento WO 00/44882 describe un
procedimiento y una composición para inducir células del estroma
derivadas de tejido adiposo en adipocitos.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar nuevos procedimientos para la producción celular de
materiales deseados.
La presente invención se refiere a un
procedimiento in vitro para diferenciar una célula del
estroma aislada derivada de tejido adiposo en una célula que tiene
propiedades de una célula neuronal, comprendiendo dicho
procedimiento poner en contacto dicha célula del estroma con un
antioxidante, induciendo de esta forma la diferenciación de dicha
célula del estroma en una célula neuronal in vitro.
Por lo tanto, se induce a la célula del estroma
aislada derivada de tejido adiposo a expresar al menos una
característica de una célula neuronal. Estas células se pueden usar
como producto terapéutico para tratar de forma autóloga o alógena
un huésped que lo necesite, o con propósitos de diagnóstico. Las
células se pueden administrar, por ejemplo, en cualquier vehículo
farmacéuticamente aceptable, incluyendo solución salina tamponada
con fosfato, en la zona objetivo. Alternativamente, las células se
pueden administrar en una matriz, retículo u otros materiales que
tienen estructuras bi o tridimensionales para formar un depósito
estructurado, por ejemplo, un implante o un injerto. El marco
tridimensional puede ser biodegradable o no biodegradable. Los
ejemplos de materiales biodegradables para usar para administrar
estas células incluyen alginato, poli(ácido láctico), poli(ácido
glicólico), polilactida-coglicólido, proteínas tales
como proteoglicanos, glucoproteínas, hialuroninas, fibronectinas y
colágenos. Las células se pueden administrar, si se desea,
combinadas con otro agente tal como una citoquina, factor de
crecimiento, agente inductor químico, producto biológico, producto
quimioterapéutico, hormona, otra célula, proteína, hidrato de
carbono, péptido o ácido nucleico.
Las células derivadas de tejido adiposo
inducidas se pueden usar de forma terapéutica (por ejemplo, en la
reparación, regeneración, reconstrucción o potenciación de tejido,
para el diagnóstico), como biorreactores para producir sustancias
deseadas y en ingeniería genética y tisular.
La invención proporciona procedimientos para
diferenciar células madre del estroma derivadas de tejido adiposo
extramedular humano adulto en el linaje de células neuronales no
mesenquimales. Las células madre del estroma derivadas de tejido
adiposo extramedular humano adulto se pueden usar como células madre
pluripotentes para el tratamiento de una serie de afecciones y
enfermedades humanas y animales.
Se proporciona un procedimiento para inducir
células del estroma derivadas de tejido adiposo para expresar al
menos una característica de una célula derivada de tejido no
adiposo, que es una célula neuronal, que comprende: cultivar
células del estroma aisladas derivadas de tejido adiposo en un medio
de cultivo químicamente definido que comprende un antioxidante. El
medio de cultivo puede contener opcionalmente suero y factores de
crecimiento adecuados, hormonas, citoquinas, factores del suero,
extractos embrionarios, preferiblemente un extracto embrionario no
humano; y/o compuestos químicos para inducir la diferenciación de
linaje específico.
Los procedimientos de la invención se pueden
usar para obtener células para el trasplante autólogo o alógeno
para el tratamiento de afecciones humanas, que incluyen pero no se
limitan a discrasias sanguíneas, cáncer, enfermedades y traumatismo
del sistema nervioso central, enfermedades y traumatismo del sistema
nervioso periférico, enfermedades y traumatismo del hígado, entre
otros.
Además, las células obtenidas por un
procedimiento de la presente invención se pueden modificar
genéticamente para expresar un producto génico terapéutico. Las
células derivadas de tejido adiposo se pueden modificar
genéticamente, p. ej. para expresar genes exógenos o para reprimir
la expresión de genes endógenos. De acuerdo con esta realización,
la célula se expone a un vector de transferencia de genes que
comprende un ácido nucleico que incluye un transgén, de modo que el
ácido nucleico se introduce en la célula en condiciones adecuada
para que el transgén sea expresado dentro de la célula. El transgén
en general es un casete de expresión que incluye un polinucleótido
codificante operativamente unido a un promotor adecuado. El
polinucleótido codificante puede codificar una proteína o puede
codificar ARN biológicamente activo, tal como ARN antisentido o un
ribozima.
La invención proporciona un procedimiento in
vitro para diferenciar una célula del estroma aislada derivada
de tejido en una célula que expresa al menos una característica de
una célula neuronal. Las células producidas por los procedimientos
de la invención pueden proporcionar una fuente de células
funcionales parcial o totalmente diferenciadas, que tienen
características de múltiples linajes tisulares para la
investigación, transplante y desarrollo de productos de ingeniería
tisular para el tratamiento de enfermedades animales,
preferiblemente enfermedades humanas y la reparación y mejora de
tejidos.
El tejido adiposo ofrece una alternativa
potencial a la médula ósea como una fuente de células madre del
estroma multipotenciales. El tejido adiposo es fácilmente accesible
y abundante en muchos individuos. La obesidad es una afección de
proporciones epidémicas en Estados Unidos, donde alrededor de 50% de
los adultos superan el índice de masa corporal (IMC) recomendado
basado en su altura y peso. Los adipocitos se pueden recoger por
liposucción en condiciones ambulatorias. La liposucción es un
procedimiento relativamente no invasivo con efectos cosméticos, que
es aceptable para la amplia mayoría de los pacientes. Está bien
documentado que los adipocitos son una población celular que se
puede reponer. Incluso después de la eliminación quirúrgica por
liposucción u otros procedimientos, es común ver la reaparición de
los adipocitos en un individuo a lo largo del tiempo en el mismo
sitio. Esto sugiere que el tejido adiposo contiene células que son
capaces de producir nuevas células adiposas.
El procedimiento se usa para inducir a una
célula del estroma derivada de tejido adiposo para que exprese al
menos una característica fenotípica de una célula neuronal. Los
marcadores fenotípicos de las células deseadas son conocidos para
los expertos en la materia, y hay muchas publicaciones en la
bibliografía. Se siguen describiendo o se pueden identificar
marcadores fenotípicos adicionales sin excesiva experimentación. Se
puede usar cualquiera de estos marcadores para confirmar que se ha
inducido a la célula adiposa a un estado diferenciado. Las
características fenotípicas específicas del linaje pueden incluir
proteínas de superficie celular, proteínas citoesqueléticas,
morfología celular y productos de secreción. Las características
neuronales incluyen la expresión de marcadores neuronales tales
como NeuN, NF-M, NSE, nestina y trkA. Los marcadores
específicos de la sangre pueden incluir la presencia de CD4, CD8,
CD7, CD19, CD45, CD33, CD34, TCR, etc. Un experto en la materia
reconocerá que con procedimientos conocidos calorimétricos, de
fluorescencia, inmunoquímicos, de reacción en cadena de la
polimerasa, químicos o radioquímicos se puede determinar fácilmente
la presencia o ausencia de un marcador específico de linaje.
En otra realización, la célula se diferencia en
ausencia de suero pero en presencia de un agente químico, por
ejemplo, un agente oxidante tal como
2-mercaptoetanol.
Las células diferenciadas que se producen de
acuerdo con los procedimientos de la invención son útiles en los
transplantes autólogos y alógenos.
Por ejemplo, el sitio es el tejido del sistema
nervioso central y la característica o fenotipo deseado es
neuronal. Preferiblemente, el sujeto es mamífero, más
preferiblemente el sujeto es un ser humano.
Las células obtenidas de acuerdo con un
procedimiento de la invención se pueden usar en un procedimiento
para mejorar la hematopoyesis en un paciente, que comprende el
transplante de las células de la invención al paciente.
Preferiblemente, el transplante es por infusión intravenosa. En una
realización, la célula se transfecta transitoria o establemente con
al menos una secuencia de ácido nucleico. Puede mediar la
transfección un virus u otro vehículo que contiene al menos una
secuencia de ácido nucleico deseada que se va a introducir en la
célula.
Las células del estroma derivadas de tejido
adiposo útiles en los procedimientos de la invención se pueden
aislar por una variedad de procedimientos conocidos para los
expertos en la materia. Por ejemplo, dichos procedimientos se
describen en la patente de EE.UU. nº 6.153.432. En un procedimiento
preferido, el tejido adiposo se aísla de un sujeto mamífero,
preferiblemente un sujeto humano. Una fuente preferida de tejido
adiposo es el tejido adiposo omental. En seres humanos, el tejido
adiposo normalmente se aísla por liposucción. Si la células
obtenidas por un procedimiento de la invención se van a
transplantar a un sujeto humano, se prefiere que el tejido adiposo
se aísle de ese mismo sujeto para proporcionar así un transplante
autólogo. Alternativamente, el tejido administrado puede ser
alógeno.
En un procedimiento de aislamiento de células
del estroma derivadas de tejido adiposo, el tejido adiposo se trata
con colagenasa en concentraciones entre 0,01 y 0,5%, preferiblemente
de 0,04 a 0,2%, lo más preferiblemente aproximadamente 0,1%,
tripsina en concentraciones entre 0,01 y 0,5%, preferiblemente
0,04%, lo más preferiblemente aproximadamente 0,2%; y/o dispasa en
concentraciones de 0,5 ng/ml a 10 ng/ml; y/o concentraciones
eficaces de hialuronidasa o DNasa; y ácido
etilendiaminotretraacético (EDTA) en concentraciones de
aproximadamente 0,01 a 2,0 mM, preferiblemente de aproximadamente
0,1 a aproximadamente 1,0 mM, lo más preferiblemente 0,53 mM; a
temperaturas entre 25 y 50ºC, preferiblemente entre 33º y 40ºC, lo
más preferiblemente a 37ºC, durante periodos entre 10 minutos y 3
horas, preferiblemente entre 30 minutos y 1 hora, más
preferiblemente 45 minutos. Las células se pasan por un filtro de
malla de nailon o estopilla de entre 20 micrómetros y 800
micrómetros, más preferiblemente entre 40 y 400 micrómetros, más
preferiblemente 70 micrómetros. Después, las células se someten a
centrifugación diferencial directamente en medio o en gradiente de
Ficoll o Percoll u otras partículas. Las células se centrifugaron a
velocidades entre 100 y 3000 x g, más preferiblemente de 200 a 1500
x g, lo más preferiblemente a 500 x g, durante periodos entre 1
minuto y 1 hora, más preferiblemente de 2 a 15 minutos, lo más
preferiblemente 5 minutos, a temperaturas entre 4º y 50ºC,
preferiblemente entre 20 y 40ºC, lo más preferiblemente
aproximadamente a 25ºC.
La invención comprende el tratamiento de las
células del estroma derivadas de tejido adiposo para inducirlas
para que formen linajes de células neuronales. Aunque la invención
no está ligada a ninguna teoría de acción, se cree que el
tratamiento de los preadipicitos con un medio que contiene un
antioxidante y opcionalmente una combinación de suero, extractos
embrionarios, preferiblemente extracto embrionario no humano,
factores de crecimientos purificados o recombinantes, citoquinas,
hormonas y/o agentes químicos, en un microentorno bi o
tridimensional, inducirá la diferenciación.
Los ejemplos no limitantes de medios base útiles
en los procedimientos de la invención incluyen medio esencial
mínimo de Eagle, ADC-1, LPM (sin albúmina de suero
bovino), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, medio BGJ
(con o sin modificación de Fitton-Jackson), medio
base de Eagle (BME-con adición de base de sal de
Earle), medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM-sin suero), Yamane, IMEM-20,
medio de Eagle modificado por Glasgow (GMEM), medio de Leibovitz
L-15, medio de McCoyls 5A, medio M199
(M199E-con base de sal de Earle), medio M199
(M199H-con base de sal de Hank), medio esencial
mínimo de Eagle (MEM-E-con base de
sal de Earle), medio esencial mínimo de Eagle
(MEM-H-con base de sal de Hank) y
medio esencial mínimo de Eagle (MEM-NAA con
aminoácidos no esenciales), entre muchos otros, que incluyen medio
199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713,
DM 145, Williams' G, Neu-man & Tytell, Higuchi,
MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Un
medio preferido para usar en la presente invención es DMEM. Estos y
otros medios útiles están disponibles en GIBCO, Grand Island, N.Y.,
EE.UU. y Biological Industries, BetHaEmek, Israel, entre otros. Una
serie de estos medios se resumen en Methods in Enzymology, Volume
LVIII, "Cell Culture", pp. 62-72, editado por
William B. Jakoby y Ira H. Pastan, publicado por Academic Press,
Inc.
Los ejemplos no limitantes adicionales de medios
útiles en los procedimientos de la invención, pueden contener suero
fetal bovino o de otra especie en una concentración de al menos 1% a
aproximadamente 30%, preferiblemente al menos aproximadamente 5% a
15%, lo más preferiblemente aproximadamente 10%. El extracto
embrionario de pollo o de otra especie puede estar presente en una
concentración de aproximadamente 1% a 30%, preferiblemente al menos
aproximadamente 5% a 15%, más preferiblemente aproximadamente
10%.
Por "factores de crecimiento, citoquinas,
hormonas" se entienden los siguientes factores específicos que
incluyen, pero no se limitan a hormona de crecimiento,
eritropoyetina, trombopoyetina, interleuquina 3, interleuquina 6,
interleuquina 7, factor estimulador de las colonias de macrófagos,
factor de ligando/célula madre c-kit, ligando de
osteoprotegerina, insulina, factores de crecimiento de tipo
insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento
de fibroblastos, factor de crecimiento de nervios, factor neutrófico
ciliar, factor de crecimiento derivado de plaquetas y proteína
morfogenética ósea en concentraciones de niveles de picogramos/ml a
miligramos/ml. Con dichas concentraciones, los factores de
crecimiento, citoquinas y hormonas útiles en los procedimientos de
la invención pueden inducir hasta 100% de formación de células
sanguíneas (linajes linfoide, eritroide, mieloide o de plaquetas) a
partir de células del estroma derivadas de tejido adiposo en ensayos
de unidades formadoras de colonias (UFC). (Moore y col. (1973)
J. Natl. Cancer Inst. 50:603-623; Lee y
col. (1989) J. Immunol. 142:3875-3883; Medina
y col. (2993) J. Exp. Med. 178:
1507-1515.
Se reconoce además que se pueden añadir
componentes adicionales al medio de cultivo. Dichos componentes
pueden ser antibióticos, antimicóticos, albúmina, aminoácidos y
otros componentes conocidos en la técnica para el cultivo de
células. Además, se puede añadir componentes para potenciar el
proceso de diferenciación.
Por "agentes químicos" se entiende que se
incluye, pero no se limita a compuestos antioxidantes tales como
hidroxianisol butilado (BHA) o 2-mercaptoetanol,
esteroides, retinoides y otros compuestos o agentes químicos que
inducen la diferenciación de células del estroma derivadas de tejido
adiposo.
Por "caracterización" de las células
diferenciadas resultantes se entiende la identificación de proteínas
de superficie e intracelulares, genes y/u otros marcadores
indicativos del compromiso del linaje de células del estroma a un
estado diferenciado terminal particular. Estos procedimientos
incluirán, pero no se limitan a (a) detección de proteínas de
superficie celular por procedimientos inmunofluorescentes usando
anticuerpos monoclonales ligados específicos de proteínas, usando
un marcador fluorescente secundario, incluyendo el uso de
procedimientos de citometría de flujo; (b) detección de proteínas
intracelulares por procedimientos inmunofluorescentes usando
anticuerpos monoclonales ligados específicos de proteínas, usando un
marcador fluorescente secundario, incluyendo el uso de
procedimientos de citometría de flujo; (c) detección de genes
celulares por la reacción en cadena de la polimerasa, hibridación
in situ y/o análisis de transferencia northern.
Las células parcial o terminalmente
diferenciadas se pueden caracterizar por la identificación de
proteínas de superficie e intracelulares, genes y/u otros
marcadores indicadores del compromiso de linaje de las células del
estroma a un estado diferenciado terminal particular. Estos
procedimientos incluirán, pero no se limitan a (a) detección de
proteínas de superficie celular por procedimientos
inmunofluorescentes tales como citometría de flujo o inmunotinción
in situ de las proteínas de la superficie de células del
estroma derivadas de tejido adiposo tales como la fosfatasa
alcalina, CD44, CD146, integrina beta 1 u osteopontina (Gronthos y
col. (1994) Blood 84:4164-4173); (b)
detección de proteínas intracelulares por procedimientos
inmunofluorescentes tales como la citometría de flujo o
inmunotinción in situ de células del estroma derivadas de
tejido adiposo usando anticuerpos monoclonales específicos
dirigidos contra receptores activados por el proliferador de
peroxisomas, receptores de retinoide X, receptores de vitamina D o
Cbfa 1; (c) detección de la expresión de ARNm selectivos de linaje
tales como de osteocalcina, PPAR gamma, leptina, Cbfa1,
interleuquina 7, ligando de osteoprotegerina y/o factor estimulador
de colonias de macrófagos, marcador de leucocitos y factor de
crecimiento, por procedimientos tales como la reacción en cadena de
la polimerasa, hibridación in situ y/o otros análisis de
transferencia (Véase Gimble y col. (1989) Blood 74:
303-311).
Las células se pueden administrar a un huésped
en una amplia variedad de formas. Los modos de administración
preferidos son la administración parenteral, intraperitoneal,
intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraesternal,
intraarticular, intrasinovial, intratecal, intraarterial,
intracardiaca, intramuscular, intranasal, subcutánea, intraorbital,
intracapsular, tópica, parche transdérmico, vía rectal, vaginal, o
uretral, incluyendo vía supositorio, percutánea, pulverizador
nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de
infusión o vía catéter. El agente y el vehículo se pueden
administrar, por ejemplo, en una formulación de liberación lenta
tal como una inyección tisular directa o bolo, implante,
micropartículas, microsferas, nanopartículas o nanosferas.
La presencia de células diferenciadas obtenidas
por un procedimiento de la invención se puede detectar en un sujeto
por una variedad de técnicas que incluyen, pero no se limitan a
técnicas de citometría de flujo, inmunohistoquímicas, de
hibridación in situ y/o histológicas o biológicas celulares.
Véase, por ejemplo, Kopen y col., (1999) Proc. Natl. Acad.
Sci. 96:10711-10716.
Las enfermedades o patologías incluyen
enfermedades neurodegenerativas, enfermedades hepatodegenerativas,
enfermedades nefrodegenerativas, lesión de la médula espinal,
traumatismo craneal o cirugía, infecciones víricas que dan como
resultado la degeneración del tejido, órgano o glándula, y
similares. Dichas enfermedades neurodegenerativas incluyen, pero no
se limitan a complejo de demencia del SIDA; enfermedades
desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis por
deficiencia aguda de transferasa; trastornos extrapiramidales y
cerebelosos, tales como lesiones del sistema corticoespinal;
trastornos de los ganglios basales o trastornos cerebelosos;
trastornos del movimiento hipercinéticos, tales como corea de
Huntington y corea senil; trastornos del movimiento inducidos por
fármacos, tales como los inducidos por fármacos que bloquean los
receptores de dopamina del SNC; trastornos del movimiento
hipocinéticos, tales como enfermedad de Parkinson; parálisis
supranuclear progresiva; lesiones estructurales del cerebelo;
degeneraciones espinocerebelosas, tales como ataxia espinal, ataxia
de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelosas, (Mencel,
Dejerine Thomas, Shi-Drager, y
Machado-Joseph), trastornos sistémicos, tales como
la enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemia, ataxia,
telangiectasia; y trastornos multisistémicos mitocondriales;
trastornos desmielinizantes centrales, tales como la esclerosis
múltiple, mielitis transversa aguda; y trastornos de la unidad
motora, tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración
de células del cuerno anterior, tales como esclerosis lateral
amiotrófica; atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular
espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down en la
mediana edad; enfermedad difusa de cuerpos de Lewy; demencia de
tipo de cuerpos de Lewy; síndrome de
Wernicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad
de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante
subaguda, enfermedad de Hallervorden-Spatz; y
demencia pugilística. Véase, p. ej., Berkow y col., (eds.) (1987),
The Merck Manual, (15th) ed.), Merck and Co., Rahway,
NJ.
En otra realización, las células derivadas de
tejido adiposo obtenidas por un procedimiento de la invención se
pueden modificar genéticamente, p. ej., para expresar genes exógenos
o para reprimir la expresión de genes endógenos. De acuerdo con
esta realización, la célula se expone a un vector de transferencia
de genes que comprende un ácido nucleico que incluye un transgén,
de modo que el ácido nucleico se introduce en la célula en
condiciones adecuadas para que el transgén sea expresado dentro de
la célula. El transgén en general es un casete de expresión, que
incluye un polinucleótido codificante operativamente unido a un
promotor adecuado. El polinucleótido codificante puede codificar
una proteína o puede codificar ARN biológicamente activo, tal como
ARN antisentido o un ribozima. Por lo tanto, el polinucleótido
codificante puede codificar un gen que confiere, por ejemplo,
resistencia a una toxina, una hormona (tal como hormonas del
crecimiento peptídicas, factor de liberación de hormonas, hormonas
sexuales, hormonas adrenocorticotróficas, citoquinas tales como
interferones, interleuquinas y linfoquinas), un resto de
señalización intracelular unido a la superficie celular tal como
moléculas de adhesión celular y receptores de hormonas, y factores
que promueven un linaje de diferenciación dado, o cualquier
transgén con secuencia conocida.
El casete de expresión que contiene el transgén
debe incorporarse en el vector genético adecuado para suministrar
el transgén a la célula. Dependiendo de la aplicación final deseada,
se puede usar cualquiera de dichos vectores para modificar
genéticamente las células (p. ej., plásmidos, ADN desnudo, virus
tales como adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus,
lentivirus, papilomavirus, retrovirus, etc.). Se puede usar
cualquier procedimiento de construcción del casete de expresión
deseado en estos vectores, muchos de los cuales son conocidos en la
técnica, tal como por clonación directa, recombinación homóloga,
etc. El vector deseado determinará en gran medida el procedimiento
usado para introducir el vector en las células, que en general son
conocidos en la materia. Las técnicas adecuadas incluyen fusión de
protoplastos, precipitación con fosfato cálcico, pistola de genes,
electroporación e infección con vectores víricos.
Las células obtenidas por un procedimiento de la
invención se pueden usar combinadas con cualquier técnica conocida
de ingeniería de tejidos, incluyendo pero sin limitar a las
tecnologías descritas en las patentes y publicaciones citadas en
los antecedentes de la invención (incluidas las patentes de EE.UU.
nº 5.902.741 y 5.863.531 de Advanced Tissue Sciences, Inc.) así
como, pero no limitado a: patente de EE.UU. nº 6.139.574, Vacanti y
col. (10/31/2000) Vascularized Tissue Regeneration Matrices
Formed By Solid Free Form Fabrication Techniques; patente de
EE.UU. nº 5.759.830, Vacanti y col. (6/2/98)
Three-Dimensional Fibrous Scaffold Containing
Attached Cells For Producing Vascularized Tissue In Vivo,
patente de EE.UU. nº 5.741.685, Vacanti, (4/21/98) Parenchymal
Cells Packaged In Immunoprotective Tissue For Implantation;
patente de EE.UU. nº 5.736.372, Vacanti y col. (4/7/98)
Biodegradable Synthetic Polymeric Fibrous Matrix Containing
Chondrocyte For In Vivo Production Of A Cartilaginous
Structure; patente de EE.UU. nº 5.804.178, Vacanti y col.
(9/8/98) Implantation Of Cell-Matrix Structure
Adjacent Mesentery, Omentum Or Peritoneum Tissue, patente de
EE.UU. nº 5.770. 417, Vacanti y col. (6/23/98)
Three-Dimensional Fibrous Scaffold Containing
Attached Cells For Producing Vascularized Tissue In Vivo;
patente de EE.UU. nº 5.770.193, Vacanti y col. (6/23/98)
Preparation of Three-Dimensional Fibrous
Scaffold For Attaching Cells To Produce Vascularized Tissue In
Vivo; patente de EE.UU. nº 5.709.854,
Griffith-Cima y col. (1/20/98) Tissue Formation
By Injecting A Cell-Polymeric Solution That Gels
In Vivo; patente de EE.UU. nº 5.516.532, Atala y col. (5/14/98)
Injectable Non-lmmunogenic Cartilage And Bone
Preparation; patente de EE.UU. nº 5.855.610, Vacanti y col.
(1/5/99) Engineering Of Strong, Pliable Tissues; patente de
EE.UU. nº 5.041.138, Vacanti y col. (8/20/91) Neomorphogenesis Of
Cartilage In Vivo From Cell Culture; patente de EE.UU. nº
6.027.744, Vacanti y col. (2/22/00) Guided Development and
Support Of Hydrogel-Cell Compositions; patente
de EE.UU. nº 6.123.727, Vacanti y col. (9/26/00) Tissue
Engineered Tendons And Ligament; patente de EE.UU. nº
5.536.656, Kemp y col. (7/16/96) Preparation Of Tissue
Equivalents By Contraction Of A Collagen Gel Layered On A Collagen
Gel; patente de EE.UU. nº 5.144.016, Skjak-Braek
y col. (9/1/92) Alginate Gels; patente de EE.UU. nº
5.944.754, Vacanti (8/31/99) Tissue Re-Surfacing
With Hydrogel-Cell Compositions; patente de
EE.UU. nº 5.723.331, Tubo y col. 55 (3/3/98) Methods And
Compositions For The Repair Of Articular Cartilage Defects In
Mammals; patente de EE.UU. nº 6.143.501, Sittinger y col.
(11/7/00) Artificial Tissues, Methods For The Production And The
Use Thereof.
Los ejemplos 1, 2 y 4 no están dentro del
alcance de la presente invención y se incluyen solo con propósitos
ilustrativos.
Ejemplo
1
A. Se aíslan células del estroma de tejido
adiposo humano de acuerdo con los procedimientos descritos en la
solicitud de patente de EE.UU. 09/240.029, presentada el 29 de
enero, 1999, y usando las modificaciones del medio de crecimiento
descritas antes. Brevemente, se aislaron preadipocitos humanos de
tejido adiposo sacado por cirugía de liposucción de acuerdo con
procedimientos descritos previamente por Rodbell y Hauner (Rodbell
(1967) y (1974); Hauner, véase antes). Los preadipocitos de la
fracción del estroma vascular se volvieron a suspender en medio de
DMEM (alta concentración de glucosa) que contenía suero bovino fetal
al 10%, extracto de embrión de pollo al 5% y antibióticos y se
pusieron en placa con 25.000 células/pocillo en cada uno de los
pocillos de una placa de 96 pocillos (150 \mul/pocillo). Después
las células se pusieron en un incubador con C al 3,7% y CO_{2} al
5% y se dejaron reposar toda la noche. Las células se cultivan como
cultivos primarios durante un periodo de hasta 5 días después del
cultivo en placa inicial. Las células se recogieron por digestión
con tripsina/EDTA antes de la diferenciación/implante.
Se ensaya en las células del estroma derivadas
de tejido adiposo humano la diferenciación hematopoyética basándose
en un ensayo de repoblación de médula ósea. Ratones SCID
inmunodeficientes o beige/sin sistema inmune se irradian letalmente
con 11 Gy de irradiación \gamma con una dosis dividida y se
mantienen con una dieta de agua acidificada y alimento esterilizado
en autoclave. Se aíslan células hematopoyéticas de la médula ósea de
los mismos animales en cantidades de aproximadamente 10^{7}
células por transplante. Se introducen células hematopoyéticas de
origen murino (10^{7} células derivadas de médula ósea) o células
del estroma de origen humano (10^{6} células derivadas de tejido
adiposo) en los ratones 16 horas después de la irradiación letal por
inyección por la vena de la cola o la vena retroorbital.
Alternativamente, se mezclan las células del estroma humano con
células hematopoyéticas murinas con una relación de aproximadamente
1:10 antes del transplante a un animal huésped letalmente
irradiado, para determinar un ensayo de repoblación competitivo. Se
hace la transfusión a los animales con anestesia de oxiflurano. De
6 a 12 semanas después del transplante se recoge sangre de los
animales receptores y se somete a análisis por citometría de flujo
con anticuerpos monoclonales específicos para los marcadores de
células hematopoyéticas humanas, incluyendo pero no limitado a Thy
(marcador de células T), B220 (marcador de células B), Mac 1
(marcador de macrófagos) y HLA (marcador humano
H-2K). Se determina el porcentaje de células
hematopoyéticas periféricas totales de origen humano frente a las de
origen murino. En estudios similares, se recoge médula ósea y el
bazo de los ratones receptores y se someten a ensayos clonogénicos
in vitro para los linajes hematopoyéticos específicos. Estos
estudios usan ensayos basados en colonias en metilcelulosa. Se
analiza el compromiso de linaje específico en las células usando
procedimientos inmunofluorescentes comparables.
B. Se aísla tejido adiposo humano de un paciente
humano individual por liposucción y se aíslan células del estroma
derivadas del tejido adiposo in vitro de acuerdo con los
procedimientos descritos antes. Las células se cultivan como
cultivos primarios durante un periodo de hasta 5 días después del
cultivo en placa inicial en medio DMEM (alta concentración de
glucosa) que contiene suero bovino fetal al 10%, extracto de embrión
de pollo al 5% y antibióticos, a 37ºC. Las células se recogen por
digestión con tripsina/EDTA antes de la
diferenciación/implante.
Las células se usan inmediatamente en pacientes
con trastornos hematopoyéticos, por ejemplo después de una dosis
alta de quimioterapia, o se crioconservan para el uso futuro en el
caso de una necesidad médica aguda de ese paciente o un receptor
histocompatible. Las células del estroma se infunden en el receptor
como transplante autólogo o alógeno, después de algún suceso tal
como quimioterapia o irradiación que comprometa gravemente la
función de la médula ósea y la competencia inmunitaria. Las células
madre del estroma se marcan con un marcador fluorescente para
permitir que el médico siga su destino después del transplante. La
prueba de la recuperación acelerada de la médula ósea se sigue
basándose en la detección de células hematopoyéticas recién
sintetizadas (células linfoides, células mieloides, células
eritroides y plaquetas) en el torrente sanguíneo periférico basado
en procedimientos de citometría de flujo.
Ejemplo
2
A. Se aíslan células del estroma de tejido
adiposo humano de acuerdo con los procedimientos descritos antes.
Las células se cultivan como cultivos primarios durante un periodo
de hasta 5 días después del cultivo en placa inicial en un medio
compuesto de, pero no limitado a medio DMEM (alta concentración de
glucosa) que contiene suero bovino fetal al 10%, extracto de
embrión de pollo al 5% y antibióticos, a 37ºC. Las células se
recogen por digestión con tripsina/EDTA antes de la
diferenciación/implante.
Las células se transplantan al sistema nervioso
central de ratones o ratas inmunodeficientes. Se anestesian ratones
beige/sin sistema inmune o SCID o ratas sin sistema inmune en una
cámara sellada usando halotano al 3% en oxígeno; la anestesia se
mantiene por inyección intramuscular de 6 mg/kg de xilozina y 60
mg/kg de ketamina. Los animales se transfieren a un aparato
esterotáxico en un campo limpio. Se hace una incisión de 2 por 5 mm
en el pericráneo 2 mm lateral al bregma. Se hace un agujero de Burr
en el hueso 3 mm lateral al bregma con un taladro dental. Se
inyectan aproximadamente 10 \mul de suspensión celular (10.000
células por \mul) lentamente a lo largo de un periodo de 30
minutos en el cuerpo estriado a una profundidad de
4-5 mm desde la superficie del cerebro. La herida
se cierra por sutura y se hace el seguimiento de los animales
durante un periodo de hasta 10 semanas. Se lleva a cabo la
eutanasia de los animales por perfusión intercardiaca después de
anestesia profunda con xilozina y ketamina, usando PBS enfriado con
hielo, paraformaldehído tamponado al 3% y después sacarosa al 10%.
Se examina en los cerebros por inmunohistoquímica e hibridación
in situ, la presencia de marcadores de genes humanos
(fragmento Alu) y la expresión de marcadores específicos de linaje
celular. La constatación de la supervivencia, diferenciación y
migración de células humanas se determina por este procedimiento.
Se pueden tener en consideración las modificaciones que usan marcaje
de células con colorantes fluorescentes o ingeniería genética de
las células antes de implantarlas con agentes víricos.
B. Se aíslan las células del estroma de tejido
adiposo humano de un paciente individual para el transplante
autólogo o alógeno a un receptor histocompatible de acuerdo con los
procedimientos descritos antes. Las células se cultivan como
cultivos primarios durante un periodo de hasta 5 días después del
cultivo en placa inicial, en un medio compuesto de, pero no
limitado a medio DMEM (alta concentración de glucosa) que contiene
suero bovino fetal al 10%, extracto de embrión de pollo al 5% y
antibióticos, a 37ºC. Las células se recogen por digestión con
tripsina/EDTA antes de la diferenciación/implante.
Las células del estroma se introducirán en el
sistema nervioso central de un paciente después de un trastorno o
enfermedad del sistema nervioso central potencialmente mortal y/o
debilitante, tal como un accidente cerebrovascular (infarto
cerebral), enfermedad de Parkinson o enfermedad de Alzheimer. Las
células se infunden en el cuerpo estriado de la zona afectada del
cerebro usando un procedimiento neuroquirúrgico. Cuando es posible
se usan procedimientos mínimamente invasivos, guiados por
radiología. Después de la cirugía se hace el seguimiento de la
función cognitiva y metabólica del sistema nervioso central para
documentar las mejoras secundarias al transplante. Se usan células
tratadas por ingeniería genética con genes que codifican enzimas
destinadas a mejorar la función del SNC, tal como enzimas
metabólicas de dopamina en el caso de la enfermedad de Parkinson,
según sea adecuado para los trastornos particulares.
Ejemplo
3
Se aíslan células del estroma de tejido adiposo
humano de un paciente individual para el transplante autólogo o
alógeno a un receptor histocompatible de acuerdo con los
procedimientos descritos antes. Las células se cultivan como
cultivos primarios durante un periodo de hasta 5 días después del
cultivo en placa inicial, en un medio compuesto de, pero no
limitado a medio DMEM (alta concentración de glucosa) con glutamina
1 mM pero sin piruvato, que contiene suero bovino fetal al 10%,
suero de ternero recién nacido al 10%, reservas de nucleósidos,
2-mercaptoetanol 0,1 mM, 1000 unidades/ml de factor
inhibidor de leucemia y antibióticos, a 37ºC.
Las células se recogen por digestión con
tripsina/EDTA antes de la diferenciación/implante. Después las
células se cultivan en placa sobre sustrato plástico de cultivo
tisular recubierto con solución de gelatina estéril al 0,1%. Las
células se recogen durante la etapa de crecimiento rápido por
digestión con tripsina al 25% y EDTA 1 mM y trituración antes de la
diferenciación/implante. Las células se recogen en forma de una
suspensión, con las células individuales y las masas de células
juntas. Las células se ponen en partes alícuotas en discos
bacteriológicos (cultivo no tisular) de 100 mm de diámetro en un
volumen de 10 ml de medio que consiste en DMEM (alta concentración
de glucosa) con glutamina 1 mM pero sin piruvato, que contiene suero
bovino fetal al 10%, suero de ternero recién nacido al 10% y
reservas de nucleósidos (medio de control). Los cultivos celulares
se mantienen durante 2 días, y durante este tiempo se forman
agregados de células; en este momento el medio se sustituye por el
medio de control original. Después de 2 días adicionales en cultivo
(día 4 después del pase), las células se alimentan con medio de
control complementado con ácido retinoico todo trans en
concentraciones entre 10^{-9} M y 10^{-6} M, más
preferiblemente 5 x 10^{-7} M. Las células se mantienen en el
medio complementado con ácido retinoico todo trans el día 6. El día
8 después del pese, las células están listas para la evaluación y
uso en el tratamiento de un modelo de lesión traumática espinal o
del sistema nervioso periférico.
La evaluación in vitro de las células se
lleva a cabo pasando las células del disco de cultivo bacteriológico
a discos de cultivo tisular estándar para proporcionar un sustrato
para la unión. Se deja que las células se adhieran al plástico y se
evalúan basándose en su morfología, de acuerdo con un perfil de
diferenciación neuronal, y en la expresión de proteínas neuronales
asociadas, incluyendo pero sin limitar a
beta-tubulina de clase III, la subunidad M de
neurofilamentos, tirosina-hidroxilasa, subunidades
del receptor de glutamato de las clases GluR1-4 y
GluR6, proteína ácida fibrilar glial, proteína básica de mielina y
factor cerebral 1 (Bain y col. (1995) Develop. Biol.
168:342-357).
La evaluación in vivo de las células se
lleva a cabo por transplante de agregados de células a la siringe
que se forma alrededor de una lesión de la médula espinal torácica
experimentalmente inducida en ratas (McDonald y col. (1999)
Nature Med. 5(12):1410-1412). El
modelo de lesión de médula espinal torácica (vértebras torácicas
9-10) se crea en ratas Long-Evans
usando una varilla de 10 gramos de 2,5 mm de diámetro que baja 25
mm. El noveno día después de la lesión, se transplantan agregados de
células del estroma derivadas de tejido adiposo (aproximadamente
10^{-6} células) por inyección usando un sistema de inyección
microestereotáxico en la siringe de la lesión de la médula espinal
torácica. Se inyectan controles de funcionamiento simulado con un
volumen equivalente de medio solo (sin células). Empezando el día
del transplante, las ratas reciben ciclosporina diariamente (10
mg/kg) para prevenir el rechazo. Se evalúa la función motora de las
extremidades posteriores basándose en la escala de clasificación
locomotora de
Basso-Beattie-Breesnahan en las
ratas, a lo largo de un periodo de 6 semanas después del
transplante, para permitir la comparación funcional de la
recuperación entre las células del estroma transplantadas y los
controles de funcionamiento simulado. En la finalización del
estudio (6 semanas), los animales se sacrifican y se examina
histológicamente en los tejidos la constatación de la detección de
células del estroma adiposo humano, basándose en la detección in
situ del ADN Alu humano. La diferenciación celular se
determina por detección de anticuerpos de marcadores específicos de
oligodendrocitos tales como, pero no exclusivamente, producto del
gen de la poliposis familiar cólica APC CC-1,
marcadores específicos de astrocitos tales como, pero no
exclusivamente, proteína ácida fibrilar glial, GFAP y neuronales
tales como, pero no exclusivamente, proteína nuclear específica de
neurona, NeuN. La localización conjunta del ADN Alu y
marcadores específicos de diferenciación se considera una prueba de
la diferenciación de células del estroma.
Se ensaya en las células del estroma derivadas
de tejido adiposo humano la diferenciación neuronal basándose en
ensayos in vitro. Las células del estroma derivadas de tejido
adiposo humano se cultivan en concentraciones de 8.000
células/cm^{2} durante 24 horas en DMEM complementado con suero
bovino fetal al 20% y antibióticos. Las células después se tratan
con antioxidantes tales como BHA en concentraciones 20 \muM a 200
\muM en DMEM con suero bovino fetal al 0%, durante periodos de 5
horas a 5 días. Las células se fijan y se examina la expresión de
la diferenciación neuronal por (a) criterios morfológicos; (b)
criterios inmunohistoquímicos, inmunofluorescentes o de la
citometría de flujo; (c) criterios de inmunotransferencia; y/o (d)
reacción en cadena de la polimerasa o análisis de transferencia
northern de ARNm seleccionados. Se evalúa en las células la
expresión de un subconjunto de los siguientes marcadores neuronales:
NeuN, NF-M, NSE, nestina y trkA usando anticuerpos
o reactivos oligonucleótidos. Los criterios morfológicos de
diferenciación incluyen la formación de un cuerpo celular
multipolar contraído con extensiones celulares membranosas de tipo
proyecciones que llevan a extensiones terminales de tipo cono de
crecimiento y filopodios, la capacidad de dichas células para
generar y mantener un potencial de acción acorde con la transmisión
neuronal de señal, y la
capacidad de expresar receptores y sistemas de absorción para neurotransmisores conocidos, tales como el glutamato.
capacidad de expresar receptores y sistemas de absorción para neurotransmisores conocidos, tales como el glutamato.
Ejemplo
4
A. Se aíslan células del estroma de tejido
adiposo humano de acuerdo con los procedimientos descritos en
"Methods and Composition for the Differentiation of Human
Preadipocytes into Adipocytes" solicitud de patente de
EE.UU. número de serie 09/240.029, presentada el 29 de enero, 1999,
y usando las modificaciones listadas antes. Las células se cultivan
como cultivos primarios durante un periodo de hasta 5 días después
del cultivo en placa inicial, en un medio compuesto de, pero no
limitado a medio DMEM (alta concentración de glucosa) que contiene
suero bovino fetal al 10%, extracto de embrión de pollo al 5% y
antibióticos, a 37ºC. Las células se recogerán por digestión con
tripsina/EDTA antes de la diferenciación/implante.
Las células del estroma derivadas de tejido
adiposo se transplantan a ratones sin sistema inmune
inmunodeficientes que portan un transgén para el gen de fusión de
activador de plasminógeno de tipo
uroquinasa-proteína urinaria principal de ratón
[Weglarz TC, Degen JL, Sandgren EP 2000 Hepatocyte
transplantation into diseased mouse liver: kinetics of parenchymal
repopulation and identification of the proliferative capacity of
tetraploid and octaploid hepatocytes. Am. J. Pathol.
157: 1963-1974]. Estos animales presentan una
degeneración progresiva del hígado. Las células del estroma se
introducen en el modelo animal por transplante en el bazo, por vía
intraperitoneal y/o infusión intravenosa. Los animales
representativos del control o de los grupos experimentales se
sacrifican a intervalos en el transcurso de 4 meses. La constatación
de la regeneración del hígado se evaluará basándose en análisis
histológicos y biológicos moleculares del tejido hepático. Los
procedimientos inmunohistoquímicos y biológicos moleculares (tinción
de Alu) documentarán la presencia de células humanas en el hígado
regenerado.
B. Se aislarán células del estroma de tejido
adiposo humano de un paciente individual para el transplante
autólogo o alógeno a un receptor histocompatible de acuerdo con los
procedimientos descritos en "Methods and Composition for the
Differentiation of Human Preadipocytes into Adipocytes"
solicitud de patente de EE.UU. número de serie 09/240.029,
presentada el 29 de enero, 1999, y usando las modificaciones
listadas antes. Las células se cultivan como cultivos primarios
durante un periodo de hasta 5 días después del cultivo en placa
inicial en un medio compuesto de, pero no limitado a medio DMEM
(alta concentración de glucosa) que contiene suero bovino fetal al
10%, extracto de embrión de pollo al 5% y antibióticos, a 37ºC. Las
células se recogerán por digestión con tripsina/EDTA antes de la
diferenciación/implante.
Las células del estroma se introducirán en el
bazo, la circulación y/o el peritoneo de un paciente que padece
enfermedades hepáticas degenerativas de cualquier origen,
secundarias a infección vírica, ingestión de toxinas o errores
metabólicos congénitos. Cuando sea posible, se usarán procedimientos
mínimamente invasivos, guiados por radiología, para implantar las
células. Se usarán células preparadas por ingeniería genética con
genes que codifican enzimas diseñadas para mejorar la función
hepática, según sea adecuado para los trastornos particulares.
Claims (3)
1. Un procedimiento in vitro para
diferenciar una célula del estroma aislada derivada de tejido
adiposo en una célula que tiene las propiedades de una célula
neuronal, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicha
célula del estroma con un antioxidante, induciendo así la
diferenciación de dicha célula del estroma en una célula neuronal
in vitro.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicha célula del estroma aislada derivada de tejido adiposo
es una célula humana.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho antioxidante se selecciona del grupo que consiste en
2-mercaptoetanol e hidroxianisol butilado.
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